馬艷弘，殷劍美，魏建明，李亞輝，張宏志，張立群

（1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，江蘇南京210014；2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所，江蘇南京210014；3.江蘇博達(dá)生物科技有限公司，江蘇徐州221723）

山藥皮多糖超聲輔助提取工藝及其抗氧化活性

馬艷弘1，殷劍美2，魏建明3，李亞輝1，張宏志1，張立群3

（1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，江蘇南京210014；2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所，江蘇南京210014；3.江蘇博達(dá)生物科技有限公司，江蘇徐州221723）

研究山藥皮多糖的超聲輔助提取工藝及其抗氧化活性。結(jié)果顯示：山藥皮多糖的最佳提取條件為料液比1∶20（g/mL）、超聲時間110 min、提取時間40 min，提取溫度70℃，在此條件下，多糖的提取率為185.12 mg/g，與未超聲波輔助提取對照試驗相比提高了48.89%，所提多糖具有較好的抗氧化活性，且在一定濃度范圍內(nèi)，其抗氧化能力與多糖質(zhì)量濃度呈現(xiàn)一定的劑量效應(yīng)關(guān)系。當(dāng)質(zhì)量濃度為3.2mg/mL時其對DPPH自由基和羥自由基清除率分別達(dá)到87.67%、71.20%。

山藥皮；超聲提?。欢嗵?；響應(yīng)面法；抗氧化性

山藥為薯蕷科（Dioscorea opposite thumb.）一年或多年生蔓生草本植物的根莖，又名薯蕷、薯藥、土薯等，廣泛分布于熱帶和亞熱帶地區(qū)，目前已有品種600多種，為我國傳統(tǒng)的藥食同源兩用食物。山藥不僅富含淀粉、蛋白質(zhì)、氨基酸、脂肪酸與多種礦質(zhì)元素，還含有活性多糖、多酚、黃酮、皂甙、尿囊素、尿囊酸等多種生物活性成分［1］，具有極高的營養(yǎng)、經(jīng)濟(jì)價值和開發(fā)前景。山藥多糖是其中最主要的生理活性成分之一，具有抗氧化、抗衰老、抗菌、抗癌、保護(hù)肝臟、增強(qiáng)機(jī)體免疫力等多種藥理保健功能［2-3］。市場以山藥為原料加工的各種保健食品備受消費者的青睞。

山藥皮為山藥加工副產(chǎn)物，約占加工品的20%左右，目前只有少部分作為飼料廉價出售，而大部分作為廢料直接丟棄，既容易造成環(huán)境污染又是對資源的極度浪費。已有研究表明：山藥皮同樣含有大量的活性成分，且其中總酚、總黃酮、尿囊素［4］含量遠(yuǎn)高于去皮山藥，具有比去皮山藥更高的藥理保健功效。隨著山藥種植面積和加工量的不斷提高，山藥皮的產(chǎn)量也逐年增高，其開發(fā)利用已引起越來越多的關(guān)注。目前，山藥皮的研究主要集中在皂苷、多酚等［5-6］方面，而有關(guān)山藥皮多糖的高效提取技術(shù)與活性分析仍鮮見報道。

多糖的提取技術(shù)有熱水浸提法、微波輔助法、超聲波輔助法、酶法輔助法等，其中超聲輔助提取技術(shù)因其具有操作簡便、提取時間短、效率高、產(chǎn)物易提純等優(yōu)點而被廣泛應(yīng)用。因此，本研究以山藥的加工廢棄物山藥皮為研究材料，采用超聲輔助提取法提取其中多糖，通過響應(yīng)面分析法優(yōu)化超聲提取工藝并探討其抗氧化活性，為提高山藥加工附加值、降低生產(chǎn)成本、保護(hù)生態(tài)環(huán)境、提高資源的綜合利用率提供參考。

