徐曉平，席貽龍，黃林

1.安徽師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，安徽省皖江城市帶退化生態(tài)系統(tǒng)的恢復(fù)與重建協(xié)同創(chuàng)新中心，蕪湖241000

2.安徽工程大學(xué)建筑工程學(xué)院，蕪湖241000

Cu2+、Zn2+、Cd2+、Cr6+和Mn2+對(duì)萼花臂尾輪蟲聯(lián)合急性毒性研究

徐曉平1,2，席貽龍1,*，黃林1

1.安徽師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，安徽省皖江城市帶退化生態(tài)系統(tǒng)的恢復(fù)與重建協(xié)同創(chuàng)新中心，蕪湖241000

2.安徽工程大學(xué)建筑工程學(xué)院，蕪湖241000

為探究重金屬?gòu)?fù)合污染對(duì)輪蟲的毒性影響，以萼花臂尾輪蟲為受試動(dòng)物，選擇Cu2+、Zn2+、Cd2+、Cr6+和Mn2+等5種重金屬，采用水生毒理聯(lián)合效應(yīng)相加指數(shù)法開展了其24 h聯(lián)合急性毒性作用的評(píng)價(jià)研究。結(jié)果顯示，Cu2+、Zn2+、Cd2+、Cr6+和Mn2+等5種重金屬對(duì)萼花臂尾輪蟲24 h半數(shù)致死濃度分別為：0.00616 mg·L-1，12.62 mg·L-1，2.89 mg·L-1，17.29 mg·L-1和67.32 mg ·L-1。聯(lián)合急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，等毒性配比的Cu2+-Cr6+(0.00385-10.806 mg·L-1)和等濃度配比的Cu2+-Zn2+(0.0199-0.0199 mg·L-1)、Cu2+-Cd2+(0.0181-0.0181 mg·L-1)、Cu2+-Cr6+(0.0118-0.0118 mg·L-1)、Zn2+-Cd2+(3.475-3.475 mg·L-1)二元聯(lián)合測(cè)試液的作用結(jié)果顯示為拮抗效應(yīng)，其余二元聯(lián)合測(cè)試液的作用結(jié)果則均顯示是協(xié)同效應(yīng)。等毒性配比的Cu2+-Cr6+-Mn2+(0.00210-5.902-22.981 mg·L-1)和等濃度配比的Cu2+-Cd2+-Mn2+(0.00727-0.00727-0.00727 mg·L-1)三元聯(lián)合測(cè)試液的作用結(jié)果顯示為拮抗效應(yīng)，其余三元聯(lián)合測(cè)試液的作用結(jié)果則均顯示是協(xié)同效應(yīng)。等濃度配比的Cu2+-Zn2+-Cd2+-Cr6+(0.00907-0.00907-0.00907-0.00907 mg·L-1)、Cu2+-Zn2+-Cd2+-Mn2+(0.00898-0.00898-0.00898-0.00898 mg·L-1)、Cu2+-Zn2+-Cr6+-Mn2+(0.00819-0.00819-0.00819-0.00819 mg·L-1)四元聯(lián)合測(cè)試液的作用結(jié)果顯示為拮抗效應(yīng)，其余四元聯(lián)合測(cè)試液的作用結(jié)果的則均顯示是協(xié)同效應(yīng)。Cu2+-Zn2+-Cd2+-Cr6+-Mn2+等毒性(0.00074-1.520-0.348-2.082-8.107 mg·L-1)和等濃度(0.00582-0.00582-0.00582-0.00582-0.00582 mg·L-1)配比的五元聯(lián)合測(cè)試液作用結(jié)果均顯示是協(xié)同效應(yīng)。

重金屬；萼花臂尾輪蟲；聯(lián)合毒性；急性毒性

徐曉平,席貽龍,黃林.Cu2+、Zn2+、Cd2+、Cr6+和Mn2+對(duì)萼花臂尾輪蟲聯(lián)合急性毒性研究[J].生態(tài)毒理學(xué)報(bào)，2016,11(3):338-347

Xu X P,Xi Y L,Huang L.Combined acute toxicities of Cu2+,Zn2+,Cd2+,Cr6+,and Mn2+to freshwater rotiferBrachionus calyciflorusPallas[J].Asian Journal of Ecotoxicology,2016,11(3):338-347(in Chinese)

