徐曉平，席貽龍，黃林

1.安徽師范大學生命科學學院，安徽省皖江城市帶退化生態(tài)系統(tǒng)的恢復與重建協(xié)同創(chuàng)新中心，蕪湖241000

2.安徽工程大學建筑工程學院，蕪湖241000

Cu2+、Zn2+、Cd2+、Cr6+和Mn2+對萼花臂尾輪蟲聯(lián)合急性毒性研究

徐曉平1,2，席貽龍1,*，黃林1

1.安徽師范大學生命科學學院，安徽省皖江城市帶退化生態(tài)系統(tǒng)的恢復與重建協(xié)同創(chuàng)新中心，蕪湖241000

2.安徽工程大學建筑工程學院，蕪湖241000

為探究重金屬復合污染對輪蟲的毒性影響，以萼花臂尾輪蟲為受試動物，選擇Cu2+、Zn2+、Cd2+、Cr6+和Mn2+等5種重金屬，采用水生毒理聯(lián)合效應相加指數(shù)法開展了其24 h聯(lián)合急性毒性作用的評價研究。結果顯示，Cu2+、Zn2+、Cd2+、Cr6+和Mn2+等5種重金屬對萼花臂尾輪蟲24 h半數(shù)致死濃度分別為：0.00616 mg·L-1，12.62 mg·L-1，2.89 mg·L-1，17.29 mg·L-1和67.32 mg ·L-1。聯(lián)合急性毒性實驗結果顯示，等毒性配比的Cu2+-Cr6+(0.00385-10.806 mg·L-1)和等濃度配比的Cu2+-Zn2+(0.0199-0.0199 mg·L-1)、Cu2+-Cd2+(0.0181-0.0181 mg·L-1)、Cu2+-Cr6+(0.0118-0.0118 mg·L-1)、Zn2+-Cd2+(3.475-3.475 mg·L-1)二元聯(lián)合測試液的作用結果顯示為拮抗效應，其余二元聯(lián)合測試液的作用結果則均顯示是協(xié)同效應。等毒性配比的Cu2+-Cr6+-Mn2+(0.00210-5.902-22.981 mg·L-1)和等濃度配比的Cu2+-Cd2+-Mn2+(0.00727-0.00727-0.00727 mg·L-1)三元聯(lián)合測試液的作用結果顯示為拮抗效應，其余三元聯(lián)合測試液的作用結果則均顯示是協(xié)同效應。等濃度配比的Cu2+-Zn2+-Cd2+-Cr6+(0.00907-0.00907-0.00907-0.00907 mg·L-1)、Cu2+-Zn2+-Cd2+-Mn2+(0.00898-0.00898-0.00898-0.00898 mg·L-1)、Cu2+-Zn2+-Cr6+-Mn2+(0.00819-0.00819-0.00819-0.00819 mg·L-1)四元聯(lián)合測試液的作用結果顯示為拮抗效應，其余四元聯(lián)合測試液的作用結果的則均顯示是協(xié)同效應。Cu2+-Zn2+-Cd2+-Cr6+-Mn2+等毒性(0.00074-1.520-0.348-2.082-8.107 mg·L-1)和等濃度(0.00582-0.00582-0.00582-0.00582-0.00582 mg·L-1)配比的五元聯(lián)合測試液作用結果均顯示是協(xié)同效應。

重金屬；萼花臂尾輪蟲；聯(lián)合毒性；急性毒性

徐曉平,席貽龍,黃林.Cu2+、Zn2+、Cd2+、Cr6+和Mn2+對萼花臂尾輪蟲聯(lián)合急性毒性研究[J].生態(tài)毒理學報，2016,11(3):338-347

Xu X P,Xi Y L,Huang L.Combined acute toxicities of Cu2+,Zn2+,Cd2+,Cr6+,and Mn2+to freshwater rotiferBrachionus calyciflorusPallas[J].Asian Journal of Ecotoxicology,2016,11(3):338-347(in Chinese)

目前，我國水體重金屬污染情況仍然較為嚴重，不斷威脅著水生態(tài)系統(tǒng)平衡和人們的生活和健康。2015年7月，國家環(huán)保部公布的《2015年上半年全國環(huán)境質(zhì)量狀況》指出，全國有8個地表水國控斷面(點位)共出現(xiàn)18次重金屬超標現(xiàn)象。重金屬污染很少是由單一金屬污染造成，往往是由多種重金屬聯(lián)合存在引起的復合污染[1-2]。重金屬共存時，其毒性效應與單一金屬具有很大差異[3]，因此，研究多種重金屬共存時的聯(lián)合毒性效應具有更為重要的現(xiàn)實意義。

輪蟲(rotifer)是廣泛分布于各類水體中的一類浮游動物，是浮游動物四大類群之一。雖然輪蟲的個體在所有后生動物中為最小，但其繁殖速率較快，能夠迅速占領環(huán)境中的生態(tài)位，其轉(zhuǎn)換效率極高，在淡水水體生態(tài)系統(tǒng)結構功能、能量傳遞及物質(zhì)轉(zhuǎn)換上具有重要意義[4]。也正是因為如此，由于水體污染導致輪蟲種群的變動也勢必會影響整個水生態(tài)系統(tǒng)的平衡，所以，暴露于不同污染物下輪蟲各生物學參數(shù)的變化引起人們越來越多的關注[5-6]。此外，輪蟲世代時間短、個體小、繁殖快、易培養(yǎng)，是開展生態(tài)毒理學研究的理想受試生物[7]。美國材料與試驗協(xié)會(ASTM)將萼花臂尾輪蟲(Brachionus calyciflorus)和褶皺臂尾輪蟲(B.plicatilis)分別作為淡水和海水的標準測試生物[8]。經(jīng)濟合作與發(fā)展組織(OECD)將輪蟲視作無脊椎動物中進行環(huán)境毒性測試最有前途的分類群[9]。