1材料與方法

1.1材料與試劑

山藥皮：由江蘇博達(dá)生物科技有限公司提供，為菜用山藥加工副產(chǎn)物。將山藥皮低溫干燥，粉碎，過80目篩，密封、低溫保藏備用。

1，1-二苯基-2-苦肼基自由（DPPH）：上海源葉生物科技有限公司；羥自由基測定試劑盒：南京建成生物工程研究所；苯酚、無水乙醇、98%硫酸、檸檬酸、鹽酸、氯化鉀、氯仿、正丁醇等均為分析純試劑。

1.2儀器與設(shè)備

KH-500E超聲波清洗器：昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；FDU-1200型冷凍干燥機(jī)：日本東京理化器械株式會社；FW100萬能粉碎機(jī)：天津市泰斯特儀器有限公司；RE-5220型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器；E－poch微孔板分光光度計：美國Bio Tek公司；TDL-80-2C低速臺式離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；ML204萬分之一天平：梅特勒儀器有限公司；HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋：國華電器有限公司。

1.3方法

1.3.1山藥皮多糖提取工藝

稱取2 g山藥皮干粉，按照一定的料液比（g/mL）加蒸餾水混合，置于超聲波清洗儀，在超聲功率500 W條件下、超聲輔助提取不同時間，再于不同溫度下靜置提取不同時間，然后離心過濾，濾渣再提取1次，合并濾液，減壓旋蒸濃縮后，用4倍體積的80%乙醇（體積）沉淀靜置過夜，次日3 500 r/min離心15 min，無水乙醇洗滌即可得山藥皮粗多糖。粗多糖再經(jīng)Sevag法脫蛋白處理，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮、4倍體積80%乙醇沉淀、離心、干燥即可得山藥皮粗多糖。

1.3.2多糖提取率的測定

以葡萄糖作標(biāo)準(zhǔn)品，采用苯酚-硫酸法測定多糖含量，根據(jù)測定結(jié)果繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，所得線性回歸方程為：C=0.997A-0.000 6，R2=0.999 3，（式中C為葡萄糖質(zhì)量濃度，A為吸光度）。據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算樣品多糖含量。再根據(jù)如下公式計算多糖提取量。

1.3.3單因素試驗設(shè)計

以多糖提取量為考察目標(biāo)，500 W超聲功率，分別考察料液比、超聲時間以及提取時間、提取溫度對多糖提取量的影響。固定提取時間1 h、超聲時間1 h、提取溫度50℃，考察不同料液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30（g/mL）對多糖提取量的影響；固定料液比1∶15、提取時間1 h、提取溫度50℃，考察不同的超聲時間（80、90、100、110、120、130 min）對多糖提取量的影響；固定料液比1∶15（g/mL）、超聲時間1 h、提取時間1 h，考察不同的提取溫度（30、40、50、60、70、80℃）對多糖提取量的影響；固定料液比1∶15（g/mL）、超聲時間1 h、提取溫度50℃，考察不同的提取時間（20、40、60、80、100、120 min）對多糖提取量的影響。

1.3.4Box-Behnken試驗設(shè)計及響應(yīng)面分析

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken設(shè)計方案［7］，以料液比、提取時間、提取溫度、超聲時間為考察因素，以多糖提取量為響應(yīng)值，利用Design-Expert 8.05 b軟件優(yōu)化山藥皮多糖提取工藝。試驗因素、水平編碼見表1。

表1　Box-Behnken試驗設(shè)計因素和水平編碼表Table 1Factors and levels of Box-Behnken experimental design

1.3.5山藥皮多糖抗氧化活性分析［8-9］

1.3.5.1山藥皮多糖對DPPH自由基清除能力測定

配置0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2 mg/mL的多糖溶液和相應(yīng)濃度的VC溶液，各取2 mL于具塞試管中，每管加入2×10-4mol/L DPPH溶液2 mL，搖勻后避光放置30 min。分別測定517 nm處的吸光度。試驗設(shè)空白組、對照組、試驗組。DPPH自由基清除率計算公式如下：

