高建明， Erle S. ROBERTSON

(1三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院生理與病理生理學(xué)系， 湖北 宜昌 443002；2賓夕法尼亞大學(xué)醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)系， 美國 賓夕法尼亞州 費(fèi)城 19104)

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KSHV RTA 通過GC/Sp1和p53順式元件上調(diào)survivin表達(dá)*

高建明1， Erle S. ROBERTSON2△

(1三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院生理與病理生理學(xué)系， 湖北 宜昌 443002；2賓夕法尼亞大學(xué)醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)系， 美國 賓夕法尼亞州 費(fèi)城 19104)

目的： 定位survivin基因啟動子中參與卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒(Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus，KSHV)復(fù)制轉(zhuǎn)錄激活因子(replication and transcription activator，RTA)上調(diào)survivin表達(dá)的重要元件。方法: 構(gòu)建survivin基因啟動子的突變報(bào)告質(zhì)粒，采用螢光素酶報(bào)告基因檢測和染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)，定位survivin基因啟動子區(qū)域能與 RTA相互作用的順式元件。結(jié)果: 突變GC/Sp1和p53兩個結(jié)合位點(diǎn)啟動子活性幾乎完全關(guān)閉，p53順式作用元件對RTA上調(diào)survivin基因啟動子活性具有協(xié)同作用。結(jié)論: KSHV RTA能夠與survivin基因啟動子中的GC/Sp1和p53順式元件相互作用，特異性地增強(qiáng)survivin基因啟動子活性。

卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒； 復(fù)制轉(zhuǎn)錄激活因子； Survivin； GC/Sp1； p53； 啟動子活性

Survivin是哺乳動物凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis，IAP)家族中分子量最小的一個蛋白，僅由142個氨基酸組成，是迄今發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)凋亡抑制因子[1]。Survivin結(jié)構(gòu)上含有一個桿狀病毒IAP重復(fù)序列(baculoviral IAP repeat，BIR)和一個較長的羧基端α螺旋。由于其組織分布存在特異性，并具有參與細(xì)胞凋亡及細(xì)胞有絲分裂調(diào)節(jié)雙重的重要功能[2]，逐漸為腫瘤發(fā)病機(jī)制和分子治療研究所關(guān)注[3-5]?？úㄎ魅饬鱿嚓P(guān)皰疹病毒(Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus， KSHV)編碼的復(fù)制轉(zhuǎn)錄激活因子(replication and transcription activator，RTA)能夠特異性地增強(qiáng)survivin基因啟動子活性,上調(diào)宿主細(xì)胞的survivin表達(dá)[6]。本研究旨在進(jìn)一步定位survivin基因啟動子中能與RTA相互作用，在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控survivin表達(dá)的核心序列，以期全面闡明KSHV RTA調(diào)控宿主細(xì)胞survivin表達(dá)的分子機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 質(zhì)粒

pcDNA-RTA編碼全長RTA的真核表達(dá)載體。pGL3-SurP為含survivin基因全長啟動子的螢光素酶報(bào)告質(zhì)粒。SurPΔNkx、SurP-269/+1、 SurP-269/+1ΔGC/Sp1、SurP-269/+1Δp53、SurPΔGC/Sp1、SurPΔGC/Sp1+Δp53 和SurPΔp53為一系列包含survivin基因啟動子不同結(jié)構(gòu)域的螢光素酶報(bào)告質(zhì)粒[7]。以上質(zhì)粒均為Robertson實(shí)驗(yàn)室研究人員構(gòu)建并保存。

2 抗體與細(xì)胞

RTA抗體用雜交瘤技術(shù)制備，由上海巴斯德研究所藍(lán)柯實(shí)驗(yàn)室提供；GAPDH抗體為Novus Biologicals產(chǎn)品；HEK 293是原代人胚腎細(xì)胞轉(zhuǎn)染腺病毒DNA的永生化細(xì)胞，Saos-2是p53低表達(dá)的人骨肉瘤細(xì)胞株，BCBL1是感染KSHV的人體腔淋巴瘤細(xì)胞系。

3 方法

3.1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及KSHV的誘導(dǎo) 采用Bio-Rad公司的Gene Pulser 電穿孔儀進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，用20 μg/L佛波酯、1.5 mmol/L丁酸鈉誘導(dǎo)KSHV，未經(jīng)處理的細(xì)胞作為對照組。所有細(xì)胞均在誘導(dǎo)后培養(yǎng)48 h收集。

