劉曉暉，李雙月，劉琦，樸豐源，邵靜，李亞晨，薛鵬

大連醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，大連116044

三鄰甲苯磷酸酯對大鼠C6星形膠質(zhì)細(xì)胞的氧化損傷和細(xì)胞周期阻滯作用

劉曉暉，李雙月，劉琦，樸豐源，邵靜，李亞晨*，薛鵬

大連醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，大連116044

三鄰甲苯磷酸酯(tri-o-cresyl phosphate,TOCP)是一種有機磷酸酯類化合物，具神經(jīng)毒性作用。研究表明星形膠質(zhì)細(xì)胞是有機磷化合物(organophosphorus compounds,OPs)神經(jīng)毒性作用的靶點之一。為了探討TOCP對星形膠質(zhì)細(xì)胞的毒性作用，采用大鼠C6星形膠質(zhì)細(xì)胞分別經(jīng)0.1、0.3、1.0和3.0 mmol·L-1TOCP染毒處理24 h，應(yīng)用MTT比色法和乳酸脫氫酶(LDH)活力分析法檢測細(xì)胞活力，在電子相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，二硫代二硝基苯甲酸(DNTB)比色法測定谷胱甘肽(GSH)含量和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性，流式細(xì)胞儀檢測分析細(xì)胞周期。結(jié)果顯示，經(jīng)TOCP處理24 h后，大鼠C6星形膠質(zhì)細(xì)胞存活率降低，LDH釋放增加，細(xì)胞形態(tài)也發(fā)生了明顯的變化。GSH含量和GSH-Px活性降低，G1期細(xì)胞數(shù)量也逐漸增加。上述結(jié)果表明，TOCP對星形膠質(zhì)細(xì)胞具有毒性作用，引起氧化損傷和細(xì)胞周期阻滯。

三鄰甲苯磷酸酯；大鼠；星形膠質(zhì)細(xì)胞；細(xì)胞毒性；氧化應(yīng)激；細(xì)胞周期阻滯

劉曉暉,李雙月,劉琦,等.三鄰甲苯磷酸酯對大鼠C6星形膠質(zhì)細(xì)胞的氧化損傷和細(xì)胞周期阻滯作用[J].生態(tài)毒理學(xué)報，2016,11(3):151-156

Liu X H,Li S Y,Liu Q,et al.Oxidative damage and cell cycle arrest in rat C6 astroglial cells induced by tri-ortho-cresyl phosphate[J].Asian Journal of Ecotoxicology,2016,11(3):151-156(in Chinese)

磷酸三甲苯酯(tricresyl phosphate,TCP)是一種有機磷酸酯類化合物。由于其具有化學(xué)和熱穩(wěn)定性，工業(yè)上常作為增塑劑、軟化劑、阻燃劑和機油添加劑等廣泛使用[1-2]。三鄰甲苯磷酸酯(tri-o-cresyl phosphate,TOCP)是TCP三個同分異構(gòu)體(間位、鄰位和對位)中的鄰位異構(gòu)體，具神經(jīng)毒性、生殖毒性和免疫毒性，主要引起遲發(fā)性中毒性神經(jīng)病(organophosphate-induced delayed neuropathy,OPIDN)[3]。因此，多年來有關(guān)TOCP神經(jīng)毒性作用的研究大多集中在神經(jīng)元上，并圍繞TOCP誘導(dǎo)OPIDN的機制展開[4-5]。

星形膠質(zhì)細(xì)胞，是哺乳動物腦內(nèi)分布最廣、數(shù)量最多的一類細(xì)胞，在腦內(nèi)被認(rèn)為僅起支持和營養(yǎng)等保護(hù)功能。隨著對星形膠質(zhì)細(xì)胞研究的不斷深入，人們逐漸認(rèn)識到星形膠質(zhì)細(xì)胞還在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、突觸傳遞、神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定和新陳代謝等中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)多種生理活動中，以及神經(jīng)組織的修復(fù)與再生、神經(jīng)免疫和多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的病理機制中都起著十分重要的作用[6-8]。