式中：A1為試驗組吸光度；A2為對照組吸光度；A0為空白組吸光度。

1.3.5.2山藥皮多糖清除羥自由基能力測定

分別取500 μL不同質(zhì)量濃度（0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2 mg/mL）的多糖溶液和VC溶液，按試劑盒說明書操作，測定吸光度A值。其呈色與·OH的多少呈正比關(guān)系，即吸光度越小，樣品對·OH的清除能力越強(qiáng)。羥氧自由基抑制能力計算公式如下：

式中：A1為試驗組吸光度；A2為對照組吸光度；A0為空白組吸光度。

1.4數(shù)據(jù)分析

利用SPSS18.0和Design-Expert V8.0數(shù)據(jù)處理軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理即統(tǒng)計分析。

2結(jié)果與分析

2.1山藥皮多糖提取單因素試驗結(jié)果

2.1.1料液比對山藥皮多糖提取量的影響

料液比對山藥皮多糖提取量的影響見圖1。

圖1　料液比對多糖提取量的影響Fig.1Effect of solid to liquid radio on the yield of polysaecharides from Chinese yam peel

由圖1可知，隨著料液比的增加，多糖提取量逐漸增大，在料液比1∶20（g/mL）時，粗多糖提取率達(dá)到最大157.22 mg/g，但若料液比繼續(xù)增大，多糖提取率呈現(xiàn)下降趨勢，所以山藥皮多糖提取適宜的料液比為1∶20（g/mL）。

2.1.2超聲時間對山藥皮多糖提取量的影響

超聲時間對山藥皮多糖提取量的影響見圖2。

圖2　超聲時間對多糖提取量的影響Fig.2Effect of ultrasonic time on the yield of polysaecharides from Chinese yam peel

由圖2可知，隨著超聲時間的不斷增加延長，多糖的提取量也不斷提高，當(dāng)超聲時間達(dá)120 min時，多糖提取量達(dá)到175.42 mg/g，這是由于在一定時間范圍內(nèi)隨著超聲時間的延長，超聲的空化效應(yīng)增強(qiáng)，細(xì)胞遭受破壞，更多的胞內(nèi)多糖溶入溶劑導(dǎo)致了多糖提取量的增高；超過120 min后提取量出現(xiàn)下降趨勢，是由于長時間的沖擊波作用引起了山藥皮多糖的共價鍵斷裂從而導(dǎo)致多糖分子的降解，致使提取量隨之下降［10-11］，因此120 min為適宜的超聲時間。

2.1.3提取溫度對山藥皮多糖提取量的影響

提取溫度對山藥多糖提取量的影響見圖3。

圖3　提取溫度對多糖提取量的影響Fig.3Effect of extraction temperature on the yield of polysaecharides from Chinese yam peel

由圖3可知，30℃～40℃之間，多糖提取量變化平緩；40℃～70℃之間多糖提取量隨提取溫度的升高而大幅升高，當(dāng)提取溫度達(dá)到70℃時，提取量達(dá)171.49 mg/g；70℃～80℃之間，多糖提取量基本趨于穩(wěn)定，甚至呈現(xiàn)下降趨勢。因此為節(jié)約能耗和防止高溫導(dǎo)致多糖降解，確定70℃為最佳提取溫度。

2.1.4提取時間對山藥皮多糖提取量的影響

提取時間對山藥皮多糖提取量的影響見圖4。

圖4　提取時間對多糖提取量的影響Fig.4Effect of extraction time on the yield of yam peel polysaecharides

從圖4可知，提取時間為40 min時，多糖提取量達(dá)到最大值126.60 mg/g，大于40 min后提取量呈下降趨勢。這是由于前期超聲提取過程已經(jīng)使絕大部分多糖溶出，因此后續(xù)繼續(xù)延長提取時間并不能有效提高多糖提取量，所以選最佳提取時間為40 min。

