張會(huì)勇 蔡亞麗 張青苗 張孟丹 胡嘯 井長(zhǎng)勤

（新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院 河南新鄉(xiāng) 453003）

綠色熒光蛋白的原核表達(dá)純化用于基因工程大實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)

張會(huì)勇 蔡亞麗 張青苗 張孟丹 胡嘯 井長(zhǎng)勤

（新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院 河南新鄉(xiāng) 453003）

目的 通過設(shè)計(jì)基因工程實(shí)驗(yàn)為一綜合性探究實(shí)驗(yàn)，使學(xué)生全面掌握并提升基因工程相關(guān)實(shí)驗(yàn)技能。方法 借助于綠色熒光蛋白的原核表達(dá)及純化實(shí)驗(yàn)，使學(xué)生掌握了基因的克隆與表達(dá)、以及蛋白純化等綜合實(shí)驗(yàn)性技術(shù)方法。結(jié)果 將以前支離破碎的一個(gè)個(gè)單個(gè)實(shí)驗(yàn)環(huán)環(huán)相扣成為一個(gè)整體，最終學(xué)生可獲得一個(gè)肉眼可見的基因工程產(chǎn)物即綠色熒光蛋白。結(jié)論 通過基因工程實(shí)驗(yàn)的改革提高了學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣，得到了良好的學(xué)習(xí)效果。

基因工程實(shí)驗(yàn) 綠色熒光蛋白 原核表達(dá)

如今分子生物學(xué)已成為生命科學(xué)的通用語言,因此誕生于分子生物學(xué)的基因工程實(shí)驗(yàn)技術(shù)也被列為生命科學(xué)相關(guān)專業(yè)的主干課程［1-2］,所以掌握基因工程相關(guān)技術(shù)已成為生命科學(xué)相關(guān)專業(yè)人才的必備技能［3］。新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院為生物技術(shù)及生物工程專業(yè)已開設(shè)基因工程實(shí)驗(yàn)10年左右,基本內(nèi)容包括電泳技術(shù)［瓊脂糖凝膠與聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE）］,聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction,PCR）技術(shù)、質(zhì)粒提取、感受態(tài)制備、質(zhì)粒轉(zhuǎn)化及蛋白印跡（western blotting）等技術(shù)。雖然開設(shè)內(nèi)容也達(dá)到了培養(yǎng)生物技術(shù)及工程相關(guān)人才的基本要求,但相關(guān)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容連貫不強(qiáng),加上分子水平操作的枯燥及目標(biāo)產(chǎn)物不可見性,導(dǎo)致學(xué)生雖然實(shí)驗(yàn)之初興趣頗高,實(shí)驗(yàn)最后卻不能有效將相關(guān)實(shí)驗(yàn)銜接,最終導(dǎo)致最終興趣缺乏,達(dá)不到設(shè)想的教學(xué)效果。所以有必要對(duì)相關(guān)課程實(shí)驗(yàn)進(jìn)行改革、重置為綜合性實(shí)驗(yàn),用一個(gè)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容將上述技術(shù)串聯(lián)起來。

綠色熒光蛋白（green fluorescent protein,GFP）首先在1962年由Shimomura等首先從多管水母中分離［4］,已證實(shí)可在大腸桿菌中表達(dá)出活性的GFP［5-6］,日光下菌體呈綠色［5］,且其表達(dá)純化步驟較為簡(jiǎn)單［6］。所以作者設(shè)計(jì)GFP的原核表達(dá)及純化為一個(gè)綜合性實(shí)驗(yàn),通過將GFP基因克隆、酶切、連接、轉(zhuǎn)化以及篩選、表達(dá)及純化等,使學(xué)生通過綜合性實(shí)驗(yàn)獲得了一個(gè)基因工程的可見產(chǎn)物,極大提高了學(xué)生的實(shí)驗(yàn)興趣及成就感?，F(xiàn)將實(shí)驗(yàn)的詳細(xì)方案報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

Pfu酶、PCR產(chǎn)物液體回收試劑盒購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司；限制性內(nèi)切酶Nco I、BamH I與DNA連接酶購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；BspH I酶購(gòu)自美國(guó)NEB公司；引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成；BL-21,pcDNA3.1-GFP由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 方法