近年來研究表明，星形膠質(zhì)細(xì)胞是許多有機磷化合物神經(jīng)毒性作用的直接靶標(biāo)。Guizzetti等[9]報道了有機磷農(nóng)藥毒死蜱等及其氧化代謝產(chǎn)物以濃度依賴的方式抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞的增殖。Garcia等[10]通過體外研究也發(fā)現(xiàn)，毒死蜱能夠抑制C6膠質(zhì)細(xì)胞的復(fù)制、分化及誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，并且證實有機磷還干擾神經(jīng)膠質(zhì)的發(fā)育模式。Pizzurro等[11]等報道，二嗪農(nóng)及其分解產(chǎn)物異丙嘧磷(diazoxon)增加星形膠質(zhì)細(xì)胞氧化損傷，降低星形膠質(zhì)細(xì)胞促海馬神經(jīng)元突觸生長的能力。有關(guān)TOCP對星形膠質(zhì)細(xì)胞毒性作用尚未見報道。本研究就TOCP對星形膠質(zhì)細(xì)胞的毒性作用進(jìn)行初步研究，以期發(fā)現(xiàn)TOCP神經(jīng)毒性作用的新靶標(biāo)。

1 材料與方法（Materials and methods）

1.1 實驗材料

大鼠C6星形膠質(zhì)細(xì)胞購于中科院上海細(xì)胞所細(xì)胞庫。TOCP(純度>99%)購自日本Kanto化學(xué)有限公司；MTT購自Sigma公司；胎牛血清(FBS)購自杭州四季青公司；DMEM培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司；青霉素、鏈霉素、LDH、GSH和GSH-Px檢測試劑盒及細(xì)胞周期檢測試劑盒購自杭州碧云天生物技術(shù)研究所；其他試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。

CO2培養(yǎng)箱和354型多功能酶標(biāo)儀購自美國Thermo公司；F-2700型熒光分光光度計購自日本Hitachi公司；FACSAria II流式細(xì)胞儀購自美國Becton Dickinson公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與處理

細(xì)胞在含有10%胎牛血清、100 U·mL-1的青霉素和100 mg·mL-1鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實驗，實驗分組為0.1、0.3、1.0和3.0 mmol·L-1TOCP染毒組及對照組。

1.2.2 MTT比色法檢測細(xì)胞存活率

選取狀態(tài)良好的對數(shù)期細(xì)胞，用0.25%的胰蛋白酶消化制成單細(xì)胞懸液并計數(shù)。調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105cell·mL-1接種于96孔板中，每孔0.1 mL，24 h后進(jìn)行染毒處理，每個濃度設(shè)6個平行孔。染毒24 h后，每孔加入10 μL的MTT(濃度為5 mg·mL-1)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，棄上清液，加入二甲亞砜100 μL，振蕩20 min，使紫色結(jié)晶完全溶解，用酶標(biāo)儀在570 nm處測定OD值。細(xì)胞存活率(%)=(OD實驗組-OD本底對照)/(OD對照組-OD本底對照)×100%。

1.2.3 LDH漏出率檢測

細(xì)胞以1×106cell·mL-1的密度接種在24孔板中。24 h后，加入不同濃度的TOCP染毒處理24 h，然后分別收集細(xì)胞和培養(yǎng)液，按照LDH檢測試劑盒說明書測定胞內(nèi)和胞外乳酸脫氫酶活力。細(xì)胞LDH漏出率(%)=(OD胞外-OD對照)/[(OD胞內(nèi)-OD對照) +(OD胞外-OD對照)]×100%。

1.2.4 細(xì)胞形態(tài)的觀察

細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變在倒置相差顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.5 GSH含量和GSH-Px活性檢測