2.2山藥皮多糖提取條件響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果

2.2.1回歸模型建立與顯著性檢驗

采用Box-behnken設(shè)計方案，以多糖提取量為響應(yīng)值，優(yōu)化山藥皮多糖超聲輔助提取工藝，其試驗結(jié)果見表2（實測值為3次平行試驗結(jié)果平均值）。應(yīng)用Design Expert軟件對試驗值進(jìn)行多元回歸分析，得到的回歸方程：Y=176.86+7.77A+1.19B-2.01C-5.47D+ 5.15AB-8.11AC+3.45AD+5.70BC+2.25BD-7.38CD-19.71A2-13.04B2-20.63C2+2.77D2

表2　Box-Behnken試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2Box-Behnken experimental design and results

對模型方程進(jìn)行顯著性分析結(jié)果見表3。

由表3可知，回歸模型極顯著（P＜0.000 1），失擬項（P=0.429 9）不顯著，實際試驗值與預(yù)測值具有高度相關(guān)性（R2=0.986 2，R2Adj=0.972 4），表明模型與試驗值擬合良好［12］，該模型可以對山藥皮多糖的提取量進(jìn)行準(zhǔn)確的預(yù)測和分析。由表3還可知，4個自變量對響應(yīng)值的影響程度大小依次為液料比（A）＞超聲時間（D）＞提取溫度（C）＞提取時間（B），其中因素A、C、D以及4個因素的二次項對山藥皮多糖提取量影響顯著（P＜0.01或P＜0.05），AD的交互作用對響應(yīng)值的影響顯著（P＜0.05），AB、AC、BC、CD的交互作用對響應(yīng)值的影響極顯著（P＜0.01）。說明4個因素均不同程度的對響應(yīng)值產(chǎn)生影響，本試驗設(shè)計的因素選擇科學(xué)合理。

表3　方差分析表Table 3The table of variance analysis

2.2.2多糖提取量響應(yīng)面分析與優(yōu)化

圖5反映了當(dāng)液料比、超聲時間、提取溫度、提取時間4個因素中任意兩個變量取零點水平時，其他兩個因素的交互作用對山藥皮多糖提取量的影響情況。曲面的陡度程度可以表明變量對多糖的影響程度［13］。

由圖5可見，除提取時間與超聲時間的交互作用對提取量的影響不顯著（P＞0.05）外，其他因素兩兩之間交互作用對提取率的影響均顯著或極顯著（P＜0.05或P＜0.01）。通過軟件分析得到山藥皮多糖最佳提取條件為：料液比1∶20.45（g/mL）、提取時間40 min、提取溫度71.1℃，超聲時間110 min，在此條件下山藥皮多糖提取量的預(yù)測值為185.58 mg/g。為操作方便，修正最佳提取工藝條件為：料液比1∶20（g/mL）、提取時間40 min、提取溫度70℃，超聲時間110 min。

2.2.3驗證試驗

圖5　各兩因素交互影響山藥皮多糖提取量的響應(yīng)面圖Fig.5Response surface plot showing the effects of solid to liquid ratio，extraction time，extraction temperature，and ultrasonic time on the yield of polysaccharides from chinese yam peel

按照山藥皮多糖最佳優(yōu)化條件隨即取樣進(jìn)行3次驗證試驗，并以未經(jīng)過超聲處理但其他條件相同的處理為對照，測定多糖提取量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)未經(jīng)超聲處理的對照組山藥皮多糖提取量為124.33 mg/g，最優(yōu)工藝條件下山藥皮多糖的提取量為185.12 mg/g，多糖提取量提高了48.89%，實測值與預(yù)測值相對誤差僅為0.25%；說明該試驗結(jié)果穩(wěn)定、可靠，模型擬合良好，能夠很好的反應(yīng)山藥皮中多糖的提取情況。

