甘妙平，李劍峰，鄭燕深

(惠州市中心人民醫(yī)院泌尿外科，廣東惠州　516001)

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·臨床研究·

腎癌組織中線粒體融合蛋白2基因的表達(dá)及臨床意義

甘妙平，李劍峰，鄭燕深

(惠州市中心人民醫(yī)院泌尿外科，廣東惠州516001)

目的檢測(cè)腎細(xì)胞癌線粒體融合蛋白-2(Mfn2)基因表達(dá)的變化，探討其相關(guān)的臨床意義。方法選取我院2014年2月至2016年1月收治的腎細(xì)胞癌患者74例，另取同期我院腎小球活檢排除腎癌者30例作為對(duì)照組。Mfn2基因表達(dá)量使用熒光定量PCR檢測(cè)。結(jié)果Mfn2在腎癌組織中表達(dá)量為0.182±0.031，顯著低于對(duì)照腎組織的0.325±0.047(P<0.01)。腎癌組織中男女性別、不同年齡以及腫瘤病理類型之間Mfn2表達(dá)量無(wú)顯著性差異(P>0.05)。Ⅲ、Ⅳ臨床分期患者M(jìn)fn2表達(dá)量為0.146±0.029，顯著低于Ⅰ、Ⅱ臨床分期患者的0.212±0.038(P<0.05)。腫瘤有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者M(jìn)fn2表達(dá)量為0.151±0.024，顯著低于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的0.228±0.042(P<0.05)。腫瘤中、低分化患者M(jìn)fn2表達(dá)量為0.154±0.028，顯著低于高分化患者的0.231±0.051(P<0.05)。結(jié)論Mfn2基因在腎癌組織中低表達(dá)，Mfn2基因表達(dá)量與腎癌的臨床分期、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及腫瘤分化程度密切相關(guān)。

腎癌；線粒體融合蛋白-2基因；熒光定量PCR

腎細(xì)胞癌是泌尿系統(tǒng)見(jiàn)的惡性腫瘤，腎臟位置隱蔽，患者就診時(shí)往往已經(jīng)發(fā)展到中、晚期，錯(cuò)過(guò)了最佳治療時(shí)間，腫瘤分子標(biāo)志物對(duì)腫瘤的早期診斷具有潛在的應(yīng)用價(jià)值，越來(lái)越多的腫瘤標(biāo)記物研究倍受關(guān)注[1]。線粒體融合蛋白-2(mitofusion2，Mfn2)是定位于線粒體外膜上的跨膜三磷酸鳥苷(guanosine triphosphate， GTP) 酶類蛋白，主要介導(dǎo)線粒體融合[2]，還參與細(xì)胞的能量代謝、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、增殖及凋亡等細(xì)胞生物學(xué)過(guò)程，并且對(duì)多種腫瘤細(xì)胞都具有抗增殖和誘導(dǎo)凋亡的作用[3]。本研究檢測(cè)了腎細(xì)胞癌Mfn2基因表達(dá)的變化，探討相關(guān)的臨床意義。

1　資料與方法

1.1臨床資料選取我院2014年2月至2016年1月收治的腎細(xì)胞癌患者74例，所有病例均經(jīng)病理證實(shí)，排除標(biāo)準(zhǔn)：接受過(guò)放療、化療或其他腫瘤相關(guān)治療者，伴發(fā)其它臟器腫瘤者。其中男48例，女26例；年齡36～74歲，平均(58.7±11.2)歲；病理類型為腎透明細(xì)胞癌53例，乳頭狀腎細(xì)胞癌21例；TMN分期：T1期16例、T2期25例、T3期18例、T4期15例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移44例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移30例；高分化腫瘤27例，中、低分化腫瘤47例。另取同期我院腎小球活檢排除腎癌者30例作為對(duì)照組，其中男19例，女11例；年齡33～71歲，平均(57.3±11.1)歲。腎癌組和對(duì)照組在性別、年齡方面統(tǒng)計(jì)學(xué)無(wú)顯著性差異，具有可比性(P>0.05)。

1.2主要試劑和儀器RNA(ribonucleicacid)提取試劑盒購(gòu)自大連寶生物公司，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司， SYBR Green 熒光定量-PCR試劑盒購(gòu)自深圳華大基因有限公司，Nucleostemin基因引物由上海金斯瑞公司合成，Mfn2基因引物序列為5’- GTTAAGGCCGCTAAGGCCTTAAGCG-3’(上游)和5’- AGTCGGTTTAAAGCTGCCGCCGGT-3’(下游)。PCR儀和熒光定量PCR儀為美國(guó)羅氏公司生產(chǎn)。