C6細(xì)胞以1×106cell·mL-1的密度接種在6孔板中。24 h后，加入不同濃度的TOCP染毒處理24 h，然后分別收集細(xì)胞。細(xì)胞用冷PBS洗2次后勻漿，在4℃、1 000 g離心10 min，取上清液用于測定GSH-Px活性和GSH含量。蛋白含量采用考馬斯亮藍(lán)法測定，用牛血清白蛋白作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.6 細(xì)胞周期分析

C6細(xì)胞以1×106cell·mL-1的密度接種在60 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中。24 h后，加入不同濃度的TOCP染毒處理24 h，然后1 000 g下離心5 min。收集細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗細(xì)胞2次，再加入預(yù)冷的70%乙醇中，4℃過夜固定。1 000 g下離心5 min，收集細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗細(xì)胞2次，加入0.5 mL碘化丙啶染色液(按試劑盒說明書配制)重懸細(xì)胞沉淀，37℃下避光溫浴30 min，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測與分析。

1.2.7 統(tǒng)計分析方法

用SPSS 13.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(standard deviation,SD)，組間比較采用單因素方差分析，實驗組與對照組比較采用LSD檢驗，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果（Results）

2.1 細(xì)胞存活率檢測結(jié)果

與對照組相比，暴露于0.1、0.3、1.0和3.0 mmol· L-1TOCP的大鼠C6星形膠質(zhì)細(xì)胞存活率以劑量依賴的方式降低，細(xì)胞存活率分別為：89.84%±4.9%，75.11%±4.0%，57.46%±3.9%，42.02%±5.2%(圖1)。

2.2 細(xì)胞LDH漏出率檢測結(jié)果

TOCP染毒增加LDH漏出率，并且隨著染毒劑量的增加LDH漏出率顯著增加。0.1、0.3、1.0和3.0 mmol·L-1TOCP暴露，大鼠C6星形膠質(zhì)細(xì)胞LDH漏出率分別為：112.13%±7.3%、131.96%±4.7%，163.18%±5.2%和189.22±7.8%(圖2)。

2.3 細(xì)胞形態(tài)特征

倒置相差顯微鏡下可見，正常組細(xì)胞為梭形，大小、形態(tài)基本相同，具有清晰的輪廓。TOCP染毒后，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生很大的變化。隨著TOCP濃度的增加，異型細(xì)胞增多，細(xì)胞胞體明顯皺縮，細(xì)胞核凝集，有的細(xì)胞膜破裂，甚至有的細(xì)胞破碎(圖3)。隨著TOCP濃度的增加，細(xì)胞數(shù)量也見明顯減少(圖3)。

圖1 三鄰甲苯磷酸酯（TOCP）對大鼠C6星形膠質(zhì)細(xì)胞存活率的影響

圖2 TOCP對大鼠C6星形膠質(zhì)細(xì)胞LDH漏出率的影響

圖3 TOCP對大鼠C6星形膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)的影響

圖4 TOCP對大鼠C6星形膠質(zhì)細(xì)胞GSH含量的影響

圖5 TOCP對大鼠C6星形膠質(zhì)細(xì)胞GSH-Px活性的影響

2.4 GSH含量和GSH-Px活性檢測結(jié)果

0.1、0.3、1.0和3.0 mmol·L-1TOCP暴露，破壞大鼠C6星形膠質(zhì)細(xì)胞抗氧化系統(tǒng)，使GSH含量和GSH-Px活性降低。但0.1 mmol·L-1TOCP暴露使GSH含量和GSH-Px活性降低與對照組相比較沒有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.5 細(xì)胞周期檢測結(jié)果

細(xì)胞周期檢測結(jié)果顯示，與對照相比較，暴露0.1、0.3、1.0和3.0 mmol·L-1TOCP大鼠C6星形膠質(zhì)細(xì)胞G1細(xì)胞數(shù)量以劑量依賴的方式增加。