目前，我國(guó)水體重金屬污染情況仍然較為嚴(yán)重，不斷威脅著水生態(tài)系統(tǒng)平衡和人們的生活和健康。2015年7月，國(guó)家環(huán)保部公布的《2015年上半年全國(guó)環(huán)境質(zhì)量狀況》指出，全國(guó)有8個(gè)地表水國(guó)控?cái)嗝?點(diǎn)位)共出現(xiàn)18次重金屬超標(biāo)現(xiàn)象。重金屬污染很少是由單一金屬污染造成，往往是由多種重金屬聯(lián)合存在引起的復(fù)合污染[1-2]。重金屬共存時(shí)，其毒性效應(yīng)與單一金屬具有很大差異[3]，因此，研究多種重金屬共存時(shí)的聯(lián)合毒性效應(yīng)具有更為重要的現(xiàn)實(shí)意義。

輪蟲(rotifer)是廣泛分布于各類水體中的一類浮游動(dòng)物，是浮游動(dòng)物四大類群之一。雖然輪蟲的個(gè)體在所有后生動(dòng)物中為最小，但其繁殖速率較快，能夠迅速占領(lǐng)環(huán)境中的生態(tài)位，其轉(zhuǎn)換效率極高，在淡水水體生態(tài)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)功能、能量傳遞及物質(zhì)轉(zhuǎn)換上具有重要意義[4]。也正是因?yàn)槿绱耍捎谒w污染導(dǎo)致輪蟲種群的變動(dòng)也勢(shì)必會(huì)影響整個(gè)水生態(tài)系統(tǒng)的平衡，所以，暴露于不同污染物下輪蟲各生物學(xué)參數(shù)的變化引起人們?cè)絹?lái)越多的關(guān)注[5-6]。此外，輪蟲世代時(shí)間短、個(gè)體小、繁殖快、易培養(yǎng)，是開展生態(tài)毒理學(xué)研究的理想受試生物[7]。美國(guó)材料與試驗(yàn)協(xié)會(huì)(ASTM)將萼花臂尾輪蟲(Brachionus calyciflorus)和褶皺臂尾輪蟲(B.plicatilis)分別作為淡水和海水的標(biāo)準(zhǔn)測(cè)試生物[8]。經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織(OECD)將輪蟲視作無(wú)脊椎動(dòng)物中進(jìn)行環(huán)境毒性測(cè)試最有前途的分類群[9]。

Cu2+、Zn2+、Cd2+、Cr6+和Mn2+等5種重金屬均屬于常見環(huán)境污染物，在我國(guó)工業(yè)廢水排放以及飲用水質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中都有明確的限值規(guī)定，其中，Cu2+、Zn2+和Mn2+是生物體必需的金屬元素，但過(guò)量攝入會(huì)導(dǎo)致機(jī)體的損傷甚至死亡；Cd2+和Cr6+是非生命必需元素，即是在很低劑量亦會(huì)表現(xiàn)出一定的毒性。該5種重金屬或是在地球化學(xué)循環(huán)和致毒機(jī)理等方面存在很大差異，如Cu2+、Cr6+和Mn2+，或是相伴而生、結(jié)構(gòu)與化學(xué)性質(zhì)相似，如Zn2+和Cd2+，因此，常被選作用于開展重金屬聯(lián)合毒性效應(yīng)的研究[10-12]。目前，關(guān)于此類重金屬對(duì)輪蟲的毒性影響的報(bào)道主要集中在單一毒性[13-15]，聯(lián)合毒性影響鮮有研究。因此，本研究目的之一是豐富輪蟲毒理學(xué)的基礎(chǔ)資料，為開展重金屬?gòu)?fù)合污染對(duì)水體生態(tài)系統(tǒng)影響的評(píng)價(jià)提供科學(xué)參考。其次，重金屬?gòu)?fù)合污染作用機(jī)理復(fù)雜，影響因素較多，規(guī)律難尋[3]，本研究的目的之二是希望通過(guò)設(shè)置不同毒物配比方式，評(píng)價(jià)其對(duì)輪蟲的聯(lián)合毒性效應(yīng)，尋找其作用規(guī)律，以期為重金屬聯(lián)合毒性評(píng)價(jià)研究積累理論數(shù)據(jù)。為此，本文首先在實(shí)驗(yàn)室條件下開展了該5種重金屬對(duì)萼花臂尾輪蟲24 h的單一急性毒性作用研究，在此基礎(chǔ)上，研究了等毒性和等濃度配比的情況下，該5種重金屬中的二元、三元、四元和五元聯(lián)合對(duì)萼花臂尾輪蟲24 h聯(lián)合急性毒性，并通過(guò)運(yùn)用“水生毒理聯(lián)合效應(yīng)相加指數(shù)法”判定了這些聯(lián)合毒性作用效應(yīng)的類型。

1 材料與方法（Materials and methods）

1.1 輪蟲的來(lái)源與培養(yǎng)