Cu2+、Zn2+、Cd2+、Cr6+和Mn2+等5種重金屬均屬于常見環(huán)境污染物，在我國工業(yè)廢水排放以及飲用水質(zhì)量標準中都有明確的限值規(guī)定，其中，Cu2+、Zn2+和Mn2+是生物體必需的金屬元素，但過量攝入會導致機體的損傷甚至死亡；Cd2+和Cr6+是非生命必需元素，即是在很低劑量亦會表現(xiàn)出一定的毒性。該5種重金屬或是在地球化學循環(huán)和致毒機理等方面存在很大差異，如Cu2+、Cr6+和Mn2+，或是相伴而生、結構與化學性質(zhì)相似，如Zn2+和Cd2+，因此，常被選作用于開展重金屬聯(lián)合毒性效應的研究[10-12]。目前，關于此類重金屬對輪蟲的毒性影響的報道主要集中在單一毒性[13-15]，聯(lián)合毒性影響鮮有研究。因此，本研究目的之一是豐富輪蟲毒理學的基礎資料，為開展重金屬復合污染對水體生態(tài)系統(tǒng)影響的評價提供科學參考。其次，重金屬復合污染作用機理復雜，影響因素較多，規(guī)律難尋[3]，本研究的目的之二是希望通過設置不同毒物配比方式，評價其對輪蟲的聯(lián)合毒性效應，尋找其作用規(guī)律，以期為重金屬聯(lián)合毒性評價研究積累理論數(shù)據(jù)。為此，本文首先在實驗室條件下開展了該5種重金屬對萼花臂尾輪蟲24 h的單一急性毒性作用研究，在此基礎上，研究了等毒性和等濃度配比的情況下，該5種重金屬中的二元、三元、四元和五元聯(lián)合對萼花臂尾輪蟲24 h聯(lián)合急性毒性，并通過運用“水生毒理聯(lián)合效應相加指數(shù)法”判定了這些聯(lián)合毒性作用效應的類型。

1 材料與方法（Materials and methods）

1.1 輪蟲的來源與培養(yǎng)

實驗所用的萼花臂尾輪蟲采自蕪湖市汀棠湖(119°21'E,31°20'N)，實驗室內(nèi)在(25±1)℃、自然光照條件下進行“克隆”培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為3個月以上；輪蟲培養(yǎng)液采用EPA配方[16]，所用餌料由HB-4培養(yǎng)基[17]培養(yǎng)、處于指數(shù)增長期的斜生柵藻(Scenedesmus obliquus)，離心濃縮后使用。實驗前，將輪蟲置于(25±1)℃、無光照的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)進行1周以上的預培養(yǎng)，培養(yǎng)期間每天投喂密度為2.0×106cell·mL-1的斜生柵藻并更換輪蟲培養(yǎng)液，同時通過去除一部分個體使得輪蟲種群始終處于指數(shù)增長期。

1.2 測試液的配制

實驗所用CuSO4·5H2O(無錫市亞盛化工有限公司生產(chǎn))、ZnSO4·7H2O(無錫市亞盛化工有限公司生產(chǎn))、CdCl2·2.5H2O(國藥集團化學試劑有限公司生產(chǎn))、K2Cr2O7(無錫市展望化工試劑有限公司生產(chǎn))和MnCl2(國藥集團化學試劑有限公司生產(chǎn))均為分析純(≥99%)。實驗前，首先用蒸餾水配制1 000 mg·L-1的母液(均為重金屬離子濃度，Cu2+是100 mg ·L-1)，實驗時，再用EPA培養(yǎng)基將母液稀釋成所需各濃度的測試液。母液中的實際金屬元素濃度經(jīng)由等離子體發(fā)射光譜(ICP-OES,PerkinElmer Optima 2100 DV)測定[18]。所有待用的玻璃器皿實驗前用相應的測試液浸泡24 h，實驗過程中每24 h更換新鮮測試液。

1.3 實驗設計

1.3.1 單一金屬24 h急性毒性實驗

依據(jù)預實驗結果，設置等對數(shù)間距的5組金屬濃度和1組空白對照，具體如下，Cu2+：0.0042、0.0056、0.0075、0.01、0.0135 mg·L-1；Zn2+：7.5、10、13.5、18、24 mg·L-1；Cd2+：1、1.8、3.2、5.6、10 mg·L-1；Cr6+：10、13.5、18、24、32 mg·L-1；Mn2+：32、42、56、 75、100 mg·L-1。每個處理組設置4個重復。實驗開始前，從預培養(yǎng)的試管中隨機挑取若干個帶非混交卵的輪蟲雌體置于含有與預培養(yǎng)相同藻密度培養(yǎng)液的玻璃燒杯中進行培養(yǎng)，12 h后，由各燒杯中隨機吸取10個輪蟲幼體置于含6 mL玻璃燒杯中，加入2.5 mL相應金屬濃度(對照組加入EPA培養(yǎng)基)，于(25±1)℃、無光照的恒溫培養(yǎng)箱中進行暴露，實驗期間不投喂食物，24 h后計數(shù)每個燒杯中存活的輪蟲數(shù)目。

