王田林，梁新紅，孫俊良，莫海珍，周蒙

（河南科技學(xué)院食品學(xué)院，河南新鄉(xiāng)453003）

響應(yīng)面法優(yōu)化木瓜蛋白酶提取工藝

王田林，梁新紅，孫俊良*，莫海珍，周蒙

（河南科技學(xué)院食品學(xué)院，河南新鄉(xiāng)453003）

采用新鮮的番木瓜為原料，探究超濾法提取木瓜蛋白酶的最佳工藝條件，選定L-cys、EDTA、溫度、壓力、時(shí)間、物料濃度6個(gè)因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)，確定超濾法提取木瓜蛋白酶的較佳工藝條件，其中L-cys和EDTA為木瓜蛋白酶的保護(hù)劑，其濃度分別在0.04 mol/L和0.002 mol/L時(shí)對(duì)木瓜蛋白酶的酶活性保護(hù)最強(qiáng)。選定超濾過程中的溫度、壓力、時(shí)間、物料濃度4個(gè)條件進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，建立數(shù)學(xué)模型，然后回歸分析，模型評(píng)價(jià)，結(jié)果表明超濾法提取木瓜蛋白酶的最佳條件為：溫度55℃，壓力0.25 MPa，時(shí)間3.7 min，物料濃度30%，此時(shí)酶活性大小為（9.31±0.27）萬單位/mg，與模型驗(yàn)證的酶活性9.355萬單位/mg非常接近。說明響應(yīng)面法能較好的用于木瓜蛋白酶提取工藝的優(yōu)化。

木瓜蛋白酶；超濾；響應(yīng)面分析

木瓜蛋白酶是一類半胱氨酸蛋白酶，又可以稱為木瓜酶，儲(chǔ)藏在番木瓜的果實(shí)和根、莖、葉內(nèi)，在未成熟的乳汁中含量最為豐富［1-2］。它也屬于一種蛋白水解酶，分子量為27 000 u，由一種單肽鏈組成，含有212個(gè)氨基酸殘基，至少有3個(gè)氨基酸殘基存在于酶的活性中心部位，他們分別是Cys25、His159和Asp158，六個(gè)半胱氨酸殘基形成了三對(duì)二硫鍵，但都不存在酶活性部位［3］。木瓜蛋白酶的結(jié)構(gòu)組成決定了其有較強(qiáng)的合成能力和蛋白酶水解能力，具有穩(wěn)定性好、耐高溫、活性強(qiáng)的特點(diǎn)［4］，此外還具有溶菌活力、解脂和凝乳等優(yōu)點(diǎn)。由于木瓜蛋白酶可以進(jìn)行酶促反應(yīng)，利用這一特性，可把大分子的蛋白質(zhì)水解成容易消化吸收的小分子多肽或氨基酸，因此在食品（豆類、肉類食品、啤酒工業(yè)）、輕紡、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用。

木瓜蛋白酶的粗提，是指在種植的番木瓜未成熟果實(shí)中割取乳液去雜，在室溫（20℃～25℃）下加入半胱氨酸溶液，放在研缽里研磨均勻，靜置一段時(shí)間取上清液即為粗制酶，它的水溶液呈混濁狀，然后在離心去雜的上清液中加入（NH4）2SO4分級(jí)分離得沉淀，加入半胱氨酸溶液后經(jīng)鹽析重結(jié)晶干燥得精制酶。木瓜蛋白酶室溫貯存活力穩(wěn)定性與活力高低呈反比，活力越高下降越快。在正常情況下，酶使用時(shí)活力有時(shí)會(huì)下降的主要因素為干燥失重、溫度和空氣氧化。粗制酶酶活比精制酶酶活穩(wěn)定，熱風(fēng)吹干和噴霧干燥的酶酶活比冷凍干燥的酶酶活穩(wěn)定，因此酶的儲(chǔ)存應(yīng)放在低于10℃的環(huán)境中［5-13］。為了防止木瓜蛋白酶失活，可以加入適量保護(hù)劑如EDTA、L-cys、亞硫酸氫鈉、焦亞硫酸鈉等，如果用于醫(yī)藥行業(yè)，則需進(jìn)一步純化，一般采用（NH4）2SO4、Spsephade×柱層析，齊杰等［14］采用的Spsephade×G100凝膠層析則效果更為明顯。