1.2.1 GFP原核表達(dá)重組子的構(gòu)建 引物設(shè)計(jì)：因?yàn)镚FP序列（GenBank： AB594822.1）中含有Nco I序列,在設(shè)計(jì)上游引物時(shí)用了Nco I的同尾酶BspH I,然后用Oligo6軟件設(shè)計(jì)了它的表達(dá)引物并預(yù)測(cè)了其退火溫度。引物序列如下：GFP上游引物：5-GCGTCATGA（BspHI）CTAGCAAAGGAGAAGA-3；GFP 下游引物：5-GCGCGGATCC（BamHI）TCAGTTGTACAGTTCATCCATGCCA-3。首先以引物GFP 上游引物與GFP 下游引物組合,以真核生物表達(dá)載體pcDNA3.1-GFP為模板, PCR擴(kuò)增GFP的開放閱讀框即 （open reading frame,ORF）,擴(kuò)增條件如下：94℃預(yù)變性5 min后,94℃1 min,51℃1 min,72℃1 min, 30個(gè)循環(huán),72℃終延伸10 min,反應(yīng)體系為100 μL,液體回收純化PCR產(chǎn)物洗脫至50μL,并進(jìn)行定量,濃度約0.15 g·L-1。然后分別用20U的BamHI和BspHI限制性內(nèi)切酶對(duì)2μg回收PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切、純化,對(duì)PET28a（1.5mL菌液經(jīng)質(zhì)粒提取試劑盒（小量）進(jìn)行提取,最后用50μL洗脫液洗脫可獲得約1μg質(zhì)粒）用BamH I與Nco I進(jìn)行雙酶切、然后液體回收酶切產(chǎn)物；計(jì)算酶切載體與回收片段的摩爾比。按照載體片段1：10（0.3：0.03pmol）的比例進(jìn)行T4 DNA連接酶16℃連接1 h,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細(xì)菌,涂布于表面涂有為20%（W/V）的乳糖（Luria-Bertani,LB）固體培養(yǎng)基（50 mg·L-1卡那霉素）37℃培養(yǎng)過夜；挑取變綠的陽性克隆, 擴(kuò)大培養(yǎng)。

圖1 GFP PCR產(chǎn)物的擴(kuò)增

圖2 陽性克隆的篩選

1.2.2 GFP蛋白的表達(dá)與純化 將篩選平板上變綠的陽性克隆接種于5mL試管中（含50 mg·L-1卡那霉素）,培養(yǎng)過夜,然后轉(zhuǎn)接于250mL LB培養(yǎng)基1L搖瓶中,200 r·min-1培養(yǎng)5 h后,加入濃度為20%的乳糖至終濃度為2%,繼續(xù)培養(yǎng)6～8 h,至肉眼可見菌體變綠,6 000r·min-1×5 min收集菌體。GFP的純化參閱文獻(xiàn)［6］；提純GFP蛋白用SDS-PAGE鑒定蛋白純度。

圖3 GFP蛋白SDS-PAGE電泳圖

2 結(jié)果

2.1 PCR結(jié)果結(jié)果見圖1。由圖1可以看出,PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分子量為750 bp附近,與預(yù)期相符,條帶單一可以進(jìn)行下一步酶切實(shí)驗(yàn)。

1：marker；2：GFPPCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

2.2 陽性克隆的篩選 結(jié)果見圖2。由圖2可見,LB平板上綠色克隆均為陽性克隆,因乳糖誘導(dǎo)GFP表達(dá)而使陽性克隆在平板上變?yōu)榫G色。

2.3 GFP蛋白的純化結(jié)果 結(jié)果見圖3。由圖3可以看出,誘導(dǎo)菌體蛋白（泳道2）相對(duì)于未誘導(dǎo)對(duì)照菌體蛋白（泳道1）,已成功誘導(dǎo)出目的蛋白,且誘導(dǎo)菌體蛋白經(jīng)硫酸銨沉淀及萃取等步驟后,可獲得電泳級(jí)的純化GFP（泳道4）。

1：蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；；2：BL21-pET28a菌株表達(dá)的蛋白； 3：BL21-pET28a-GFP 菌株誘導(dǎo)表達(dá)蛋白； 4：GFP純化蛋白。