1.3Mfn2基因表達(dá)的檢測(cè)熒光定量PCR檢測(cè)Mfn2基因的表達(dá)，取50 mg腎臟組織，超聲組織勻漿，按照RNA提取試劑盒和反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書提取組織細(xì)胞總RNA和反轉(zhuǎn)錄出cDNA第一條鏈，按照熒光定量-PCR試劑盒說(shuō)明書，加入PCR反應(yīng)MIX、引物和SYBR Green等建立反應(yīng)體系，94℃變性4 min，然后進(jìn)行30個(gè)PCR循環(huán)：94 ℃ 30 s，62 ℃ 45 s，72 ℃ 30 s，最后72℃ 5 min。參照內(nèi)對(duì)照基因，利用軟件計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量，Mfn2基因的相對(duì)表達(dá)量用(2-ΔCt)表示。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS13.0軟件進(jìn)行分析，兩組樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)　果

2.1Mfn2表達(dá)量的變化與腎癌的臨床、病理參數(shù)的關(guān)系腎癌組織中不同性別、年齡以及腫瘤病理類型之間Mfn2表達(dá)量無(wú)顯著性差異(P>0.05)。Ⅲ、Ⅳ臨床分期患者M(jìn)fn2表達(dá)量顯著低于Ⅰ、Ⅱ臨床分期患者。腫瘤有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者M(jìn)fn2表達(dá)量顯著低于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者。腫瘤中、低分化患者M(jìn)fn2表達(dá)量顯著低于高分化患者(P<0.05,表1)。

表1　不同臨床類型腎癌組織中Mfn2表達(dá)量的變化±s)

2.2Mfn2在腎癌組織中的表達(dá)Mfn2在腎癌組織中表達(dá)量顯著低于對(duì)照組(P<0.01，表2)。

表2　Mfn2在腎癌和腎組織中表達(dá)量的比較±s)

3　討　論

與眾多腫瘤相似，近年我國(guó)腎細(xì)胞癌的發(fā)病率正在逐年上升[4]，探討腎癌的發(fā)病原因和機(jī)制對(duì)于患者早期診斷、臨床治療和隨訪具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程涉及到多種基因的失活或激活，這些異常的基因表達(dá)往往早于影像學(xué)的異常，可以成為一些腫瘤分子標(biāo)志物[5]。Mfn2是一種高度保守的跨膜 GTP 酶類，廣泛表達(dá)于心、腎、骨骼肌、肝、腦等組織器官，尤以心、腎和腦最為豐富[6]，近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)其與腫瘤細(xì)胞的增值和凋亡關(guān)系密切，例如Mfn2可結(jié)合Ras蛋白，失活下游的Raf和 ERK1/2；降低 Rb 磷酸化水平使細(xì)胞周期停滯于 G0/G1 期；促進(jìn)細(xì)胞色素 c、細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)因子等多種凋亡相關(guān)蛋白的釋放[7]。肖海濤等[8]使用甲基硒酸升高M(jìn)fn2基因表達(dá)后，發(fā)現(xiàn)可以顯著抑制腎癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，在本研究中，Mfn2基因在腎癌患者中的表達(dá)量顯著低于對(duì)照非腎癌組織標(biāo)本，上述結(jié)果提示了Mfn2基因的低表達(dá)可能參與了腎癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程。

腫瘤的惡性進(jìn)展、侵襲和轉(zhuǎn)移也是一個(gè)復(fù)雜、多因素參與的過(guò)程，白云等[9]在膀胱癌的研究中發(fā)現(xiàn)Mfn2基因低表達(dá)調(diào)節(jié)了腫瘤的惡性進(jìn)展，與腫瘤的分化和臨床分期密切相關(guān)，本研究在腎癌組織的檢測(cè)也觀察到了Mfn2基因表達(dá)量在臨床Ⅲ、Ⅳ期患者顯著低于Ⅰ、Ⅱ期患者，提示了Mfn2基因表達(dá)量的檢測(cè)可用于腎癌患者的預(yù)后評(píng)估。比較Mfn2基因表達(dá)量在腎癌分級(jí)中的差異發(fā)現(xiàn)，Mfn2基因表達(dá)量在中、低分化患者顯著低于高分化患者，提示了Mfn2基因低表達(dá)或失活會(huì)促進(jìn)腎癌細(xì)胞的惡性表形。另外在腎癌組織的檢測(cè)中也觀察到了Mfn2基因表達(dá)量在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者中顯著低于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者，提示了Mfn2基因表達(dá)下調(diào)參與了腎癌的侵襲和轉(zhuǎn)移。