天然的木瓜蛋白酶在極端pH、重金屬離子、高溫等條件下，易遭到破壞，使酶在生產(chǎn)和使用遭到極大的限制。人們對(duì)如何提高酶的活性及其穩(wěn)定性越來越重視。近年來，人們經(jīng)過努力找到了許多木瓜蛋白酶酶的提取方法。如今木瓜蛋白酶提取分離技術(shù)主要有超濾法、鹽析法、親和層析法、絮凝法和有機(jī)溶劑法等。鹽析法提取的木瓜蛋白酶活性較低；有機(jī)溶劑法提取的木瓜蛋白酶易變性以及有機(jī)溶劑殘留問題；絮凝法提取專一性不強(qiáng)，制得的木瓜蛋白酶純度不高；親和層析法提取的酶純度雖然較高，但是操作復(fù)雜，不易在工業(yè)上放大生產(chǎn)，且用于親和層析的前處理液需是經(jīng)過初步純化的酶液［15-20］。相對(duì)來說，超濾法能有效分離提取高純度木瓜蛋白酶。其原因是由于超濾法易于連續(xù)化操作，目標(biāo)產(chǎn)物有較高的收率，分離過程經(jīng)濟(jì)等優(yōu)勢(shì)，因此被廣泛應(yīng)用［21］。本試驗(yàn)首先驗(yàn)證了兩種保護(hù)劑（L-cys和EDTA）在超濾法提取木瓜蛋白酶工藝中的作用，然后采用響應(yīng)面法優(yōu)化超濾法提取木瓜蛋白酶工藝的參數(shù)（提取時(shí)間、提取溫度、物料濃度、壓力），為木瓜蛋白酶提取產(chǎn)量的提高奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料與試劑

番木瓜由水果超市買入（品種：青番木瓜）；木瓜蛋白酶（酶活10 U/mg）：美國(guó)Sigma公司；L-半胱氨酸鹽酸鹽、L-酪氨酸：上海寶曼生物科技有限公司；其他均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2儀器與設(shè)備

Vivaflow型切向流超濾機(jī)：德國(guó)STRTORIOUS公司；全波長(zhǎng)多功能酶標(biāo)儀：美國(guó)賽非默世爾公司；DZKW-4型恒溫水浴鍋：北京中興偉業(yè)儀器有限公司；PHS-3C型精密pH計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司；FA124型電子天平：上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司。

1.3超濾法提取木瓜蛋白酶的工藝

新鮮青番木瓜→取皮切碎→加冰水搗碎→過濾→取濾液離心10 min（10 000 r/min）→取上清液→加入酶活保護(hù)劑→調(diào)pH→靜置預(yù)處理3 h→預(yù)處理液真空抽濾→超濾。

1.4測(cè)定酶的活性

酶活力單位定義：在規(guī)定條件下，1 min內(nèi)酶水解酪蛋白釋放出相當(dāng)于1 μg/mL酪氨酸在275 nm波長(zhǎng)處的吸收度為1個(gè)活力單位。以0.1 mol/L鹽酸溶液作空白，在275 nm波長(zhǎng)處測(cè)定空白溶液，待測(cè)定液，對(duì)照品溶液的吸光度。

酶活力計(jì)算［22］：

按下式計(jì)算酶活力：

每1 mg木瓜蛋白酶活力單位=A/As×Cs×12/2×稀釋倍數(shù)/W（1）

式中：A為待測(cè)定液的吸光度減去空白溶液的吸光度；As為對(duì)照品溶液的吸光度；Cs為酪氨酸對(duì)照品溶液的濃度，μg/mL；W為樣品重量，mg。

木瓜蛋白酶1個(gè)活力單位相當(dāng)于釋放1 μg的酪氨酸。規(guī)定酶濃度為1 mL測(cè)定液釋放40 μg的酪氨酸。

1.5試驗(yàn)設(shè)計(jì)