實(shí)驗(yàn)所用的萼花臂尾輪蟲采自蕪湖市汀棠湖(119°21'E,31°20'N)，實(shí)驗(yàn)室內(nèi)在(25±1)℃、自然光照條件下進(jìn)行“克隆”培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間為3個(gè)月以上；輪蟲培養(yǎng)液采用EPA配方[16]，所用餌料由HB-4培養(yǎng)基[17]培養(yǎng)、處于指數(shù)增長(zhǎng)期的斜生柵藻(Scenedesmus obliquus)，離心濃縮后使用。實(shí)驗(yàn)前，將輪蟲置于(25±1)℃、無(wú)光照的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行1周以上的預(yù)培養(yǎng)，培養(yǎng)期間每天投喂密度為2.0×106cell·mL-1的斜生柵藻并更換輪蟲培養(yǎng)液，同時(shí)通過(guò)去除一部分個(gè)體使得輪蟲種群始終處于指數(shù)增長(zhǎng)期。

1.2 測(cè)試液的配制

實(shí)驗(yàn)所用CuSO4·5H2O(無(wú)錫市亞盛化工有限公司生產(chǎn))、ZnSO4·7H2O(無(wú)錫市亞盛化工有限公司生產(chǎn))、CdCl2·2.5H2O(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn))、K2Cr2O7(無(wú)錫市展望化工試劑有限公司生產(chǎn))和MnCl2(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn))均為分析純(≥99%)。實(shí)驗(yàn)前，首先用蒸餾水配制1 000 mg·L-1的母液(均為重金屬離子濃度，Cu2+是100 mg ·L-1)，實(shí)驗(yàn)時(shí)，再用EPA培養(yǎng)基將母液稀釋成所需各濃度的測(cè)試液。母液中的實(shí)際金屬元素濃度經(jīng)由等離子體發(fā)射光譜(ICP-OES,PerkinElmer Optima 2100 DV)測(cè)定[18]。所有待用的玻璃器皿實(shí)驗(yàn)前用相應(yīng)的測(cè)試液浸泡24 h，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中每24 h更換新鮮測(cè)試液。

1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.1 單一金屬24 h急性毒性實(shí)驗(yàn)

依據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，設(shè)置等對(duì)數(shù)間距的5組金屬濃度和1組空白對(duì)照，具體如下，Cu2+：0.0042、0.0056、0.0075、0.01、0.0135 mg·L-1；Zn2+：7.5、10、13.5、18、24 mg·L-1；Cd2+：1、1.8、3.2、5.6、10 mg·L-1；Cr6+：10、13.5、18、24、32 mg·L-1；Mn2+：32、42、56、 75、100 mg·L-1。每個(gè)處理組設(shè)置4個(gè)重復(fù)。實(shí)驗(yàn)開始前，從預(yù)培養(yǎng)的試管中隨機(jī)挑取若干個(gè)帶非混交卵的輪蟲雌體置于含有與預(yù)培養(yǎng)相同藻密度培養(yǎng)液的玻璃燒杯中進(jìn)行培養(yǎng)，12 h后，由各燒杯中隨機(jī)吸取10個(gè)輪蟲幼體置于含6 mL玻璃燒杯中，加入2.5 mL相應(yīng)金屬濃度(對(duì)照組加入EPA培養(yǎng)基)，于(25±1)℃、無(wú)光照的恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行暴露，實(shí)驗(yàn)期間不投喂食物，24 h后計(jì)數(shù)每個(gè)燒杯中存活的輪蟲數(shù)目。

1.3.2 聯(lián)合急性毒性實(shí)驗(yàn)

以兩元金屬聯(lián)合為例，將單一金屬24 h的半數(shù)致死濃度(LC50)值作為一個(gè)毒性單位，分別按照毒性1:1和濃度1:1的混合比例并以等對(duì)數(shù)間距(參照毒性較大的物質(zhì)設(shè)計(jì))設(shè)置5組不同的實(shí)驗(yàn)濃度。三元、四元和五元重金屬聯(lián)合的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與此一樣。聯(lián)合急性毒性實(shí)驗(yàn)方法均與單一金屬的相同。

1.4 數(shù)據(jù)處理

單一和聯(lián)合金屬急性毒性實(shí)驗(yàn)24 h的LC50值依據(jù)機(jī)率單位法原理，運(yùn)用SPSS16.0分析軟件中機(jī)率分析(probit analysis)得出。

1.5 聯(lián)合毒性評(píng)價(jià)方法

修瑞琴等[19]在Marking[20]的相加指數(shù)法的基礎(chǔ)上，提出了“水生毒理聯(lián)合效應(yīng)相加指數(shù)法”，該方法在目前國(guó)內(nèi)水生毒理學(xué)聯(lián)合毒性試驗(yàn)研究中的應(yīng)用較為廣泛。以二元聯(lián)合為例，在求得聯(lián)合毒性的LC50值后，用公式(1)求得生物毒性相加作用之和(S)：