3.2 螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) 107個HEK 293細(xì)胞、Saos-2細(xì)胞共轉(zhuǎn)染10 μg全長或突變的啟動子螢光素酶報(bào)告質(zhì)粒和10 μg RTA表達(dá)質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染后24 h收獲細(xì)胞，制備細(xì)胞裂解液。向40 μL細(xì)胞裂解液中加入25 μL螢光素酶實(shí)驗(yàn)底物，使用LMax II 384熒光光度計(jì)(Molecular Devices)檢測熒光水平。結(jié)果以3次實(shí)驗(yàn)值的均數(shù)與標(biāo)準(zhǔn)差表示。用Western blot 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證轉(zhuǎn)染的蛋白質(zhì)表達(dá)。

3.3 Western blot 實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞收集后加入RIPA 緩沖液裂解，用Bradford 比色法測定蛋白質(zhì)濃度。取相同質(zhì)量的細(xì)胞裂解液上樣，聚丙烯胺凝膠電泳結(jié)束后，轉(zhuǎn)移蛋白樣品至PVDF膜，分別用RTA抗體、GAPDH抗體及耦聯(lián)IR Dye 800的羊抗鼠IgG抗體進(jìn)行免疫印跡。用Odyssey紅外線成像系統(tǒng)(LI-COR)觀察結(jié)果。

3.4 染色質(zhì)免疫共沉淀(chromatin Immunoprecipitation，ChIP)實(shí)驗(yàn) BCBL1細(xì)胞于佛波酯誘導(dǎo)48 h后向培養(yǎng)液中加入甲醛，終濃度為1%，37 ℃ 固定細(xì)胞10 min，使蛋白質(zhì)和DNA 發(fā)生交聯(lián)。加入甘氨酸使其終濃度為0.125 mol/L，在室溫晃動孵育5 min以終止交聯(lián)反應(yīng)。使用預(yù)冷的PBS清洗細(xì)胞2次，加入含1% SDS的裂解液裂解細(xì)胞，超聲裂解細(xì)胞懸液將DNA均一地打斷成500～1 000 bp的片段。用ChIP 稀釋緩沖液將超聲剪切后的DNA稀釋10倍，取20 μL 稀釋液保存，這時(shí)的樣品標(biāo)記為INPUT，作為PCR的空白對照。其余稀釋液加入蛋白A 瓊脂糖磁珠，4 ℃ 孵育2 h，分為2組，一組加入RTA抗體，4 ℃振蕩過夜，另一組加入鼠IgG抗體作為陰性對照。將免疫復(fù)合物用磁珠沉淀，將沉淀物分別經(jīng)低鹽、高鹽和氯化鋰溶液3次系列沖洗，然后用TE 緩沖液洗2 次，每次沖洗5 min。用新配制的洗脫緩沖液將蛋白/DNA 復(fù)合物從磁珠上洗脫，加氯化鈉(Na+濃度為200 mmol/L)與2 μL RNaseA(0.5 g/L)，65 ℃過夜，松解蛋白/DNA 交聯(lián)；加入5 μL蛋白酶K(20 g/L)，于 55 ℃水浴2 h。用酚/氯仿抽提DNA。以回收的DNA 片段為模板，進(jìn)行PCR 反應(yīng)，DNA的數(shù)量水平可通過定量PCR來檢測，引物序列為5’-CGTTCTTTGAAAGCAGTCGAG-3’和5’-TCAAATCTGGCGGTTAATGG-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物覆蓋GC/Sp1與p53區(qū)域，片段長度為200 bp。同時(shí)做RT-qPCR，用2-ΔΔCt值的方法對DNA豐度進(jìn)行相對定量。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用 SPSS 16.0 軟件的t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 GC/Sp1和p53結(jié)合位點(diǎn)對RTA 上調(diào)survivin啟動子活性具有重要作用

野生型survivin基因啟動子全長為649 bp。用在線軟件(http://motif.genome.jp/)分析其轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合區(qū)域，結(jié)果發(fā)現(xiàn)survivin基因啟動子含有4個主要轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，從起動子上游向起始密碼子處依次為Sp1、NKx2.5、GC/Sp1和p53。野生型和突變型survivin基因啟動子報(bào)告質(zhì)粒的構(gòu)建示意圖如圖1所示[7]。