首先對(duì)木瓜蛋白酶的兩種酶保護(hù)劑L-cys和EDTA的濃度大小設(shè)計(jì)單因素試驗(yàn)，然后再設(shè)計(jì)單因素試驗(yàn)分別對(duì)木瓜蛋白酶提取條件：超濾時(shí)間、壓力、pH、物料濃度（物料質(zhì)量和加水量的百分比）進(jìn)行考察，探究其對(duì)木瓜蛋白酶活性的影響。然后采用響應(yīng)面法優(yōu)化以上4個(gè)因素，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)響應(yīng)面參數(shù)表，試驗(yàn)因素水平表見表1。應(yīng)用Design Expert 7.0軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。

表1　響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平編碼表Table 1Factors and levels of response surface experiment

2結(jié)果與分析

2.1預(yù)處理過程中酶活保護(hù)劑L-cys和EDTA添加量對(duì)木瓜蛋白酶活性的影響

準(zhǔn)確量取一定量的濃度為0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mol/L的L-cys及濃度為0.001、0.002、0.003、0.004、0.005 mol/L的EDTA分別加入到離心后的濾液中，用0.1 mol/L HCl或0.1 mol/L NaOH調(diào)pH至7.0后靜置3 h，抽濾后進(jìn)行超濾，用多功能酶標(biāo)儀在260 nm波長(zhǎng)下測(cè)吸光值按（1）式求酶活。

提取中添加不同濃度L-cys對(duì)木瓜蛋白酶活性的影響見圖1，提取中添加不同濃度EDTA對(duì)木瓜蛋白酶活性的影響見圖2。

圖1　提取中添加不同濃度L-cys對(duì)木瓜蛋白酶活性的影響Fig.1Extraction of adding different concentration of L-cys effect on the activity of papain

圖2　提取中添加不同濃度EDTA對(duì)木瓜蛋白酶活性的影響Fig.2Extracting of adding different concentration of EDTA effect on the activity of papain

從圖1可以看出在預(yù)處理過程中，L-cys濃度為0.04 mol/L，pH為7.0的情況下，EDTA濃度為0.002 mol/L時(shí)對(duì)木瓜蛋白酶活性能起到很好的保護(hù)作用。從圖2可以看出，在預(yù)處理過程中，EDTA濃度0.002 mol/L、pH為7.0的情況下，L-cys添加量為0.04 mol/L時(shí)對(duì)木瓜蛋白酶活性能起到較好的保護(hù)作用。

2.2超濾過程中壓力對(duì)木瓜蛋白酶活性的影響

試驗(yàn)研究超濾過程中預(yù)處理液體積100 mL，其中物料濃度為30%，溫度為50℃，操作壓力分別為0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35 MPa，反應(yīng)時(shí)間為5 min時(shí)對(duì)木瓜蛋白酶活性的影響。提取中不同壓強(qiáng)對(duì)木瓜蛋白酶活性的影響見圖3。

由圖3可知，隨著壓力的增大，木瓜蛋白酶的活性明顯上升，但到了0.25 MPa以后，隨著壓力的繼續(xù)增加，木瓜蛋白酶的活性呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。操作壓力對(duì)超濾結(jié)果影響很大，所以壓力控制在0.25 MPa左右酶的活性最大。

圖3　提取中不同壓強(qiáng)對(duì)木瓜蛋白酶活性的影響Fig.3Extraction in different pressure effect on the activity of papain

2.3超濾過程中溫度對(duì)木瓜蛋白酶活性的影響

試驗(yàn)研究超濾過程中預(yù)處理液體積100 mL，其中物料濃度為30%，操作壓力為0.25 MPa，反應(yīng)溫度分別為35、45、55、65、75、85℃，反應(yīng)時(shí)間為5.5 min時(shí)對(duì)木瓜蛋白酶活性的影響。提取中不同溫度對(duì)木瓜蛋白酶活性的影響見圖4。

圖4　提取中不同溫度對(duì)木瓜蛋白酶活性的影響Fig.4Extract in different temperature effect on the activity of papain

由圖4可知，在超濾過程中，木瓜蛋白酶活性隨著溫度的升高而有所增大，溫度的升高減少了溶劑的粘度從而加大了溶液的滲透能力，但當(dāng)溫度高于55℃，由于過高的溫度能使酶失活，木瓜蛋白酶的活性開始下降。所以溫度控制在55℃左右時(shí)酶的活性最大。