式中，A1、B1分別是毒物A、B單一毒性的LC50值；Am、Bm分別是混合物中各毒物的毒性(LC50)。

將S轉(zhuǎn)換成相加指數(shù)AI(additive index)，即當(dāng)S≤1時(shí)，AI=(1/S)-1；當(dāng)S＞1時(shí)，AI=-S+1。最后用AI評(píng)價(jià)毒物聯(lián)合效應(yīng)，AI＞0為大于相加作用，即協(xié)同作用(synergism)；AI＜0為小于相加作用，即拮抗作用(antagonism)；AI=0為相加作用(addition)。

2 結(jié)果（Results）

2.1 Cu2+、Zn2+、Cd2+、Cr6+和Mn2+5種金屬對(duì)萼花臂尾輪蟲的單一急性毒性

表1所示為Cu2+等5種金屬對(duì)萼花臂尾輪蟲24 h的LC50值和金屬濃度對(duì)數(shù)與死亡機(jī)率單位的線性回歸方程。由表可見，該5種金屬對(duì)萼花臂尾輪蟲的毒性大小依次為Cu2+>Cd2+>Zn2+> Cr6+>Mn2+。

2.2 Cu2+、Zn2+、Cd2+、Cr6+和Mn2+5種金屬對(duì)萼花臂尾輪蟲的二元聯(lián)合急性毒性

表2所示為Cu2+等5種金屬等毒性和等濃度配比情況下二元聯(lián)合對(duì)萼花臂尾輪蟲24 h的LC50值和依據(jù)公式(1)判別的聯(lián)合作用效應(yīng)。由表可知，等毒性配比的Cu2+-Cr6+(0.00385-10.806 mg·L-1)和等濃度配比的Cu2+-Zn2+(0.0199-0.0199 mg·L-1)、Cu2+-Cd2+(0.0181-0.0181 mg·L-1)、Cu2+-Cr6+(0.0118-0.0118 mg·L-1)、Zn2+-Cd2+(3.475-3.475 mg·L-1)二元聯(lián)合測(cè)試液的作用結(jié)果顯示為拮抗效應(yīng)，其余二元聯(lián)合測(cè)試液的作用結(jié)果則均顯示是協(xié)同效應(yīng)。

2.3 Cu2+、Zn2+、Cd2+、Cr6+和Mn2+5種金屬對(duì)萼花臂尾輪蟲的三元聯(lián)合急性毒性

表3所示為Cu2+等5種金屬等毒性和等濃度配比情況下三元聯(lián)合對(duì)萼花臂尾輪蟲24 h的LC50值和依據(jù)公式(1)判別的聯(lián)合作用效應(yīng)。由表可知，等毒性配比的Cu2+-Cr6+-Mn2+(0.00210-5.902-22.981 mg·L-1)和等濃度配比的Cu2+-Cd2+-Mn2+(0.00727-0.00727-0.00727 mg·L-1)三元聯(lián)合測(cè)試液的作用結(jié)果顯示為拮抗效應(yīng)，其余三元聯(lián)合測(cè)試液的作用結(jié)果則均顯示是協(xié)同效應(yīng)。

2.4 Cu2+、Zn2+、Cd2+、Cr6+和Mn2+5種金屬對(duì)萼花臂尾輪蟲的四元聯(lián)合急性毒性

表4所示為Cu2+等5種金屬等毒性和等濃度配比情況下四元聯(lián)合對(duì)萼花臂尾輪蟲24 h LC50值和依據(jù)公式(1)判別的聯(lián)合作用效應(yīng)。由表可見，等濃度配比的Cu2+-Zn2+-Cd2+-Cr6+(0.00907-0.00907-0.00907-0.00907mg·L-1)、Cu2+-Zn2+-Cd2+-Mn2+(0.00898-0.00898-0.00898-0.00898 mg·L-1)、Cu2+-Zn2+-Cr6+-Mn2+(0.00819-0.00819-0.00819-0.00819 mg ·L-1)四元聯(lián)合測(cè)試液的作用結(jié)果顯示為拮抗效應(yīng)，其余四元聯(lián)合測(cè)試液的作用結(jié)果則均顯示是協(xié)同效應(yīng)。

2.5 Cu2+、Zn2+、Cd2+、Cr6+和Mn2+5種金屬對(duì)萼花臂尾輪蟲的五元聯(lián)合急性毒性

表5所示為Cu2+等5種金屬等毒性和等濃度配比情況下五元聯(lián)合對(duì)萼花臂尾輪蟲24 h的LC50值和依據(jù)公式(1)判別的聯(lián)合作用效應(yīng)。由表可見，Cu2+-Zn2+-Cd2+-Cr6+-Mn2+等毒性(0.00074-1.520-0.348-2.082-8.107 mg·L-1)和等濃度(0.00582-0.00582-0.00582-0.00582-0.00582 mg·L-1)配比的五元聯(lián)合測(cè)試液作用結(jié)果均顯示是協(xié)同效應(yīng)。