用RTA質(zhì)粒、野生型和突變型survivin基因啟動子報(bào)告質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染HEK 293細(xì)胞進(jìn)行螢光素酶報(bào)告基因檢測。結(jié)果顯示突變NKx2.5導(dǎo)致RTA激活survivin啟動子活性輕度增強(qiáng)，RTA激活的野生型survivin啟動子活性是未有RTA轉(zhuǎn)染時(shí)的基底活性的3倍，而RTA介導(dǎo)的突變報(bào)告質(zhì)粒SurPΔNkx活性是野生型survivin啟動子基底活性的3.5倍；突變Sp1和NKx2.5元件(SurP-269/+1)對啟動子活性沒有明顯影響，因此Sp1和NKx2.5元件對RTA介導(dǎo)的survivin啟動子活性并不重要。然而，突變GC/Sp1結(jié)合位點(diǎn)(SurP-269/+1ΔGC/Sp1和SurPΔGC/Sp1)導(dǎo)致啟動子活性顯著降低(P<0.05)；突變p53時(shí)，在RTA表達(dá)時(shí)突變報(bào)告質(zhì)粒SurP-269/+1Δp53和SurPΔp53的活性只有野生型survivin啟動子活性的1/4(P<0.05)；當(dāng)GC/Sp1和p53兩個結(jié)合位點(diǎn)均突變后啟動子活性幾乎完全關(guān)閉(P<0.05)。上述結(jié)果證實(shí)GC/Sp1和p53結(jié)合位點(diǎn)對RTA 上調(diào)survivin啟動子活性不可或缺，具有重要作用，見圖2A。

Figure 1.Schematic showing of the wild-type and mutant survivin promoters[7].

圖1 野生型和突變型survivin啟動子結(jié)構(gòu)示意圖

2 p53 順式作用元件對RTA介導(dǎo)的survivin表達(dá)上調(diào)具有協(xié)同作用

為闡明p53順式作用元件對RTA介導(dǎo)的survivin表達(dá)上調(diào)具有何種作用，我們應(yīng)用p53低表達(dá)的Saos-2細(xì)胞做了螢光素酶報(bào)告基因檢測。突變p53結(jié)合位點(diǎn)導(dǎo)致survivin基因啟動子活性相比野生型全長啟動子的活性降低一半(P<0.05)。然而，一旦突變在p53結(jié)合位點(diǎn)上游52 bp的GC/Sp1元件，啟動子活性會顯著降低(P<0.05)；如果將GC/Sp1 和 p53 兩個結(jié)合位點(diǎn)一起突變，與轉(zhuǎn)染了RTA質(zhì)粒的Saos-2細(xì)胞野生型survivin基因啟動子活性相比，啟動子活性急劇降低，幾乎完全關(guān)閉(P<0.05)。螢光素酶報(bào)告基因檢測表明Saos-2細(xì)胞弱表達(dá)的p53蛋白與survivin基因啟動子序列中的順式作用元件結(jié)合后，能夠與RTA-GC/Sp1復(fù)合物協(xié)同作用，在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)survivin表達(dá)，見圖2B。

Figure 2.RTA activated the expression of survivin through interacting with GC/Sp1 and p53 cis elements. Reporter assay for the wild type and mutant survivin promoters in 293 (A) and p53 null Saos-2 cells (B). Western blot showed the expression of RTA in the cotransfected cells and GAPDH was used as control.*P<0.05vs-RTA.

圖2 RTA通過GC/Sp1和p53順式元件上調(diào)survivin的表達(dá)。

3 ChIP實(shí)驗(yàn)證實(shí)RTA蛋白與GC/Sp1和p53結(jié)合位點(diǎn)存在直接相互作用

用佛波酯、丁酸鈉誘導(dǎo)的BCBL1細(xì)胞進(jìn)行免疫共沉淀試驗(yàn)，結(jié)果表明了RTA蛋白與GC/Sp1和p53結(jié)合位點(diǎn)存在直接相互作用。PCR擴(kuò)增證實(shí)免疫復(fù)合物中存在跨越GC/Sp1和p53結(jié)合位點(diǎn)的DNA片段。經(jīng)誘導(dǎo)細(xì)胞的核DNA組經(jīng)RTA抗體沉淀后可見清晰的目的片段，未經(jīng)誘導(dǎo)細(xì)胞的核DNA組經(jīng)RTA抗體沉淀后無陽性信號，2個IgG抗體陰性對照組亦均無目的片段。RT-qPCR用來相對定量沉淀下來的DNA的豐度，RTA抗體沉淀下來的經(jīng)誘導(dǎo)BCBL1細(xì)胞的核DNA量比對照組高25倍,見圖3。

討 論

RTA是促使KSHV從潛伏性感染向裂解性感染轉(zhuǎn)變的關(guān)鍵調(diào)控因子[8]。病毒的反復(fù)感染或者建立潛伏感染/再激活，使宿主細(xì)胞的DNA損害不斷累積，繼而發(fā)生遺傳不穩(wěn)定、細(xì)胞永生化、腫瘤等一系列效應(yīng)[9]。近年來的研究揭示，survivin屬于凋亡抑制蛋白家族，與細(xì)胞分裂、凋亡、應(yīng)激和基因組完整性的檢測點(diǎn)機(jī)制調(diào)控密切相關(guān)[10]。我們的前期研究已提示RTA能夠增強(qiáng)survivin基因啟動子的活性，進(jìn)而上調(diào)宿主細(xì)胞的survivin表達(dá)[6]。

Figure 3.RTA protein interacted with the GC/Sp1 and p53 binding sites. The DNA fragments covering the GC/Sp1 and p53 binding sites were detected within the RTA antibody/DNA comlex by PCR (A). Real-time PCR was used to relatively quantitate the precipitated DNA (B). UN: the cells were not induced with TPA and sodium butyrate; IN: the cells were induced with TPA and sodium butyrate.