1.3.2 聯(lián)合急性毒性實驗

以兩元金屬聯(lián)合為例，將單一金屬24 h的半數(shù)致死濃度(LC50)值作為一個毒性單位，分別按照毒性1:1和濃度1:1的混合比例并以等對數(shù)間距(參照毒性較大的物質(zhì)設計)設置5組不同的實驗濃度。三元、四元和五元重金屬聯(lián)合的實驗設計與此一樣。聯(lián)合急性毒性實驗方法均與單一金屬的相同。

1.4 數(shù)據(jù)處理

單一和聯(lián)合金屬急性毒性實驗24 h的LC50值依據(jù)機率單位法原理，運用SPSS16.0分析軟件中機率分析(probit analysis)得出。

1.5 聯(lián)合毒性評價方法

修瑞琴等[19]在Marking[20]的相加指數(shù)法的基礎上，提出了“水生毒理聯(lián)合效應相加指數(shù)法”，該方法在目前國內(nèi)水生毒理學聯(lián)合毒性試驗研究中的應用較為廣泛。以二元聯(lián)合為例，在求得聯(lián)合毒性的LC50值后，用公式(1)求得生物毒性相加作用之和(S)：

式中，A1、B1分別是毒物A、B單一毒性的LC50值；Am、Bm分別是混合物中各毒物的毒性(LC50)。

將S轉(zhuǎn)換成相加指數(shù)AI(additive index)，即當S≤1時，AI=(1/S)-1；當S＞1時，AI=-S+1。最后用AI評價毒物聯(lián)合效應，AI＞0為大于相加作用，即協(xié)同作用(synergism)；AI＜0為小于相加作用，即拮抗作用(antagonism)；AI=0為相加作用(addition)。

2 結果（Results）

2.1 Cu2+、Zn2+、Cd2+、Cr6+和Mn2+5種金屬對萼花臂尾輪蟲的單一急性毒性

表1所示為Cu2+等5種金屬對萼花臂尾輪蟲24 h的LC50值和金屬濃度對數(shù)與死亡機率單位的線性回歸方程。由表可見，該5種金屬對萼花臂尾輪蟲的毒性大小依次為Cu2+>Cd2+>Zn2+> Cr6+>Mn2+。

2.2 Cu2+、Zn2+、Cd2+、Cr6+和Mn2+5種金屬對萼花臂尾輪蟲的二元聯(lián)合急性毒性

表2所示為Cu2+等5種金屬等毒性和等濃度配比情況下二元聯(lián)合對萼花臂尾輪蟲24 h的LC50值和依據(jù)公式(1)判別的聯(lián)合作用效應。由表可知，等毒性配比的Cu2+-Cr6+(0.00385-10.806 mg·L-1)和等濃度配比的Cu2+-Zn2+(0.0199-0.0199 mg·L-1)、Cu2+-Cd2+(0.0181-0.0181 mg·L-1)、Cu2+-Cr6+(0.0118-0.0118 mg·L-1)、Zn2+-Cd2+(3.475-3.475 mg·L-1)二元聯(lián)合測試液的作用結果顯示為拮抗效應，其余二元聯(lián)合測試液的作用結果則均顯示是協(xié)同效應。

2.3 Cu2+、Zn2+、Cd2+、Cr6+和Mn2+5種金屬對萼花臂尾輪蟲的三元聯(lián)合急性毒性

表3所示為Cu2+等5種金屬等毒性和等濃度配比情況下三元聯(lián)合對萼花臂尾輪蟲24 h的LC50值和依據(jù)公式(1)判別的聯(lián)合作用效應。由表可知，等毒性配比的Cu2+-Cr6+-Mn2+(0.00210-5.902-22.981 mg·L-1)和等濃度配比的Cu2+-Cd2+-Mn2+(0.00727-0.00727-0.00727 mg·L-1)三元聯(lián)合測試液的作用結果顯示為拮抗效應，其余三元聯(lián)合測試液的作用結果則均顯示是協(xié)同效應。

2.4 Cu2+、Zn2+、Cd2+、Cr6+和Mn2+5種金屬對萼花臂尾輪蟲的四元聯(lián)合急性毒性

表4所示為Cu2+等5種金屬等毒性和等濃度配比情況下四元聯(lián)合對萼花臂尾輪蟲24 h LC50值和依據(jù)公式(1)判別的聯(lián)合作用效應。由表可見，等濃度配比的Cu2+-Zn2+-Cd2+-Cr6+(0.00907-0.00907-0.00907-0.00907mg·L-1)、Cu2+-Zn2+-Cd2+-Mn2+(0.00898-0.00898-0.00898-0.00898 mg·L-1)、Cu2+-Zn2+-Cr6+-Mn2+(0.00819-0.00819-0.00819-0.00819 mg ·L-1)四元聯(lián)合測試液的作用結果顯示為拮抗效應，其余四元聯(lián)合測試液的作用結果則均顯示是協(xié)同效應。

