李紅梅， 邢 云， 唐翔詡， 楊多猛， 王華東， 呂秀秀， 戚仁斌， 陸大祥

(暨南大學醫(yī)學院病理生理學系, 國家中醫(yī)藥管理局病理生理學實驗室， 廣東 廣州 510632)

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小檗堿抑制膿毒癥誘導的腸上皮細胞凋亡*

李紅梅， 邢 云， 唐翔詡， 楊多猛， 王華東△， 呂秀秀， 戚仁斌， 陸大祥

(暨南大學醫(yī)學院病理生理學系, 國家中醫(yī)藥管理局病理生理學實驗室， 廣東 廣州 510632)

目的： 觀察小檗堿對膿毒癥小鼠腸上皮細胞凋亡的影響及其作用機制。方法: 8～10周雄性C57BL/6小鼠，隨機分為假手術組(sham組)、膿毒癥模型組(CLP組)、小檗堿治療組(CLP+Ber組)、小檗堿對照組(sham+Ber組)。CLP組行盲腸結(jié)扎穿孔術復制小鼠膿毒癥模型，其余組除不結(jié)扎盲腸外，其它操作同CLP組。各組小鼠術后2 h內(nèi)分別予雙蒸水、小檗堿(50 mg/kg)灌胃。術后20 h，小鼠腹腔注射過量的戊巴比妥鈉處以安樂死后開腹取回腸組織，HE染色觀察各組小鼠腸組織形態(tài)學改變；Western blot法觀察各組腸組織凋亡相關蛋白caspase-3降解片段、胞漿組織細胞色素C(Cyt C)、線粒體蛋白Bax及細胞總蛋白Bcl-2、Fas、FasL、Fas相關死亡域結(jié)構蛋白(FADD)的含量變化；real-time PCR法檢測各組腸組織酪氨酸羥化酶(TH)和多巴胺β-羥化酶(DBH)的mRNA表達水平。結(jié)果：小鼠CLP術后20 h，可見膿毒癥模型組小鼠腸絨毛壞死并伴有大量炎癥細胞浸潤；模型組腸組織caspase-3降解片段顯著增多，線粒體Bax、胞漿Cyt C及總蛋白Fas、FasL含量顯著增高，而總蛋白Bcl-2含量明顯降低，F(xiàn)ADD未見明顯改變；膿毒癥模型組腸組織TH、DBH的mRNA表達明顯增高。術后給予小檗堿治療后可顯著減輕腸組織炎癥，逆轉(zhuǎn)caspase-3降解片段、Bax、Cyt C、Fas、FasL、Bcl-2蛋白和TH、DBH mRNA的表達。結(jié)論：小檗堿可顯著抑制膿毒癥小鼠腸上皮細胞凋亡，其機制可能與抑制內(nèi)、外源性凋亡途徑有關。

小檗堿； 膿毒癥； 腸； 細胞凋亡； 去甲腎上腺素

2015年的國際膿毒癥會議將膿毒癥定義為機體對感染的失控性反應進而導致危及生命的器官功能障礙[1]，由膿毒癥引起的多器官功能障礙是ICU患者死亡的重要原因[2-3]。腸道被認為是膿毒癥所致多器官功能障礙的始發(fā)器官，是“腸-肝-肺”軸的第一步[4]。膿毒癥時，外周神經(jīng)系統(tǒng)興奮性增強，血液中去甲腎上腺素(norepinephrine，NE)含量升高[5-6]。在腸黏膜和黏膜下神經(jīng)叢分布有很多去甲腎上腺素能神經(jīng)元，它們產(chǎn)生的NE 被稱為“腸源性去甲腎上腺素”。腸道產(chǎn)生的NE大部分進入血液循環(huán)后又擴散到腸系膜組織，這種高濃度的NE可進一步滲透到腸腔從而造成腸組織損傷[7-8]。腸源性NE在膿毒癥性肝損傷中也發(fā)揮重要作用[9]，NE還可促進放射線誘導的腸上皮細胞凋亡[10]。

我們前期的研究發(fā)現(xiàn)，小檗堿(berberine,Ber)可減輕脂多糖性肝損傷[11]。我們進一步研究又發(fā)現(xiàn)，小檗堿還能減輕內(nèi)毒素誘導的小鼠腸損傷、膿毒癥性腸損傷，并抑制腸上皮細胞凋亡，但其作用機制尚不清楚[12-13]。另外，膿毒癥時小檗堿對腸源性NE產(chǎn)生和釋放的影響亦未見報道。本實驗中，我們將對小檗堿抑制膿毒癥性腸上皮細胞凋亡的機制進行研究，并初步探討小檗堿對腸源性NE產(chǎn)生和釋放的影響。

材 料 和 方 法

1 實驗動物

8～10周雄性C57BL/6鼠，體重為21～23 g，購自廣州中醫(yī)藥大學動物中心，合格證號為SCXK(粵)2013-0034。實驗小鼠分籠飼養(yǎng)，自由飲水進食，在實驗前放在實驗環(huán)境中隔離檢測10 d，相對濕度控制在60%～80%，溫度控制在(24±2)℃。動物處理符合暨南大學實驗動物管理的相關規(guī)定。

2 主要試劑、器材與儀器

中性硫酸小檗堿、戊巴比妥鈉均購自Sigma，實驗前用蒸餾水或生理鹽水配制成實驗所需濃度；線粒體蛋白提取試劑盒購自Thermo Scientific；抗Fas、FasL、Fas相關死亡結(jié)構域蛋白(Fas associated protein with death domain,FADD)抗體購自Abcam；抗 GAPDH、VDAC(線粒體內(nèi)參照)、Bax、Bcl-2、細胞色素C(cytochrome C，Cyt C)、cleaved caspase-3和caspase-3抗體購自CST；辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔 II 抗購自北京鼎國生物科技有限公司；BCA 法蛋白定量試劑盒購自上海申能博彩生物科技有限公司；ECL發(fā)光液試劑盒購自Pierce。