綜上所述，本研究顯示Mfn2基因在腎癌組織中低表達(dá)，Mfn2基因表達(dá)量與腎癌的臨床分期、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及腫瘤分化程度密切相關(guān)，Mfn2基因表達(dá)量的檢測(cè)有可能成為腎癌臨床分級(jí)、預(yù)后評(píng)估以及基因靶向治療的新分子標(biāo)記物。

[1] SRINIVASAN R, RICKETTS CJ, SOURBIER C, et al. New strategies in renal cell carcinoma: targeting the genetic and metabolic basis of disease[J]. Clin Cancer Res, 2015, 21(1):10-17.

[2] 趙光舉, 盧中秋, 姚詠明. 線粒體融合蛋白2研究新進(jìn)展[J]. 生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展, 2010, 37(3):252-260.

[3] CHEN KH, DASGUPTA A, DING J, et al. Role of Mitofusin 2(Mfn2) in controlling cellular proliferation[J]. FASEB J, 2014, 28(2):382-394.

[4] 陳萬(wàn)青, 鄭榮壽, 張思維, 等. 2012 年中國(guó)惡性腫瘤發(fā)病和死亡分析[J]. 中國(guó)腫瘤, 2016, 25(1):1-8.

[5] SU D, SINGER EA, SRINIVASAN R. Molecular pathways in renal cell carcinoma: recent advances in genetics and molecular biology[J]. Curr Opin Oncol, 2015, 27(3):217-223.

[6] 朱學(xué)敏, 孟慶華. 線粒體融合蛋白-2的功能[J]. 北京醫(yī)學(xué), 2015, 37(12):1177-1179.

[7] 周立艷, 邱梅清, 賈勇圣, 等. 線粒體融合素基因-2與腫瘤[J]. 中國(guó)腫瘤生物治療雜志, 2013, 20(6):735-738.

[8] 肖海濤,羅明俊,張永春,等.甲基硒酸抑制腎癌細(xì)胞生長(zhǎng)及與線粒體融合蛋白2關(guān)系的研究[J].貴州醫(yī)藥,2012,36(8):679-682.

[9] 白云, 熊艷杰, 楊文平, 等. 膀胱癌組織中線粒體融合蛋白2基因表達(dá)及意義[J]. 山東醫(yī)藥, 2016, 56(12):36-38.

(編輯何宏靈)

Expression and clinical significance of Mitofusion 2 mRNA in renal cell carcinoma

GAN Miao-ping, LI Jian-feng, ZHENG Yan-shen

(Department of Urology, People’s Central Hospital of Huizhou, Huizhou 516001,China)

ObjectiveTo detect mitofusion 2 (Mfn2) mRNA expression in renal cell carcinoma (RCC) and to explore its clinical significance. MethodsA total of 74 RCC cases and another 30 non-RCC controls were enrolled in this study. Real-time PCR was used to detect Mfn2 mRNA expression. ResultsMfn2 mRNA expression was 0.182±0.031vs. 0.325±0.047 in RCC cases and controls (P<0.01). There were no statistical differences in Mfn2 mRNA expression between RCC patients of different gender, age, and pathological type (P>0.05). Mfn2 mRNA expression was 0.146±0.029 in Ⅲ and Ⅳ stage and 0.212±0.038 in I and II stage (P<0.05). Mfn2 mRNA expression was 0.151±0.024vs. 0.228±0.042 in lymph node metastasis group and non-lymph node metastasis group (P<0.05). Mfn2 mRNA expression was 0.154±0.028vs. 0.231±0.051 in median and low differentiation group, and well differentiation group (P<0.05). ConclusionLow expression of Mfn2 mRNA was detected in RCC, which was closely related to clinical stage, lymph node metastasis, and tumor differentiation.

renal cell carcinoma; Mfn2 mRNA; real-time PCR

2016-05-04

2016-05-25

甘妙平(1983-)，男(漢族)，大學(xué)本科，主治醫(yī)師.研究方向：泌尿腫瘤的防治.E-mail：wangmingqiang2003@163.com

R737.11

A

10.3969/j.issn.1009-8291.2016.09.005