2.4超濾過程中時(shí)間對(duì)木瓜蛋白酶活性的影響

試驗(yàn)研究超濾過程中預(yù)處理液體積100 mL，其中物料濃度為30%，反應(yīng)溫度55℃，操作壓力0.25 MPa，反應(yīng)時(shí)間分別為1.5、2.5、3.5、4.5、5.5、6.5 min時(shí)對(duì)木瓜蛋白酶活性的影響，提取中不同時(shí)間對(duì)木瓜蛋白酶活性的影響見圖5。

由圖5可知，在一定壓力、溫度和物料濃度的情況下，1.5 min～3.5 min之間隨著提取時(shí)間的增加酶活性逐漸增加，3.5 min后隨著時(shí)間的增加酶活緩慢的下降，由此可得超濾時(shí)間控制在3.5 min左右比較合適。

2.4超濾過程中物料濃度對(duì)木瓜蛋白酶活性的影響

圖5　提取中不同時(shí)間對(duì)木瓜蛋白酶活性的影響Fig.5Extraction effect on the activity of papain in a different time

試驗(yàn)研究超濾過程中預(yù)處理液體積100 mL，其中反應(yīng)溫度55℃，操作壓力0.25MPa，反應(yīng)時(shí)間為3.5 min，木瓜蛋白酶液的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為10%、20%、30%、40%、50%時(shí)對(duì)木瓜蛋白酶活性的影響，不同濃度的木瓜蛋白對(duì)酶活性的影響見圖6。

圖6　不同濃度的木瓜蛋白對(duì)酶活性的影響Fig.6Different concentrations of papaya protein effect on enzyme activity

由圖6可知，木瓜蛋白酶的活性隨著木瓜濾液的濃度增大而增大，當(dāng)物料濃度為30%時(shí)，木瓜蛋白酶的活性最大，隨著濾液濃度的增加，濃度差顯著，酶的提取速率減慢，酶的活性逐漸降低。因此，超濾過程中木瓜濾液的物料濃度控制在30%時(shí)，酶的活性最高。

2.5響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化木瓜蛋白酶的工藝參數(shù)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，綜合比較影響提取木瓜蛋白酶過程中酶活的較大的4個(gè)條件的最優(yōu)值，超濾溫度55℃，壓力0.25 MPa，時(shí)間3.5 min，物料濃度30%。以木瓜蛋白酶的活性大小為指標(biāo)，采用Design Expert 7.0軟件設(shè)計(jì)分析。結(jié)果見表2。

表2　Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2Experimental design and results of Box-Behnken

續(xù)表2Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Continue table 2Experimental design and results of Box-Behnken

根據(jù)試驗(yàn)數(shù)據(jù)，用Desgin Expert 7.0程序進(jìn)行二次多項(xiàng)式回歸，回歸模型方程為：Y=9.25-0.25A+0.15B+ 0.79C+0.02D+0.14AB+0.44AC+0.037AD+0.18BC+ 0.045BD+0.043CD-0.7A2-0.2B2-2.62C2-0.4D2

回歸方程的方差分析結(jié)果見表3。

表3　響應(yīng)面回歸方程方差分析Table 3ANOVA for response surface quadratic model

由表3可知，回歸模型P＜0.000 1極其顯著，失擬項(xiàng)P=0.136 1不顯著，表明回歸方程擬合程度良好，實(shí)驗(yàn)誤差較小。R2=0.991 2表明響應(yīng)值酶活大小實(shí)際值與預(yù)測(cè)值之間具有較好的擬合度，該試驗(yàn)方案是可行的，C.V.=2.45%進(jìn)一步說明，回歸模型也能較好的反應(yīng)真實(shí)實(shí)驗(yàn)值。以顯著水平（P＜0.05）為基礎(chǔ)條件，基于回歸方程的因素顯著性分析，影響木瓜蛋白酶酶活的回歸模型中的一次項(xiàng)（A、B、C），二次項(xiàng)（A2、B2、C2、D2），交互項(xiàng)AC均表現(xiàn)顯著，由F值可得，影響酶活力大小的條件的順序?yàn)椋篊（溫度）＞A（壓力）＞B（時(shí)間）＞D（物料濃度）。綜合分析比較得出，響應(yīng)面分析能較好地預(yù)測(cè)超濾法提取木瓜蛋白酶的酶活性大小。