2.5 Cu2+、Zn2+、Cd2+、Cr6+和Mn2+5種金屬對萼花臂尾輪蟲的五元聯(lián)合急性毒性

表5所示為Cu2+等5種金屬等毒性和等濃度配比情況下五元聯(lián)合對萼花臂尾輪蟲24 h的LC50值和依據(jù)公式(1)判別的聯(lián)合作用效應。由表可見，Cu2+-Zn2+-Cd2+-Cr6+-Mn2+等毒性(0.00074-1.520-0.348-2.082-8.107 mg·L-1)和等濃度(0.00582-0.00582-0.00582-0.00582-0.00582 mg·L-1)配比的五元聯(lián)合測試液作用結果均顯示是協(xié)同效應。

3 討論（Discussion）

該5種重金屬中，除Mn2+以外，其余4種重金屬對萼花臂尾輪蟲的單一急性毒性均已有報道[13-15]，所得結果不盡相同。Snell等[13]采用休眠卵萌發(fā)獲取受試個體(齡長2 h內(nèi)的幼體)，實驗得到的Cu2+、Zn2+和Cd2+對萼花臂尾輪蟲的24 h LC50分別為0.026 mg·L-1、1.3 mg·L-1和0.81 mg·L-1；趙含英等[14]從預培養(yǎng)體系中隨機吸取不帶卵的個體，實驗期間投喂1.0×106cell·mL-1的蛋白核小球藻，得到的Cu2+、Zn2+和Cd2+對萼花臂尾輪蟲的24 h LC50分別為0.06 mg·L-1、1.69 mg·L-1和1.49 mg·L-1；Sarma等[15]選取的也是輪蟲幼體(具體齡長沒有標明)，實驗期間不投喂食物，得到的Cd2+和Cr6+對萼花臂尾輪蟲的24 h LC50分別為0.18 mg·L-1和17.4 mg·L-1。筆者認為實驗條件的不同，如齡長、喂食與否等，是導致實驗結果不盡相同的主要原因。但是，無論差異多大，該幾種金屬對輪蟲的毒性的大小順序的結論基本是一致的，即Cu2+>Cd2+>Zn2+>Cr6+。Mn2+對萼花臂尾輪蟲的LC50值明顯大于上述4個重金屬，因此，它對萼花臂尾輪蟲的毒性是這5種金屬中最小的。

表1 Cu2+、Zn2+、Cd2+、Cr6+和Mn2+對萼花臂尾輪蟲24 h的單一毒性Table 1 The 24 h single toxicity of Cu2+,Zn2+,Cd2+,Cr6+,and Mn2+toBrachionus calyciflorus

在單一污染物暴露下，毒物對生物體的毒性效應基本上決定于毒物本身的理化性質(zhì)和暴露時的濃度水平[21]。在復合污染的條件下，除了混合物組成各成分的理化性質(zhì)以外，各組分的濃度也起到了至關重要的作用[3]。但是，到底是各成分的污染物濃度還是混合物濃度配比關系決定了混合物聯(lián)合作用的毒性還有爭論。周啟星等[22]認為污染物本身的化學性質(zhì)對復合污染生態(tài)效應所起的作用，要比其濃度組合關系的影響小得多，污染物暴露的濃度組合關系對毒性的影響更為直接，在一定條件下甚至起決定作用。但是，縱觀本研究的結果，在多元聯(lián)合毒性測試的26組(二元組合10組，三元組合10組，四元組合5組，五元組合1組)中，有18組在等濃度和等毒性不同配比時表現(xiàn)出來的聯(lián)合毒性效應是一致的，即濃度組合關系(等毒性和等濃度實質(zhì)上就是混合物各組分濃度組合關系的不同)的變動在多數(shù)情況下并未造成聯(lián)合毒性效應的變化。因此，污染物暴露的濃度組合關系在聯(lián)合毒性效應評價中的作用可能還要依具體情況而定，不可一概而論。

表2 Cu2+ 、Zn2+ 、Cd2+ 、Cr6+和Mn2+二元混合物對萼花臂尾輪蟲24 h 的聯(lián)合毒性Table 2 The 24 h combined toxicity of binary mixture of Cu2+ , Zn2+ , Cd2+ , Cr6+ , and Mn2+ to Brachionus calyciflorus

表3 Cu2+ 、Zn2+ 、Cd2+ 、Cr6+和Mn2+三元混合物對萼花臂尾輪蟲24 h 的聯(lián)合毒性Table 3 The 24 h combined toxicity of ternary mixture of Cu2+ , Zn2+ , Cd2+ , Cr6+ , and Mn2+ to Brachionus calyciflorus

344 生態(tài)毒理學報第11 卷表4 Cu2+ 、Zn2+ 、Cd2+ 、Cr6+和Mn2+四元混合物對萼花臂尾輪蟲24 h 的聯(lián)合毒性Table 4 The 24 h combined toxicity of quaternary mixture of Cu2+ , Zn2+ , Cd2+ , Cr6+ , and Mn2+ to Brachionus calyciflorus

表5 Cu2+ 、Zn2+ 、Cd2+ 、Cr6+和Mn2+五元混合物對萼花臂尾輪蟲24 h 的聯(lián)合毒性Table 5 The 24 h combined toxicity of pentabasic mixture of Cu2+ , Zn2+ , Cd2+ , Cr6+ ,and Mn2+ to Brachionus calyciflorus