3 討論（Discussion）

眾所周知，TOCP具神經(jīng)毒性作用，OPIDN是TOCP神經(jīng)毒性作用最主要的癥狀，因此，過去的研究主要集中在TOCP誘發(fā)的遲發(fā)性神經(jīng)毒性上。然而，近來研究顯示，星形膠質(zhì)細(xì)胞也是某些有機磷化合物神經(jīng)毒性作用的靶點[9-11]。Guizzetti等[9]用胎鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞和人星形膠質(zhì)瘤細(xì)胞系研究有機磷農(nóng)藥毒死蜱、二嗪農(nóng)、對硫磷及其氧化代謝產(chǎn)物對細(xì)胞增殖的影響，臺盼藍(lán)染色結(jié)果顯示，有機磷農(nóng)藥及其氧化代謝物具明顯的細(xì)胞毒性。本研究應(yīng)用MTT比色法和LDH活力分析法檢測細(xì)胞活力，發(fā)現(xiàn)TOCP明顯降低大鼠C6星形膠質(zhì)細(xì)胞的生存率，并增加LDH漏出。TOCP染毒后，細(xì)胞形態(tài)也發(fā)生很大的變化，異型細(xì)胞增多，細(xì)胞胞體明顯皺縮，細(xì)胞核凝集，有的細(xì)胞膜破裂，甚至有的細(xì)胞破碎。這些實驗結(jié)果表明，TOCP對星形膠質(zhì)細(xì)胞具有毒性作用。

氧化應(yīng)激是引起細(xì)胞死亡的主要原因之一[12-13]。許多外源化學(xué)物進(jìn)入機體后可以產(chǎn)生氧自由基引起氧化損傷。龍鼎新等[14]報道了TOCP暴露使人成神經(jīng)瘤細(xì)胞SH-SY5Y的細(xì)胞丙二醛(MDA)的含量增高，過氧化氫酶(CAT)含量降低。Zhang等[15]研究發(fā)現(xiàn)，TOCP使雞神經(jīng)組織脂質(zhì)過氧化水平升高，并降低超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、GSH-Px等抗氧化酶的活性，減少GSH含量。GSH和GSH-Px是生物體內(nèi)重要的抗氧化物和抗氧化酶，在保護(hù)機體免受氧化應(yīng)激和清除自由基的過程中起重要作用。GSH-Px能催化多種過氧化物生成H2O和O2。GSH可直接清除自由基，還可通過與其他抗氧化劑相互作用，促進(jìn)其再生和再循環(huán)，其在調(diào)節(jié)細(xì)胞氧化還原穩(wěn)態(tài)具有重要作用。因此，GSH含量和GSH-Px活性的改變可間接反映出細(xì)胞抗氧化防御系統(tǒng)的狀態(tài)。星形膠質(zhì)細(xì)胞是大腦重要的抗氧化防御系統(tǒng)，GSH含量和GSHPx活性很高[16-17]。本研究調(diào)查了TOCP對大鼠C6星形膠質(zhì)細(xì)胞GSH含量和GSH-Px活性的影響，結(jié)果顯示，TOCP暴露降低細(xì)胞GSH含量和GSH-Px活性，這一結(jié)果提示，TOCP可以引起星形膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)抗氧化能力減弱，使細(xì)胞易受到自由基等的損傷。TOCP對星形膠質(zhì)細(xì)胞活力的影響可能與其對細(xì)胞的氧化損傷有關(guān)。

圖6 TOCP對大鼠C6星形膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞周期的影響

Long和Wu[18]報道了TOCP抑制人成神經(jīng)瘤細(xì)胞SH-SY5Y生長，誘導(dǎo)G1期細(xì)胞周期阻滯。Guizzetti等[9]也發(fā)現(xiàn)有機磷農(nóng)藥毒死蜱等及其氧化代謝產(chǎn)物對星形膠質(zhì)細(xì)胞毒性作用部分歸因于抑制[3H]胸苷的摻入，抑制DNA合成。本研究我們發(fā)現(xiàn)，大鼠C6星形膠質(zhì)細(xì)胞經(jīng)TOCP染毒處理后，G1期細(xì)胞數(shù)量隨TOCP濃度增加而增加。