2.3山藥皮多糖抗氧化活性分析

山藥皮多糖的對DPPH自由基和羥自由基的清除能力見圖6。

圖6　山藥皮多糖自由基清除能力Fig.6Radical scavenging capacities of polysaccharide from Chinese yam peel

如圖6所示，在所設(shè)濃度范圍內(nèi)，DPPH自由基和羥自由基清除率隨山藥皮多糖質(zhì)量濃度增加逐漸增強(qiáng)，當(dāng)濃度達(dá)到3.2 mg/mL時，DPPH自由基清除率達(dá)87.67%，羥自由基清除率為71.20%，表明山藥皮多糖具有較強(qiáng)的DPPH自由基清除能力，但其對羥自由基清除率明顯低于同濃度下VC的自由基清除率。

3結(jié)論

超聲波輔助提取技術(shù)是近年來廣泛應(yīng)用于活性多糖提取的新技術(shù)［14］。超聲產(chǎn)生的空化效應(yīng)可快速破壞植物細(xì)胞壁，增大目標(biāo)產(chǎn)物與溶劑的接觸，還具有效率高、能耗低、溶劑用量少等特點，因此本研究以山藥加工副產(chǎn)物山藥皮為原料，采用超聲輔助法提取山藥皮多糖，并在單因素試驗基礎(chǔ)上通過響應(yīng)面分析法優(yōu)化了山藥皮多糖的最佳提取工藝，建立了可靠的預(yù)測模型，得到山藥皮多糖最優(yōu)超聲輔助提取條件為：超聲功率500 W，料液比1∶20（g/mL）、超聲提取時間110 min，超聲提取后靜置提取40 min，提取溫度70℃，連續(xù)提取2次。此條件下山藥皮多糖的提取量為185.12 mg/g，與未超聲處理的對照組相比多糖提取量提高了48.89%。通過DPPH自由基清除能力和羥自由基清除能力測試發(fā)現(xiàn)，超聲提取的多糖具有較強(qiáng)的抗氧化活性，3.2 mg/mL的多糖溶液對DPPH自由基和羥自由基的清除能力分別達(dá)87.67%、71.20%。尤其是其對DPPH自由基清除能力，幾乎與同濃度的VC的抗DPPH自由基清除能力相差無幾。由此可見，本試驗既為山藥皮廢棄資源的合理利用提供了很好的思路，也為山藥皮多糖的工業(yè)化生產(chǎn)提供了試驗依據(jù)。超聲輔助技術(shù)提取山藥皮多糖節(jié)能高效、環(huán)保，既可有效預(yù)防山藥皮可能造成的環(huán)境污染，又能提高山藥皮資源利用率和山藥加工附加值。

［1］李敏.山藥活性成分提取技術(shù)及藥理功能的研究進(jìn)展［J］.南方農(nóng)業(yè)學(xué)報，2013，44（7）：1184-1189

［2］Hsu CK，Yeh JY，Wei JH.Protective effects of the crude extracts from yam（Dioscorea alata）peel on tert-butylhydroperoxide-induced oxidative stress in mouse liver cells［J］.Food Chemistry，2011，126（2）：429-434

［3］Ju Ying，Xue Yan，Huang Jianlei，et al.Antioxidant Chinese yam polysaccharides and its pro-proliferative effect on endometrial epithelial cells［J］.International Journal of Biological Macromolecules，2014，66（5）：81-85

［4］呂鵬，賈秀梅，張振凌，等.懷山藥及非藥用部位總黃酮含量測定［J］.中國實驗方劑學(xué)雜志，2012，18（2）：65-68

［5］吳祥庭，朱濤，鄭巧敏，等.響應(yīng)面法優(yōu)化山藥皮中皂苷提取的研究［J］.中國糧油學(xué)報，2011，26（6）：91-95

［6］涂寶軍，馬利華，秦衛(wèi)東，等.超聲波輔助提取山藥皮多酚工藝及酚類的鑒別研究［J］.中國食品添加劑，2014（1）：120-126

［7］Kong CS，Kim JA，Qian ZJ，et a1.Protective effect of Isorhamnetin-3-O-β-D-glucopyranoside from Salicornia herbacea againstoxidationg-induced cell damage［J］.Food and Chemical Toxicology，2009，47（8）：1914-1920