3 討論（Discussion）

該5種重金屬中，除Mn2+以外，其余4種重金屬對(duì)萼花臂尾輪蟲的單一急性毒性均已有報(bào)道[13-15]，所得結(jié)果不盡相同。Snell等[13]采用休眠卵萌發(fā)獲取受試個(gè)體(齡長(zhǎng)2 h內(nèi)的幼體)，實(shí)驗(yàn)得到的Cu2+、Zn2+和Cd2+對(duì)萼花臂尾輪蟲的24 h LC50分別為0.026 mg·L-1、1.3 mg·L-1和0.81 mg·L-1；趙含英等[14]從預(yù)培養(yǎng)體系中隨機(jī)吸取不帶卵的個(gè)體，實(shí)驗(yàn)期間投喂1.0×106cell·mL-1的蛋白核小球藻，得到的Cu2+、Zn2+和Cd2+對(duì)萼花臂尾輪蟲的24 h LC50分別為0.06 mg·L-1、1.69 mg·L-1和1.49 mg·L-1；Sarma等[15]選取的也是輪蟲幼體(具體齡長(zhǎng)沒有標(biāo)明)，實(shí)驗(yàn)期間不投喂食物，得到的Cd2+和Cr6+對(duì)萼花臂尾輪蟲的24 h LC50分別為0.18 mg·L-1和17.4 mg·L-1。筆者認(rèn)為實(shí)驗(yàn)條件的不同，如齡長(zhǎng)、喂食與否等，是導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果不盡相同的主要原因。但是，無(wú)論差異多大，該幾種金屬對(duì)輪蟲的毒性的大小順序的結(jié)論基本是一致的，即Cu2+>Cd2+>Zn2+>Cr6+。Mn2+對(duì)萼花臂尾輪蟲的LC50值明顯大于上述4個(gè)重金屬，因此，它對(duì)萼花臂尾輪蟲的毒性是這5種金屬中最小的。

表1 Cu2+、Zn2+、Cd2+、Cr6+和Mn2+對(duì)萼花臂尾輪蟲24 h的單一毒性Table 1 The 24 h single toxicity of Cu2+,Zn2+,Cd2+,Cr6+,and Mn2+toBrachionus calyciflorus

在單一污染物暴露下，毒物對(duì)生物體的毒性效應(yīng)基本上決定于毒物本身的理化性質(zhì)和暴露時(shí)的濃度水平[21]。在復(fù)合污染的條件下，除了混合物組成各成分的理化性質(zhì)以外，各組分的濃度也起到了至關(guān)重要的作用[3]。但是，到底是各成分的污染物濃度還是混合物濃度配比關(guān)系決定了混合物聯(lián)合作用的毒性還有爭(zhēng)論。周啟星等[22]認(rèn)為污染物本身的化學(xué)性質(zhì)對(duì)復(fù)合污染生態(tài)效應(yīng)所起的作用，要比其濃度組合關(guān)系的影響小得多，污染物暴露的濃度組合關(guān)系對(duì)毒性的影響更為直接，在一定條件下甚至起決定作用。但是，縱觀本研究的結(jié)果，在多元聯(lián)合毒性測(cè)試的26組(二元組合10組，三元組合10組，四元組合5組，五元組合1組)中，有18組在等濃度和等毒性不同配比時(shí)表現(xiàn)出來(lái)的聯(lián)合毒性效應(yīng)是一致的，即濃度組合關(guān)系(等毒性和等濃度實(shí)質(zhì)上就是混合物各組分濃度組合關(guān)系的不同)的變動(dòng)在多數(shù)情況下并未造成聯(lián)合毒性效應(yīng)的變化。因此，污染物暴露的濃度組合關(guān)系在聯(lián)合毒性效應(yīng)評(píng)價(jià)中的作用可能還要依具體情況而定，不可一概而論。

表2 Cu2+ 、Zn2+ 、Cd2+ 、Cr6+和Mn2+二元混合物對(duì)萼花臂尾輪蟲24 h 的聯(lián)合毒性Table 2 The 24 h combined toxicity of binary mixture of Cu2+ , Zn2+ , Cd2+ , Cr6+ , and Mn2+ to Brachionus calyciflorus

表3 Cu2+ 、Zn2+ 、Cd2+ 、Cr6+和Mn2+三元混合物對(duì)萼花臂尾輪蟲24 h 的聯(lián)合毒性Table 3 The 24 h combined toxicity of ternary mixture of Cu2+ , Zn2+ , Cd2+ , Cr6+ , and Mn2+ to Brachionus calyciflorus