神經(jīng)元生存在一個復(fù)雜的微環(huán)境中，星形膠質(zhì)細(xì)胞對神經(jīng)元微環(huán)境具有調(diào)控的能力。它通過合成分泌某些神經(jīng)營養(yǎng)因子和細(xì)胞因子改變神經(jīng)元周圍的微環(huán)境，參與神經(jīng)遞質(zhì)的代謝，穩(wěn)定神經(jīng)遞質(zhì)的穩(wěn)態(tài)，對維持神經(jīng)元的生存、發(fā)育、再生和分化起重要作用。同時，它富含抗氧化物和抗氧化酶，可保護(hù)神經(jīng)元免受氧自由基誘導(dǎo)的損傷。研究表明受到損傷的星形膠質(zhì)細(xì)胞無神經(jīng)營養(yǎng)作用。Pizzurro等[11]等報道，二嗪農(nóng)及其分解產(chǎn)物diazoxon增加星形膠質(zhì)細(xì)胞氧化損傷，降低星形膠質(zhì)細(xì)胞促海馬神經(jīng)元突觸生長的能力。本研究我們發(fā)現(xiàn)TOCP對星形膠質(zhì)細(xì)胞具毒性作用，引起氧化應(yīng)激和細(xì)胞周期阻滯。鑒于星形膠質(zhì)細(xì)胞對神經(jīng)元生存的重要作用，TOCP對星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷在其神經(jīng)毒性中的作用與機制有待進(jìn)一步研究。

（References）：

[1] Craig P H,Barth M L.Evaluation of the hazards of industrial exposure to tricresyl phosphate:A review and interpretation of the literature[J].Journal of Toxicology& Environmental Health Part B Critical Reviews,1999,2(4): 281-300

[2] Winder C,Balouet J C.The toxicity of commercial jet oils[J].Environmental Research,2002,89(2):146-164

[3] Tian Y,Xie X K,Piao F Y,et al.Delayed neuropathy and inhibition of soluble neuropathy target esterase following the administration of organophosphorus compounds to hens[J].Tohoku Journal Experimental Medcine,1998, 185:161-171

[4] Hausherr V,van Thriel C,Krug A,et al.Impairment of glutamate signaling in mouse central nervous system neurons in vitro by tri-ortho-cresyl phosphate at noncytotoxic concentrations[J].Toxicological Sciences,2014,142(1): 274-284

[5] Chen J X,Sun Y J,Wang P,et al.Induction of autophagy by TOCP in differentiated human euroblastoma cells lead to degradation of cytoskeletal components and inhibition of neurite outgrowth[J].Toxicology,2013,310:92-97

[6] Hertz L,Zielke H R.Astrocytic control of glutamatergic activity:Astrocytes as stars of the show[J].Trends Neurosciences,2004,27(12):735-743

[7] Nedergaard M,Ransom B,Goldman S A.New roles for astrocytes:Redefining the functional architecture of the brain[J].Trends Neurosciences,2003,26(10):523-530

[8] Newman E A.New roles for astrocytes:Regulation of synaptic transmission[J].Trends Neurosciences,2003,26 (10):536-542

[9] Guizzetti M,Pathak S,Giordano G,et al.Effect of organophosphorus insecticides and their metabolites on astroglial cell proliferation[J].Toxicology,2005,215(3):182-190

[10] Garcia S J,Seidler F J,Crumpton T L,et al.Does the developmental neurotoxicity of chlorpyrifos involve glial targets?Macromolecule synthesis,adenylyl cyclase signaling,nuclear transcription factors,and formation of reactive oxygen in C6 glioma cells[J].Brain Research,2001, 891(1-2):54-68

[11] Pizzurro D M,Dao K,Costa L G.Diazinon and diazoxon impair the ability of astrocytes to foster neurite outgrowth in primary hippocampal neurons[J].Toxicology and Applied Pharmacology,2014,274(3):372-382

[12] Floyd R A.Antioxidants,oxidative stress,and degenerative neurological disorders[J].Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine,1999,222:236-245