3 討論

本文首先規(guī)范化了GFP的原核表達(dá)實(shí)驗(yàn)及純化步驟,使之成為一個(gè)學(xué)生可操作的實(shí)驗(yàn)。

由GFP原核表達(dá)的綜合性實(shí)驗(yàn)步驟我們可以看出,通過實(shí)驗(yàn)操作使學(xué)生掌握了載體的構(gòu)建、轉(zhuǎn)化、篩選、表達(dá)與蛋白純化等技術(shù),不但使學(xué)生掌握了基因工程核心要素“目的基因克隆、酶切、連接、轉(zhuǎn)化及篩選”等上游過程,同時(shí)也使學(xué)生熟悉了蛋白純化部分基因工程下游技術(shù)。在此過程中同學(xué)們也學(xué)會(huì)了質(zhì)粒提取、DNA瓊脂糖凝膠電泳與SDS-PAGE蛋白電泳技術(shù)以及蛋白表達(dá)和純化等實(shí)驗(yàn)技術(shù)。將以前支離破碎的一個(gè)個(gè)單個(gè)實(shí)驗(yàn)環(huán)環(huán)相扣成為一個(gè)整體。

另外,GFP是從水母中首先克隆出來的基因,能夠通過原核表達(dá)獲得其活性產(chǎn)物,使學(xué)生更直觀的認(rèn)識(shí)到了基因工程可以跨越物種障礙,感受到基因工程的魅力。

GFP表達(dá)產(chǎn)物在日光下為肉眼可見的綠色,我們?cè)诤Y選的卡那霉素抗性LB平板上涂了20%的半乳糖溶液,可直接通過綠色熒光蛋白的表達(dá)使陽性克隆變成綠色（圖2）,陽性與非陽性克隆一眼就能識(shí)別,并且肉眼可見的陽性克隆不存在假陽性問題,無需再用PCR及測(cè)序進(jìn)行再次驗(yàn)證。

第三,GFP蛋白的純化步驟相對(duì)簡(jiǎn)單,僅需用硫酸銨及乙醇沉淀與萃取步驟即可得到電泳級(jí)的蛋白（圖3）,可使學(xué)生了解蛋白的純化一些基本技術(shù)。

本文通過設(shè)計(jì)GFP蛋白的原核表達(dá)及純化實(shí)驗(yàn)為基因工程綜合實(shí)驗(yàn),改革了以前通過一個(gè)個(gè)單一實(shí)驗(yàn)使學(xué)生逐項(xiàng)掌握單個(gè)技術(shù)為目的,變?yōu)槭箤W(xué)生通過一個(gè)綜合大實(shí)驗(yàn),將逐個(gè)單一技術(shù)通過一個(gè)綜合實(shí)驗(yàn)串聯(lián)起來,成為一個(gè)有機(jī)整體。通過此次實(shí)驗(yàn),學(xué)生可獲得一個(gè)肉眼可見的基因工程產(chǎn)物即綠色熒光蛋白,所以此次基因工程實(shí)驗(yàn)的改革提高了學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣,得到了良好的學(xué)習(xí)效果。

［1］邢萬金，扈延茂.本科基因工程大實(shí)驗(yàn)教學(xué)改革的實(shí)踐和體會(huì)［J］.生物學(xué)通報(bào)，2007，42（2）：48-50.

［2］陳魯勇，孟和，許文平，等.分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)改革與實(shí)踐［J］. 實(shí)驗(yàn)室研究與探索，2008，27（12）：121-122.

［3］王文鋒，范雪暉，穆靈敏，等.生物技術(shù)專業(yè)基因工程實(shí)驗(yàn)教學(xué)的改進(jìn)與實(shí)踐［J］.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2009，01：99-100.

［4］Shimomura，O.，F(xiàn).H.Johnson，and Y.Saiga.Extraction， purification and properties of aequorin，a bioluminescent protein from the luminous hydromedusan，Aequorea［J］.J Cell Comp Physiol，1962，59：223～239.

［5］張會(huì)勇，魯勇，孟雨菡，等.VEGF183（132-158）肽段作為蛋白緩釋藥物載體的細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)合研究［J］.藥物生物技術(shù)，2010，03：198-202.

［6］Yakh nin AV，Vin ok urov LM， Su rin AK，et al . Green fluorescent protein purification by organic extraction ［J］.Protein Expr Purif，1998，14：382-386.

Q-4

A

1674-2060（2016）03-0001-02

2014年度河南省高等教育教學(xué)改革省級(jí)重點(diǎn)研究項(xiàng)目（編號(hào)：2014SJGLX050）

張會(huì)勇（1976—），男，漢族，博士，副教授，主要從事肽類藥物及腫瘤疫苗研究。