344 生態(tài)毒理學(xué)報(bào)第11 卷表4 Cu2+ 、Zn2+ 、Cd2+ 、Cr6+和Mn2+四元混合物對(duì)萼花臂尾輪蟲24 h 的聯(lián)合毒性Table 4 The 24 h combined toxicity of quaternary mixture of Cu2+ , Zn2+ , Cd2+ , Cr6+ , and Mn2+ to Brachionus calyciflorus

表5 Cu2+ 、Zn2+ 、Cd2+ 、Cr6+和Mn2+五元混合物對(duì)萼花臂尾輪蟲24 h 的聯(lián)合毒性Table 5 The 24 h combined toxicity of pentabasic mixture of Cu2+ , Zn2+ , Cd2+ , Cr6+ ,and Mn2+ to Brachionus calyciflorus

本研究中，Cu2+-Zn2+、Cu2+-Cd2+、Zn2+-Cd2+、Cu2+-Cd2+-Mn2+、Cu2+-Zn2+-Cd2+-Cr6+、Cu2+-Zn2+-Cd2+-Mn2+、Cu2+-Zn2+-Cr6+-Mn2+等測(cè)試組等毒性配比對(duì)萼花臂尾輪蟲的聯(lián)合毒性作用是協(xié)同效應(yīng)，等濃度配比則是拮抗效應(yīng)。如果不考慮混合物中金屬之間可能發(fā)生的物理化學(xué)作用，等毒性配比時(shí)，各組成成分具有相同的急性致死效應(yīng)，最終聯(lián)合毒性表現(xiàn)為協(xié)同或者相加效應(yīng)不難理解；而等濃度配比時(shí)，混合物的濃度主要由毒性較大的重金屬?zèng)Q定，而毒性較小的重金屬往往處于一個(gè)較低的濃度水平，這時(shí)它們會(huì)表現(xiàn)出何種毒性效應(yīng)將決定最終混合物聯(lián)合毒性效應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，低濃度水平的重金屬如Cd2+、Zn2+等對(duì)萼花臂尾輪蟲并無(wú)急性致死作用，有時(shí)甚至?xí)l(fā)生類似毒物興奮效應(yīng)(hormesis)——刺激輪蟲種群增長(zhǎng)的現(xiàn)象[5,23]。所以，等濃度配比時(shí)，一種情況是處于較低濃度的毒性較小的重金屬依然表現(xiàn)出了一定急性致死作用，那么最終混合物聯(lián)合毒性效應(yīng)將會(huì)是協(xié)同效應(yīng)；相反，如果它們表現(xiàn)出了不影響甚至刺激輪蟲生長(zhǎng)的作用時(shí)，最終混合物聯(lián)合毒性效應(yīng)則很可能就會(huì)是拮抗效應(yīng)。因此我們認(rèn)為，上述測(cè)試組在等濃度配比時(shí)各組分表現(xiàn)出來(lái)毒性作用不相一致，并最終導(dǎo)致了拮抗效應(yīng)的出現(xiàn)。

資料顯示，復(fù)合污染中的協(xié)同效應(yīng)是各毒物之間聯(lián)合作用的主要表現(xiàn)形式[24]。本研究中，協(xié)同作用共有42例，拮抗作用10例，分別占總數(shù)的81%和19%，協(xié)同作用占大多數(shù)。研究發(fā)現(xiàn)，混合物中各組分作用機(jī)理和作用位點(diǎn)的差異會(huì)導(dǎo)致聯(lián)合毒性效應(yīng)的不同[25-26]。同時(shí)，重金屬會(huì)在生物體不同的組織部位積累，重金屬與重金屬之間、重金屬與生物體內(nèi)各種組分之間都有可能發(fā)生不同的交互作用，導(dǎo)致不同的生態(tài)毒理效應(yīng)[22]。雖然目前還沒有該5種重金屬對(duì)輪蟲致毒機(jī)理的報(bào)道，但如前所述，該5種重金屬分屬不同類別，有理由相信它們對(duì)輪蟲的毒性作用機(jī)理會(huì)存在差異，據(jù)此我們推測(cè)，該5種重金屬對(duì)輪蟲致毒機(jī)理的差異是導(dǎo)致混合物聯(lián)合毒性效應(yīng)不同的根本原因。其次，我們認(rèn)為，混合物(特別是3元以上混合物)中，各組分對(duì)最終呈現(xiàn)的毒性效應(yīng)的貢獻(xiàn)是不一樣的，在出現(xiàn)協(xié)同效應(yīng)的處理組中，毒性貢獻(xiàn)大的組分之間在其對(duì)輪蟲致毒過(guò)程中應(yīng)該是相互不干擾的，或者至少它們之間沒有發(fā)生相互抑制或競(jìng)爭(zhēng)作用位點(diǎn)的效應(yīng)；相反，拮抗效應(yīng)的出現(xiàn)則意味著這該組混合物中，起決定作用的組分在對(duì)輪蟲致毒過(guò)程中出現(xiàn)了不相一致的毒性效應(yīng)(如前所述)，或者類似競(jìng)爭(zhēng)作用位點(diǎn)情況，例如共存的金屬離子導(dǎo)致了對(duì)方作用位點(diǎn)的可結(jié)合性降低，從而減弱了對(duì)方的毒性[27]。在某一混合物處理組中，究竟是哪一個(gè)或哪一些組分發(fā)揮的毒性作用貢獻(xiàn)大，各組分在最終毒性效應(yīng)中的作用分別是怎樣的，是非常值得進(jìn)一步研究的，這對(duì)闡釋混合物聯(lián)合毒性效應(yīng)的機(jī)理非常關(guān)鍵。