本研究中，Cu2+-Zn2+、Cu2+-Cd2+、Zn2+-Cd2+、Cu2+-Cd2+-Mn2+、Cu2+-Zn2+-Cd2+-Cr6+、Cu2+-Zn2+-Cd2+-Mn2+、Cu2+-Zn2+-Cr6+-Mn2+等測試組等毒性配比對萼花臂尾輪蟲的聯(lián)合毒性作用是協(xié)同效應，等濃度配比則是拮抗效應。如果不考慮混合物中金屬之間可能發(fā)生的物理化學作用，等毒性配比時，各組成成分具有相同的急性致死效應，最終聯(lián)合毒性表現(xiàn)為協(xié)同或者相加效應不難理解；而等濃度配比時，混合物的濃度主要由毒性較大的重金屬決定，而毒性較小的重金屬往往處于一個較低的濃度水平，這時它們會表現(xiàn)出何種毒性效應將決定最終混合物聯(lián)合毒性效應。研究發(fā)現(xiàn)，低濃度水平的重金屬如Cd2+、Zn2+等對萼花臂尾輪蟲并無急性致死作用，有時甚至會發(fā)生類似毒物興奮效應(hormesis)——刺激輪蟲種群增長的現(xiàn)象[5,23]。所以，等濃度配比時，一種情況是處于較低濃度的毒性較小的重金屬依然表現(xiàn)出了一定急性致死作用，那么最終混合物聯(lián)合毒性效應將會是協(xié)同效應；相反，如果它們表現(xiàn)出了不影響甚至刺激輪蟲生長的作用時，最終混合物聯(lián)合毒性效應則很可能就會是拮抗效應。因此我們認為，上述測試組在等濃度配比時各組分表現(xiàn)出來毒性作用不相一致，并最終導致了拮抗效應的出現(xiàn)。

資料顯示，復合污染中的協(xié)同效應是各毒物之間聯(lián)合作用的主要表現(xiàn)形式[24]。本研究中，協(xié)同作用共有42例，拮抗作用10例，分別占總數(shù)的81%和19%，協(xié)同作用占大多數(shù)。研究發(fā)現(xiàn)，混合物中各組分作用機理和作用位點的差異會導致聯(lián)合毒性效應的不同[25-26]。同時，重金屬會在生物體不同的組織部位積累，重金屬與重金屬之間、重金屬與生物體內(nèi)各種組分之間都有可能發(fā)生不同的交互作用，導致不同的生態(tài)毒理效應[22]。雖然目前還沒有該5種重金屬對輪蟲致毒機理的報道，但如前所述，該5種重金屬分屬不同類別，有理由相信它們對輪蟲的毒性作用機理會存在差異，據(jù)此我們推測，該5種重金屬對輪蟲致毒機理的差異是導致混合物聯(lián)合毒性效應不同的根本原因。其次，我們認為，混合物(特別是3元以上混合物)中，各組分對最終呈現(xiàn)的毒性效應的貢獻是不一樣的，在出現(xiàn)協(xié)同效應的處理組中，毒性貢獻大的組分之間在其對輪蟲致毒過程中應該是相互不干擾的，或者至少它們之間沒有發(fā)生相互抑制或競爭作用位點的效應；相反，拮抗效應的出現(xiàn)則意味著這該組混合物中，起決定作用的組分在對輪蟲致毒過程中出現(xiàn)了不相一致的毒性效應(如前所述)，或者類似競爭作用位點情況，例如共存的金屬離子導致了對方作用位點的可結合性降低，從而減弱了對方的毒性[27]。在某一混合物處理組中，究竟是哪一個或哪一些組分發(fā)揮的毒性作用貢獻大，各組分在最終毒性效應中的作用分別是怎樣的，是非常值得進一步研究的，這對闡釋混合物聯(lián)合毒性效應的機理非常關鍵。

除了配比方式以外，暴露時間的不同和測試物種的不同也可能影響重金屬聯(lián)合毒性作用的評判結果[28]。研究表明，隨著等毒性配比的Zn2+-Cd2+聯(lián)合作用時間的延長，其對斑馬魚(Brachynanio rerio)的聯(lián)合急性毒性是先協(xié)同后拮抗[29]，而對草魚(Ctenopharyngodon idellus)則是先拮抗后協(xié)同[30]，本研究中，由于實驗過程中是不添加食物的，而輪蟲的耐饑餓時間較短，為了避免饑餓的影響，因此沒有延長暴露時間進行研究。一般說來，就單一金屬暴露而言，生物體與毒物接觸的時間越長，其受到的傷害也就越大[31]。但是，暴露時間的延長是否會影響多金屬對輪蟲的聯(lián)合急性毒性效應還需要開展進一步的研究驗證。等濃度的Cu2+-Zn2+、Cu2+-Cd2+對于萼花臂尾輪蟲產(chǎn)生的是拮抗效應(本研究)，對大型溞(Daphnia magna)卻均是協(xié)同效應[32-33]；同樣，等濃度的Zn2+-Cd2+對于萼花臂尾輪產(chǎn)生的是拮抗效應(本研究)，對水螅(Hydrasp.)產(chǎn)生的卻是協(xié)同效應[34]，測試生物不同帶來的聯(lián)合效應的差異可以理解為：不同的生物的具有不同的生理結構、代謝途徑和應激反應系統(tǒng)，使得不同生物種類面臨同一類型的復合污染脅迫，產(chǎn)生了不同的生態(tài)毒理效應[22]。