[13] Qiao D,Seidler F J,Slotkin T A.Oxidative mechanisms contributing to the developmental neurotoxicity of nicotine and chlorpyrifos[J].Toxicology and Applied Pharmacology,2005,206(1):17-26

[14] 龍鼎新,伍一軍,蔣偉.TOCP對人成神經(jīng)瘤細(xì)胞SHSY5Y的氧化損傷作用[J].中南醫(yī)學(xué)科學(xué)雜志,2011, 39(3):266-269

Long D X,Wu Y J,Jiang W.Study on the oxidative damage of tri-ortho-cresyl phosphate to SH-SY5Y cells[J]. Journal of Medical Science in Central South China,2011, 39(3):266-269(in Chinese)

[15] Zhang L P,Wang Q S,Guo X,et al.Time-dependent changes of lipid peroxidation and antioxidative status in nerve tissues of hens treated with tri-ortho-cresyl phosphate(TOCP)[J].Toxicology,2007,239(1-2):45-52

[16] Desagher S,Glowinski J,Premont J.Astrocytes protect neurons from hydrogen peroxide toxicity[J].The Journal of Neuroscience,1996,16(8):2553-2562

[17] Dringen R,Gutterer J M,Hirrlinger J.Glutathione metabolism in brain metabolic interaction between astrocytes and neurons in the defense against reactive oxygen species[J].European Journal of Biochemistry,2000,267(16): 4912-4916

[18] Long D X,Wu Y J.Growth inhibition and induction of G1 phase cell cycle arrest in neuroblastoma SH-SY5Y cell by tri-ortho-cresyl phosphate[J].Toxicology Letters, 2008,181(1):47-52◆

Oxidative Damage and Cell Cycle Arrest in Rat C6 Astroglial Cells Induced by Tri-ortho-cresyl Phosphate

Liu Xiaohui,Li Shuangyue,Liu Qi,Piao Fengyuan,Shao Jing,Li Yachen*,Xue Peng

School of Public Health,Dalian Medical University,Dalian 116044,China

15 July 2015 accepted 17 September 2015

Tri-ortho-cresyl phosphate(TOCP),an organophosphorus ester can cause neurotoxicity.Recent studies show that astrocytes are also an important target for many organophosphorus compounds(OPs)neurotoxicity.This study aims to investigate a possible cytotoxic effect of TOCP on astrocytes in vitro.Rat C6 astroglioal cells were exposed to 0,0.1,0.3,1.0 and 3.0 m mmol·L-1TOCP for 24 h.Then cell viability was measured by MTT assay and lactate dehydrogenase(LDH)leakage.The cell morphological change was observed using light microscopy. The content of glutathione(GSH)and the activity of glutathione peroxidase(GSH-Px)were also analyzed by 5,5-dithiobis-2-nitrobenzoic acid(DTNB)chromatometry.Cell cycle progression was determined by flow cytometry. Exposure to TOCP caused decrease in cell viability,increase in LDH leakage,morphology change,decrease in the content of GSH and the activity of GPx and the G1 phase cell cycle arrest.These results suggested that TOCP hascytotoxicity effect and cause oxidative damage and phase cell cycle arrest on astroglial cells.

TOCP;C6 cells;cytotoxicity;oxidative stress;cell cycle arrest

2015-07-15 錄用日期：2015-09-17

1673-5897（2016）3-151-06

X171.5

A

10.7524/AJE.1673-5897.20150715002

簡介：李亞晨(1965—)，女，博士，副教授，主要研究方向為藥理毒理學(xué)。

遼寧省自然科學(xué)基金(2013023054)；大連醫(yī)科大學(xué)本科教學(xué)改革研究項目(DYLX13036)

劉曉暉(1981-)，女，博士，副教授，研究方向為生態(tài)毒理學(xué)，E-mail：liuxh892@126.com；

*通訊作者（Corresponding author），E-mail:liy76@yahoo.com;2461178934@qq.com