通過Design Expert 7.0軟件對(duì)響應(yīng)面優(yōu)化工藝結(jié)果分析得到超濾法提取木瓜蛋白酶的最有條件為：壓力0.25 MPa，時(shí)間3.71 min，溫度55.8℃，物料濃度31%時(shí)。理論上木瓜蛋白酶的最大活性可達(dá)到9.355萬單位/mg。為驗(yàn)證響應(yīng)面法所得預(yù)測(cè)值的準(zhǔn)確性，綜合考慮試驗(yàn)中實(shí)際操作的客觀性，將最佳的條件修正為壓力0.25 MPa，時(shí)間3.7 min，溫度55℃，物料濃度30%，根據(jù)修正后的條件，做3次平行試驗(yàn)驗(yàn)證測(cè)得的酶活性大小為（9.31±0.27）萬單位/mg，證明了響應(yīng)面優(yōu)化超濾法提取木瓜蛋白酶的準(zhǔn)確性和有效性，表明建立并優(yōu)化模型的可靠性。

3結(jié)論

通過比較不同濃度的酶保護(hù)劑對(duì)提取木瓜蛋白酶活性大小的影響，結(jié)果顯示L-cys、EDTA濃度分別為0.04、0.002 mol/L時(shí)木瓜蛋白酶提取效果更好。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法對(duì)該酶提取過程中的主要影響因子進(jìn)行優(yōu)化，建立了較合理有效的酶活與溫度、壓力、時(shí)間、物料濃度的數(shù)學(xué)模型，該模型能較好的測(cè)算提取出來的木瓜蛋白酶的酶活性大小。

應(yīng)用響應(yīng)面法優(yōu)化得到的木瓜蛋白酶提取最佳條件為：壓力0.25 MPa，時(shí)間3.7 min，溫度55℃，物料濃度30%，此時(shí)酶活性大小為（9.31±0.27）萬單位/mg，與模型驗(yàn)證的酶活性9.355萬單位/mg非常接近。說明響應(yīng)面法能較好的用于木瓜蛋白酶提取工藝的優(yōu)化，為木瓜蛋白酶提取產(chǎn)量的提高奠定基礎(chǔ)。

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Response Surface Method Optimization Papain Extraction Process

WANG Tian-lin，LIANG Xin-hong，SUN Jun-liang*，MO Hai-zhen，ZHOU Meng
（College of Food，Henan Institute of Science and Technology，Xinxiang 453003，Henan，China）

Using fresh papaya as raw material.Extraction of papain on ultrafiltration choicing the L-cys，EDTA，pressure，temperature，time，solid-liquid ratio，six factors as single factor experiment，the extraction of papain by ultrafiltration to determine the optimum process conditions，the L-cys and EDTA for the enzyme protective agent optimal concentrations were：0.04 mol/L and 0.002 mol/L.The selected temperature，pressure，time and ratio of material to liquid four conditions by response surface experiments，mathematical model，and regression analysis，evaluation model，the results showed that the optimum conditions of ultrafiltration extraction of Papain is：temperature 55℃，pressure 0.25 MPa，time 3.7 min，material density 30%，the enzyme activity is（9.31±0.27）（U×10 000）/mg，it is close with the model validation activity of 9.355（U×10 000）/mg. That response surface method can be used to optimize the extraction process of papain better.

papain；ultrafiltration；responsesurfacemethodology

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.19.021

2015-11-22

河南省科技計(jì)劃項(xiàng)目（142102110127）；河南省教育廳自然科學(xué)研究資助計(jì)劃項(xiàng)目（14A550010）；河南省高?？萍紕?chuàng)新團(tuán)隊(duì)支持計(jì)劃項(xiàng)目（16IRTSTHN007）

王田林（1991—），男（漢），碩士研究生，研究方向：食品生物技術(shù)。

孫俊良（1964—），男，教授，博士，研究方向：食品生物技術(shù)。