綜上所述，可以得出以下結論：(1)Cu2+、Cd2+、Zn2+、Cr6+和Mn2+等5種重金屬對萼花臂尾輪蟲24 h單一急性毒性大小依次：Cu2+>Cd2+>Zn2+>Cr6+> Mn2+；(2)多數(shù)情況下，相同組分等毒性和等濃度配比對輪蟲的聯(lián)合毒性效應是一致的，少數(shù)組出現(xiàn)差異的原因是由于混合物中不同組分產(chǎn)生的毒性效應不相一致所致；(3)協(xié)同效應是聯(lián)合毒性效應的主要表現(xiàn)形式，各組分對輪蟲致毒機理的差異可能是導致混合物產(chǎn)生不同聯(lián)合毒性效應的根本原因。因此，對于致毒機理不盡相同的重金屬混合物而言，在評價其聯(lián)合毒性效應時都需進行具體的實驗研究后方可定論，不能簡單由單一金屬毒性相加來判斷其毒性[29,35]。此外，本研究得出的Cu2+、Zn2+、Cd2+、Cr6+和Mn2+等5種常見金屬對萼花臂尾輪蟲的聯(lián)合毒性數(shù)據(jù)，特別是有Cr6+和Mn2+參與的聯(lián)合毒性結果乃是首次得出，不僅豐富了輪蟲生態(tài)毒理學研究的基礎資料，同時也為開展評價水體重金屬復合污染的生態(tài)風險提供了理論數(shù)據(jù)和科學參考。

（References）：

[1] 王學鋒,朱桂芬.重金屬污染研究新進展[J].環(huán)境科學與技術,2003,26(1):54-56

Wang X F,Zhu G F.Recent progress in studies of heavy metals pollution[J].Environmental Science and Technology,2003,26(1):54-56(in Chinese)

[2] 鄭振華,周培疆,吳振斌.復合污染研究的新進展[J].應用生態(tài)學報,2001,12(3):469-473

Zheng Z H,Zhou P J,Wu Z B.New advances in research of combined pollution[J].Chinese Journal of Applied E-cology,2001,12(3):469-473(in Chinese)

[3] Norwood W P,Borgmann U,Dixon D G,et al.Effects of metal mixtures on aquatic biota:A review of observations and methods[J].Human and Ecological Risk Assessment, 2003,9(4):795-811

[4] Wallace R L,Snell T W.Phylum Rotifera[M]//Thorp J H,Covich A P.Eds.Ecology and Classification of North American Freshwater Invertebrates.San Diego,CA:Academic Press,2001:195-254

[5] Xu X P,Xi Y L,Huang L,et al.The life table demographic response of freshwater rotiferBrachionus calyciflorusto multi-metal(Cu,Zn,Cd,Cr,and Mn)mixture interaction[J].Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology,2014,93:165-170

[6] 徐吉洋,張文萍,李少南,等.萼花臂尾輪蟲毒性試驗的方法學研究[J].生態(tài)毒理學報,2015,10(2):346-352

Xu J X,Zhang W P,Li S N,et al.Research on toxicity test method forBrachionus calyciflorus[J].Asian Journal of Ecotoxicology,2015,10(2):346-352(in Chinese)

[7] Dahms H U,Hagiwara A,Lee J S.Ecotoxicology,ecophysiology,and mechanistic studies with rotifers[J].A-quatic Toxicology,2011,101:1-12

[8] American Society for Testing and Material(ASTM). Standard Guide for Acute Toxicity Tests with the Rotifer Brachionus.Annual Book of ASTM Standards[S].Philadelphia,PA,USA:ASTM,1991:E1440-91

[9] Organization for Economic Co-operation and Development(OECD).Detailed Review Paper on Aquatic Arthropods in Life-cycle Toxicity Tests with An Emphasis on Developmental,Reproductive and Endocrine Disruptive Effects[M].Paris:OECD,2006:125

[10] 張融,范文宏,唐戈,等.水體中重金屬鎘和鋅對大型蚤聯(lián)合毒性效應的初步研究[J].生態(tài)毒理學報,2008,3 (3):286-290

Zhang R,Fan W H,Tang G,et al.A preliminary study on joint toxic effects of Cd and Zn onDaphnia magna[J].A-sian Journal of Ecotoxicology,2008,3(3):286-290(in Chinese)

[11] 宋志慧,王慶偉.Cu2+,Cd2+和Cr6+對斑馬魚聯(lián)合毒性作用和生物預警的研究[J].生態(tài)毒理學報,2011,6(4): 361-366

Song Z H,Wang Q W.Study on joint toxicity and biological early warning of Cu2+,Cd2+and Cr6+using zebrafish [J].Asian Journal of Ecotoxicology,2011,6(4):361-366 (in Chinese)

[12] 劉華,劉可慧,周振明,等.Mn、Zn單一及復合污染對水蓼氮素代謝的影響[J].生態(tài)環(huán)境學報,2015,24(3): 517-521

Liu H,Liu K H,Zhou Z M,et al.Effects of Mn/Zn single and combined pollution on the nitrogen metabolism in Polygonum hydropiper L[J].Ecology and Environment Sciences,2015,24(3):517-521(in Chinese)