［8］Li Xiuxia，Han Lujia，Chen Longiian.In vitro antioxidant activity of protein hydrolysates prepared from corn gluten meal［J］.Journal of the Science of Food and Agriculture，2008，88（9）：1660-1666

［9］Atoui AK，Mansouri A，Boskou G，et al.Tea and herbal infusions：Their antioxidant activity and phenolic profile［J］.Food Chemistry，2005，89（1）：27-36

［10］Ye CL，Jiang CJ.Optimization of extraction process of crude polysaccharides from Plantago asiatica L.by response surface methodology［J］.Carbohydrate Polymers，2011，84（1）：495-502

［11］Zhao S，Kwok KC，Liang H.Investigation on ultrasound assisted extractionofsaikosaponinsfromRadixBupleuri［J］.Separation and Purification Technology，2007，55（3）：307-312

［12］程丹，傅玉穎，梅子，等.響應(yīng)曲面法優(yōu)化酵母微膠囊化核桃油工藝［J］.中國食品學(xué)報，2013，13（11）：28-33

［13］Yisa MG，Terao H，Noguchi N，et al.Stability criteria for tractor-implement operation on slopes［J］.Journal of Terramechanics，1998，35（1）：1-19

［14］Porto CD，Decorti D，Natolino A.Effect of commercial enzymatic preparation with pectolytic activities on conventional extraction and ultrasound-assisted extraction of oil from grape seed（Vitis vinifera L.）［J］.International Journal of Food Science and Technology，2013，48（10）：2127-2132

Optimization of Ultrasonic-assisted Extraction of Polysaccharides from Chinese Yam Peel and Its Antioxidant Activity

MA Yan-hong1，YIN Jian-mei2，WEI Jian-ming3，LI Ya-hui1，ZHANG Hong-zhi1，ZHANG Li-qun3
（1.Institute of Farm Product Processing，Jiangsu Academy of Agricultural Sciences，Nanjing 210014，Jiangsu，China；2.Institute of Industrial Crops，Jiangsu Academy of Agricultural Sciences，Nanjing 210014，Jiangsu，China；3.Jiangsu Boda Biotechnology Co.，Ltd.，Xuzhou 221723，Jiangsu，China）

This present study focused on extraction of polysaccharides from Chinese yam peel by ultrasonic assisted method，and the antioxidant activity of polysaccharides from Chinese yam peels was also evaluated.The extraction conditions of polysaccharides were optimized using response surface methodology on the basis of single factor experiment.The DPPH radical scavenging capacities and hydroxyl radical（·OH）scavenging capacities were measured.Results showed that the optimal parameiers of ultrasonic extractin were solid/liquid ratio 1/ 20（g/mL），ultrasonic time 110 min，extraction time 40 min，extraction temperature 70℃.Under these conditions，the polysaccharides extraction rate reached 185.12 mg/g，increased by 48.89%compared with the control without ultrasonic assisted extration.The polysaccharides obtained possessed potent antioxidant activity，and the antioxidant activity of polysaccharides from Chinese yam peel was found in does dependent manner.Under the concentration of 3.2 mg/mL，the radical scavenging rate on DPPH and·OH were 87.67%，71.20%，respectively.

Chineseyampeel；ultrasonicextraction；polysaccharide；responsesurfacemethodology；antioxidant activity

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.19.009

2016-05-29

江蘇省蘇北科技發(fā)展計劃項目（BN2014087）；江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金（cx（16）1019）

馬艷弘（1972—），女（漢），副研究員，博士，研究方向：食品發(fā)酵技術(shù)與農(nóng)副產(chǎn)品資源綜合利用。