除了配比方式以外，暴露時(shí)間的不同和測(cè)試物種的不同也可能影響重金屬聯(lián)合毒性作用的評(píng)判結(jié)果[28]。研究表明，隨著等毒性配比的Zn2+-Cd2+聯(lián)合作用時(shí)間的延長(zhǎng)，其對(duì)斑馬魚(Brachynanio rerio)的聯(lián)合急性毒性是先協(xié)同后拮抗[29]，而對(duì)草魚(Ctenopharyngodon idellus)則是先拮抗后協(xié)同[30]，本研究中，由于實(shí)驗(yàn)過(guò)程中是不添加食物的，而輪蟲的耐饑餓時(shí)間較短，為了避免饑餓的影響，因此沒有延長(zhǎng)暴露時(shí)間進(jìn)行研究。一般說(shuō)來(lái)，就單一金屬暴露而言，生物體與毒物接觸的時(shí)間越長(zhǎng)，其受到的傷害也就越大[31]。但是，暴露時(shí)間的延長(zhǎng)是否會(huì)影響多金屬對(duì)輪蟲的聯(lián)合急性毒性效應(yīng)還需要開展進(jìn)一步的研究驗(yàn)證。等濃度的Cu2+-Zn2+、Cu2+-Cd2+對(duì)于萼花臂尾輪蟲產(chǎn)生的是拮抗效應(yīng)(本研究)，對(duì)大型溞(Daphnia magna)卻均是協(xié)同效應(yīng)[32-33]；同樣，等濃度的Zn2+-Cd2+對(duì)于萼花臂尾輪產(chǎn)生的是拮抗效應(yīng)(本研究)，對(duì)水螅(Hydrasp.)產(chǎn)生的卻是協(xié)同效應(yīng)[34]，測(cè)試生物不同帶來(lái)的聯(lián)合效應(yīng)的差異可以理解為：不同的生物的具有不同的生理結(jié)構(gòu)、代謝途徑和應(yīng)激反應(yīng)系統(tǒng)，使得不同生物種類面臨同一類型的復(fù)合污染脅迫，產(chǎn)生了不同的生態(tài)毒理效應(yīng)[22]。

綜上所述，可以得出以下結(jié)論：(1)Cu2+、Cd2+、Zn2+、Cr6+和Mn2+等5種重金屬對(duì)萼花臂尾輪蟲24 h單一急性毒性大小依次：Cu2+>Cd2+>Zn2+>Cr6+> Mn2+；(2)多數(shù)情況下，相同組分等毒性和等濃度配比對(duì)輪蟲的聯(lián)合毒性效應(yīng)是一致的，少數(shù)組出現(xiàn)差異的原因是由于混合物中不同組分產(chǎn)生的毒性效應(yīng)不相一致所致；(3)協(xié)同效應(yīng)是聯(lián)合毒性效應(yīng)的主要表現(xiàn)形式，各組分對(duì)輪蟲致毒機(jī)理的差異可能是導(dǎo)致混合物產(chǎn)生不同聯(lián)合毒性效應(yīng)的根本原因。因此，對(duì)于致毒機(jī)理不盡相同的重金屬混合物而言，在評(píng)價(jià)其聯(lián)合毒性效應(yīng)時(shí)都需進(jìn)行具體的實(shí)驗(yàn)研究后方可定論，不能簡(jiǎn)單由單一金屬毒性相加來(lái)判斷其毒性[29,35]。此外，本研究得出的Cu2+、Zn2+、Cd2+、Cr6+和Mn2+等5種常見金屬對(duì)萼花臂尾輪蟲的聯(lián)合毒性數(shù)據(jù)，特別是有Cr6+和Mn2+參與的聯(lián)合毒性結(jié)果乃是首次得出，不僅豐富了輪蟲生態(tài)毒理學(xué)研究的基礎(chǔ)資料，同時(shí)也為開展評(píng)價(jià)水體重金屬?gòu)?fù)合污染的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)提供了理論數(shù)據(jù)和科學(xué)參考。