圖3 RTA蛋白與GC/Sp1和p53結(jié)合位點(diǎn)存在直接相互作用

既往有文獻(xiàn)報(bào)道survivin基因啟動子區(qū)域存在Sp1、類Sp1和p53等轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)[11]，因此Sp1和p53很可能在RTA介導(dǎo)的survivin表達(dá)上調(diào)機(jī)制中發(fā)揮重要的作用。本研究發(fā)現(xiàn)survivin基因啟動子區(qū)域的GC/Sp1和p53順式元件對RTA上調(diào)survivin啟動子活性具有重要作用，并且染色質(zhì)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了RTA與GC/Sp1和p53順式元件之間存在直接相互作用。

既往研究報(bào)道KSHV潛伏相關(guān)核抗原(latency-associated nuclear antigen, LANA)通過GC/Sp1和p53元件上調(diào)survivin表達(dá)，并促進(jìn)細(xì)胞增殖[7]。本研究提示RTA通過相同機(jī)制下調(diào)細(xì)胞凋亡，這與在病毒轉(zhuǎn)向裂解性感染過程后細(xì)胞凋亡、病毒子釋放并不相悖。事實(shí)上LANA 與RTA在調(diào)控病毒生活周期上存在互相的反饋性調(diào)節(jié)機(jī)制[12]。RTA介導(dǎo)的survivin表達(dá)上調(diào)可以延緩進(jìn)入裂解性復(fù)制期的宿主細(xì)胞的凋亡，理論上應(yīng)導(dǎo)致宿主細(xì)胞在裂解性復(fù)制過程中會釋放出更多的病毒子，促進(jìn)病毒傳播。少部分宿主細(xì)胞經(jīng)歷潛伏感染/再激活后得以存活，但DNA損害不斷累積。后續(xù)的研究將圍繞KSHV RTA介導(dǎo)的survivin表達(dá)上調(diào)在宿主細(xì)胞增殖與凋亡、病毒子的產(chǎn)生、病毒宿主細(xì)胞相互作用等方面的生物學(xué)意義而展開。

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(責(zé)任編輯： 盧 萍， 羅 森)

KSHV RTA upregulates expression of survivin through interacting with GC/Sp1 and p53 cis-acting elements

GAO Jian-ming1, Erle S. ROBERTSON2

(1DepartmentofPhysiologyandPathophysiology,ThreeGorgesUniversitySchoolofMedicine,Yichang443002,China;2DepartmentofMicrobiology,UniversityofPennsylvaniaSchoolofMedicine,Philadelphia,Pennsylvania19104,USA.E-mail:erle@mail.med.upenn.edu)

AIM: To identify the potential elements within the survivin promoter indispensable for the upregulation of survivin by Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus encoded replication and transcription activator (KSHV RTA). METHODS: A series of truncated survivin promoter luciferase constructs were generated. Reporter assay and chromatin immunoprecipitation were performed to detect the interaction between RTA and the importantcis-acting elements. RESULTS: Deletion of the GC/Sp1 and p53 binding sites within the survivin promoter almost completely shut down the survivin promoter activity and the p53cis-acting element synergistically contributes to survivin promoter activation by RTA. CONCLUSION: KSHV RTA interacts with the GC/Sp1 and p53cis-acting elements and regulates the expression of cellular survivin by specifically increasing the activity of survivin promoter.

Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus; Replication and transcription activator; Survivin; GC/Sp1; p53; Promoter activity

雜志網(wǎng)址： http://www.cjpp.net

1000- 4718(2016)09- 1666- 04

2016- 04- 06

2016- 05- 25

National Cancer Institute 5R01CA091792-08, 5R01CA108461-05, 1R01CA137894-01 and 1R01CA138434-01A209; National Institute of Allergy and Infectious Diseases 5R01AI067037-04；National Institute of Dental and Craniofacial Research 5R01DE017338-03 (to ESR)

△ 通訊作者 Tel: (215)746-0114； E-mail: erle@mail.med.upenn.edu

R363

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10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.09.022