[13] Snell T W,Moffat B D,Janssen C R,et al.Acute toxicity tests using rotifers:IV.Effects of cyst age,temperature, and salinity on the sensitivity ofBrachionus calyciflorus [J].Ecotoxicology and Environmental Safety,1991,21(3): 308-317

[14] 趙含英,楊家新,陸正和,等.Cu2+對萼花臂尾輪蟲的毒性影響[J].南京師大學報：自然科學版,2002,25(4):81-85

Zhao H Y,Yang J X,Lu Z H,et al.The toxic effect ofCu2+on rotiferBrachionus calyciflorus[J].Journal of Nanjing Normal University:Natural Science Edition, 2002,25(4):81-85(in Chinese)

[15] Sarma S S S,Martínez-Jerónimo F,Ramírez-Pérez T,et al. Effect of cadmium and chromium toxicity on the demography and population growth ofBrachionus calyciflorusand Brachionus patulus(Rotifera)[J].Journal of Environmental Science and Health Part A,Toxic/Hazardous Substances and Environmental Engineering,2006,41(4):543-558

[16] United States Environmental Protection Agency(US EPA).Methods for Measuring the Acute Toxicity of Effluents and Receiving Waters to Freshwater and Marine Organisms(Fifth Edition)[R].Washington DC:Office of Water,Office of Science and Technology,2002

[17] 章宗涉,黃祥飛.淡水浮游生物研究方法[M].北京:科學出版社,1991:410-411

[18] Wang X M,Chu Z X,Zha F G,et al.Determination of heavy metals in water and tissue of crucian carp(Carassius auratusGibelio)collected from subsidence pools in Huainan coal fields(China)[J].Analytical Letters,2015, 48:861-877

[19] 修瑞琴,許永香,付迎春,等.水生毒理聯(lián)合效應相加指數(shù)法[J].環(huán)境化學,1994,13(3):269-271

Xiu R Q,Xu Y X,Fu Y C,et al.Additive index of coeffects for aquatic toxicology[J].Evironmental Chemistry, 1994,13(3):269-271(in Chinese)

[20] Making L L.An Approach for Additive Toxicity of Chemical Mixtures.Aquatic Toxicology and Hazard Evaluation[M].Philadelphia:ASTM STP Publication,1977: 99-108

[21] 熊治廷.環(huán)境生物學[M].北京:化學工業(yè)出版社,2010: 85-92

[22] 周啟星,程云,張倩茹,等.復合污染生態(tài)毒理效應的定量關系分析[J].中國科學C輯,2003,33(6):566-573

[23] 趙清清,席貽龍,李志超,等.不同藻密度下Zn2+濃度對萼花臂尾輪蟲實驗種群增長參數(shù)的影響[J].生態(tài)學報,2015,35(12):4026-4033

Zhao Q Q,Xi Y L,Li Z C,et al.Effects of Zn2+concentration on population growth parameters ofBrachionus calyciflorusunder differentScenedesmus obliquusdensities[J].Acta Ecologica Sinica,2015,35(12):4026-4033

[24] Altenburger R,Backhaus T,Boedeker W,et al.Simplifying complexity:Mixture toxicity assessment in the last 20 years[J].Environmental Toxicology and Chemistry,2013, 32(8):1685-1687

[25] Yang R,Li N,Ma M,et al.Combined effects of estrogenic chemicals with the same mode of action using an estrogen receptor binding bioassay[J].Environmental Toxicology and Pharmacology,2014,38(3):829-837

[26] Yang R,Li N,Rao K,et al.Combined action of estrogen receptor agonists and antagonists in two-hybrid recombinant yeast in vitro[J].Ecotoxicology and Environmental Safety,2015,111:228-235

[27] Vranken G,Tire C,Heip C.The toxicity of paired metal mixtures to the nematodeMonhystera disjuncta(Bastian, 1865)[J].Marine Environmental Research,1988,26(3):161-179

[28] 蘇永紅,唐柱云,曾科.重金屬聯(lián)合毒性研究進展[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技,2007,10:174-175

[29] 修瑞琴,許永香,高世榮,等.砷與鎘、鋅離子對斑馬魚的聯(lián)合毒性實驗[J].中國環(huán)境科學,1998,18(4):349-352

Xiu R Q,Xu Y X,Gao S R,et al.Joint toxicity test of arsenic with cadmium and zinc ions to zebrafish,Brachynanio rerio[J].China Environmental Science,1998,18(4): 349-352(in Chinese)

[30] 華濤,周啟星.Cd-Zn對草魚(Ctenopharyngodon idellus)的聯(lián)合毒性及對肝臟超氧化物歧化酶(SOD)活性的影響[J].環(huán)境科學學報,2009,29(3):600-606

Hua T,Zhou Q X.Joint toxic effects of Cd and Zn on grass carp(Ctenopharyngodon idellus)and SOD activity in livers[J].Acta Scientiae Circumstantiae,2009,29(3): 600-606(in Chinese)

[31] Tao S,Liang T,Cao J,et al.Synergistic effect of copper and lead uptake by fish[J].Ecotoxicology and Environmental Safety,1999,44(2):190-195

[32] 董曉曉,劉騰騰,孔強,等.Cu2+,Cd2+和Se4+對大型溞的單一及聯(lián)合毒性效應[J].山東科學,2012,25(2):38-43

Dong X X,Liu T T,Kong Q,et al.Individual and combine toxicity of Cu2+,Cd2+,and Se4+toDaphnia magna [J].Shandong Science,2012,25(2):38-43(in Chinese)