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Combined Acute Toxicities of Cu2+，Zn2+，Cd2+，Cr6+，and Mn2+to Freshwater Rotifer Brachionus calyciflorus Pallas

Xu Xiaoping1,2,Xi Yilong1,*,Huang Lin1

1.Collaborative Innovation Center of Recovery and Reconstruction of Degraded Ecosystem in Wanjiang City Belt,College of Life Sciences,Anhui Normal University,Wuhu 241000,China
2.College of Civil Engineering and Architecture,Anhui Polytechnic University,Wuhu 241000,China

21 September 2015 accepted 27 November 2015

Rotifers are one of the important groups of zooplankton in freshwater ecosystem and are recognized as ideal bioassay animals for toxicity tests because of their small size,short generation time,and rapid reproduction rate.In order to investigate the toxic effects of combined pollution of heavy metal on the rotifers,the 24 h combined acute toxicities of Cu2+,Zn2+,Cd2+,Cr6+,and Mn2+toBrachionus calycifloruswere evaluated using the additive index of coeffects for aquatic toxicology.The 24 h single toxicity test showed that the median lethal concentrations(LC50)of Cu2+,Zn2+,Cd2+,Cr6+,and Mn2+toB.calycifloruswere 0.00616 mg·L-1,12.62 mg·L-1,2.89 mg· L-1,17.29 mg·L-1,and 67.32 mg·L-1,respectively.The 24 h combined acute toxicity of Cu2+-Cr6+(0.00385-10.806 mg·L-1)was antagonism when the toxicity ratio of the two was 1:1,which is similar to the Cu2+-Zn2+(0.0199-0.0199 mg·L-1)，Cu2+-Cd2+(0.0181-0.0181 mg·L-1)，Cu2+-Cr6+(0.0118-0.0118 mg·L-1),and Zn2+-Cd2+(3.475-3.475 mg·L-1)combinedat the concentration ratio of 1:1.The actions of the other binary mixtures were all synergism regardless of the combined pattern.Both the 24 h combined acute toxicities of Cu2+-Cr6+-Mn2+(0.00210-5.902-22.981 mg·L-1)and Cu2+-Cd2+-Mn2+(0.00727-0.00727-0.00727 mg·L-1)were antagonism when combined at the toxicity ratio of 1:1:1 and the concentration ratio of 1:1:1,respectively.The actions of the other ternary mixtures were all synergism.At the concentration ratio of 1:1:1:1,the 24 h acute combined toxicities of Cu2+-Zn2+-Cd2+-Cr6+(0.00907-0.00907-0.00907-0.00907 mg·L-1),Cu2+-Zn2+-Cd2+-Mn2+(0.00898-0.00898-0.00898-0.00898 mg·L-1), and Cu2+-Zn2+-Cr6+-Mn2+(0.00819-0.00819-0.00819-0.00819 mg·L-1)were all antagonism.The actions of the other quaternary mixture were all synergism.The 24 h combined acute toxicities of the Cu2+-Zn2+-Cd2+-Cr6+-Mn2+were synergism when combined at the toxicity ratio of 1:1:1:1:1(0.00074-1.520-0.348-2.082-8.107 mg·L-1)and the concentration ratio of 1:1:1:1:1(0.00582-0.00582-0.00582-0.00582-0.00582 mg·L-1).The present results indicated that the pattern of combination should be fully considered when evaluating the combined acute toxicity of metal mixtures.

heavy metals;Brachionus calyciflorus;combined toxicity;acute toxicity

2015-09-21 錄用日期：2015-11-27

1673-5897（2016）3-338-10

X171.5

A

10.7524/AJE.1673-5897.20150921002

簡(jiǎn)介：席貽龍(1965-)，男，理學(xué)博士，教授，主要研究方向?yàn)楦∮蝿?dòng)物生態(tài)和水生態(tài)毒理學(xué)，發(fā)表學(xué)術(shù)論文140余篇。

國(guó)家自然科學(xué)基金(31470015)；安徽省高校生物環(huán)境與生態(tài)安全省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室專項(xiàng)基金(2004sys003)；安徽省高等學(xué)校自然科學(xué)研究重點(diǎn)項(xiàng)目(KJ2016A063)

徐曉平(1979-)，男，博士，研究方向?yàn)樗鷳B(tài)毒理學(xué)，E-mail:xuxp1979@126.com

*通訊作者（Corresponding author），E-mail:ylxi1965@126.com