[33] 丁嬋娟,付榮恕.Cu2+,Pb2+和Zn2+對大型溞的單一及聯(lián)合毒性效應[J].山東師范大學學報：自然科學版, 2013,28(1):137-140

Ding C J,Fu R S.Individual toxicity and joint toxicity of copper,lead,and znic ionc toDaphnia magna[J].Journal of Shandong Normal University:Nature Science,2013,28 (1):137-140(in Chinese)

[34] 王瑩,郝家勝,陳娜,等.鉛、鎘和鋅3種重金屬離子對水螅的聯(lián)合毒性研究[J].生命科學研究,2006,10(1): 91-94

Wang Y,Hao J S,Chen N,et al.Joint toxicity test of heavy metal ions lead,cadmium and zinc toHydrasp[J].Life Science Research,2006,10(1):91-94(in Chinese)

[35] Eaton J G.Chronic toxicity of a copper,cadmium and zinc mixture to the fathead minnow(Pimephales promelas Rafinesque)[J].Water Research,1973,7(11):1723-1736◆

Combined Acute Toxicities of Cu2+，Zn2+，Cd2+，Cr6+，and Mn2+to Freshwater Rotifer Brachionus calyciflorus Pallas

Xu Xiaoping1,2,Xi Yilong1,*,Huang Lin1

1.Collaborative Innovation Center of Recovery and Reconstruction of Degraded Ecosystem in Wanjiang City Belt,College of Life Sciences,Anhui Normal University,Wuhu 241000,China
2.College of Civil Engineering and Architecture,Anhui Polytechnic University,Wuhu 241000,China

21 September 2015 accepted 27 November 2015

Rotifers are one of the important groups of zooplankton in freshwater ecosystem and are recognized as ideal bioassay animals for toxicity tests because of their small size,short generation time,and rapid reproduction rate.In order to investigate the toxic effects of combined pollution of heavy metal on the rotifers,the 24 h combined acute toxicities of Cu2+,Zn2+,Cd2+,Cr6+,and Mn2+toBrachionus calycifloruswere evaluated using the additive index of coeffects for aquatic toxicology.The 24 h single toxicity test showed that the median lethal concentrations(LC50)of Cu2+,Zn2+,Cd2+,Cr6+,and Mn2+toB.calycifloruswere 0.00616 mg·L-1,12.62 mg·L-1,2.89 mg· L-1,17.29 mg·L-1,and 67.32 mg·L-1,respectively.The 24 h combined acute toxicity of Cu2+-Cr6+(0.00385-10.806 mg·L-1)was antagonism when the toxicity ratio of the two was 1:1,which is similar to the Cu2+-Zn2+(0.0199-0.0199 mg·L-1)，Cu2+-Cd2+(0.0181-0.0181 mg·L-1)，Cu2+-Cr6+(0.0118-0.0118 mg·L-1),and Zn2+-Cd2+(3.475-3.475 mg·L-1)combinedat the concentration ratio of 1:1.The actions of the other binary mixtures were all synergism regardless of the combined pattern.Both the 24 h combined acute toxicities of Cu2+-Cr6+-Mn2+(0.00210-5.902-22.981 mg·L-1)and Cu2+-Cd2+-Mn2+(0.00727-0.00727-0.00727 mg·L-1)were antagonism when combined at the toxicity ratio of 1:1:1 and the concentration ratio of 1:1:1,respectively.The actions of the other ternary mixtures were all synergism.At the concentration ratio of 1:1:1:1,the 24 h acute combined toxicities of Cu2+-Zn2+-Cd2+-Cr6+(0.00907-0.00907-0.00907-0.00907 mg·L-1),Cu2+-Zn2+-Cd2+-Mn2+(0.00898-0.00898-0.00898-0.00898 mg·L-1), and Cu2+-Zn2+-Cr6+-Mn2+(0.00819-0.00819-0.00819-0.00819 mg·L-1)were all antagonism.The actions of the other quaternary mixture were all synergism.The 24 h combined acute toxicities of the Cu2+-Zn2+-Cd2+-Cr6+-Mn2+were synergism when combined at the toxicity ratio of 1:1:1:1:1(0.00074-1.520-0.348-2.082-8.107 mg·L-1)and the concentration ratio of 1:1:1:1:1(0.00582-0.00582-0.00582-0.00582-0.00582 mg·L-1).The present results indicated that the pattern of combination should be fully considered when evaluating the combined acute toxicity of metal mixtures.

heavy metals;Brachionus calyciflorus;combined toxicity;acute toxicity

2015-09-21 錄用日期：2015-11-27

1673-5897（2016）3-338-10

X171.5

A

10.7524/AJE.1673-5897.20150921002

簡介：席貽龍(1965-)，男，理學博士，教授，主要研究方向為浮游動物生態(tài)和水生態(tài)毒理學，發(fā)表學術論文140余篇。

國家自然科學基金(31470015)；安徽省高校生物環(huán)境與生態(tài)安全省級重點實驗室專項基金(2004sys003)；安徽省高等學校自然科學研究重點項目(KJ2016A063)

徐曉平(1979-)，男，博士，研究方向為水生態(tài)毒理學，E-mail:xuxp1979@126.com

*通訊作者（Corresponding author），E-mail:ylxi1965@126.com