固定板、無菌洞巾、持針器、縫針、縫線、有(無)齒鑷、直(彎)剪、眼科剪、眼科鑷、注射器、手術刀、刀片等均由暨南大學附屬第一醫(yī)院提供。此處，還應用到Western blot實驗裝置(Bio-Rad)、BI2000 圖像分析系統(tǒng)(成都泰盟電子有限公司)、real-time PCR儀(Roche)及BX40 型光學顯微鏡 (Olympus)。

3 方法

3.1 實驗分組及模型建立 將C57BL/6小鼠隨機分為4組：假手術組(sham組)；膿毒癥模型組，即盲腸結(jié)扎穿孔(cecal ligation puncture，CLP)組;小檗堿治療組(CLP+Ber組)；小檗堿對照組(sham+Ber組)。膿毒癥模型組小鼠腹腔注射0.67%戊巴比妥鈉(0.01 mL/g)全身麻醉，仰臥位固定，備皮、消毒，無菌操作行盲腸結(jié)扎穿孔術。假手術組除不結(jié)扎盲腸和穿孔外，其余操作均與CLP組相同。術后2 h內(nèi)，假手術組和模型組予以雙蒸水灌胃(0.01 mL/g)、小檗堿治療組和小檗堿對照組予以小檗堿(50 mg/kg，0.01 mL/g)灌胃。

3.2 腸組織病理學檢查 術后20 h處死小鼠，在距離盲腸末端1 cm處取回腸組織標本，棄去腸內(nèi)容物后迅速置于4%甲醛溶液中固定，常規(guī)方法制備石蠟切片，HE染色，在光學顯微鏡下觀察各組小鼠回腸組織結(jié)構改變。

3.3 Western blot法檢測腸組織線粒體蛋白Bax、胞漿蛋白Cyt C的含量 各組小鼠術后20 h處死，取200 mg回腸組織，加入3 mL PBS清洗2次后剪碎組織，按照線粒體提取試劑盒說明書加入相應試劑，提取線粒體蛋白和胞漿蛋白，分別用于Bax和Cyt C的含量測定。

3.4 Western blot法檢測腸組織總蛋白cleaved caspase-3、caspase-3、Bcl-2、Fas、FasL、FADD的含量 各組小鼠術后20 h處死，取50 mg回腸組織，用生理鹽水(4 ℃) 沖洗，濾紙吸干，加入1 mL 的 RIPA 裂解液(含終濃度為1 mmoL/L的PMSF)，充分勻漿，冰面靜置 30 min，4 ℃、15 000×g離心15 min。BCA蛋白定量試劑盒檢測腸組織勻漿液中總蛋白含量。按每個泳道孔加入5～10 μg蛋白樣品進行SDS-PAGE。Bio-Rad 半干轉(zhuǎn)印儀12 V～18 V 恒壓轉(zhuǎn)印10 min至PVDF膜上。封閉1 h后分別加入1∶1 000稀釋的兔抗小鼠cleaved caspase-3、caspase-3、Bcl-2、Fas、FasL、FADD抗體，以 GAPDH為內(nèi)參照，4 ℃過夜孵育。加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔Ⅱ抗孵育液，室溫孵育 1 h?；瘜W發(fā)光法檢測抗原抗體復合物含量，BI2000 軟件分析蛋白條帶的積分光密度值，以目的蛋白與GAPDH 積分光密度比值來分析結(jié)果。

3.5 Real-time PCR法檢測小鼠腸組織酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase, TH)、多巴胺β-羥化酶(dopamine beta hydroxylase, DBH)的mRNA表達 各組小鼠術后20 h處死，取出50 mg回腸組織加入1 mL的TRIzol液充分勻漿后采用TRIzol法提取RNA，使用 NanoDrop-1000 測定 RNA 濃度和純度，所獲得的RNA 溶液A260/A280比值范圍在1.8～2.1 之間，取總 RNA 1 000 ng 反轉(zhuǎn)錄合成 cDNA；按照 SYBR? PrimeScriptTM反轉(zhuǎn)錄試劑盒II體系說明加入相應的cDNA、H2O、引物、Taq酶和熒光染料充分混合后置于LightCycler?480 實時熒光定量PCR儀進行反應。設置程序如下：95 ℃ 30 s；95 ℃10 s、60 ℃10 s、72 ℃10 s，40個循環(huán)；在72 ℃采集熒光信號并繪制熔解曲線，根據(jù)熔解曲線來衡量產(chǎn)物特異性。PCR反應引物如下：TH 上游引物為5′-GGTTCAGCAGTGAGGAGGTC-3′，下游引物為5′-GGGGCGTAGTCATACAGAGC-3′；DBH 上游引物為5′-TTCTTGAAGGAACGGACTGG-3′，下游引物為5′-GGCATGACGGATGTACTGTG-3′； GAPDH 上游引物為5′-TCACCACCATGGAGAAGGC-3′，下游引物為5′-GCTAAGCAGTTGGTGGTGCA-3′。每個PCR反應設置3個復孔，用10倍稀釋后的樣品分別制作TH、DBH和GAPDH的標準曲線來計算該基因的擴增效率，并將實際的擴增效率帶入系統(tǒng)軟件中計算。

4 統(tǒng)計學處理

用SPSS 13.0軟件進行數(shù)據(jù)處理。計量資料以均數(shù)±標準誤(mean±SEM)表示，多組間比較用單因素方差分析：各組方差齊時，采用SNK法進行兩兩比較；各組方差不齊時，用Tamhane’s T2法進行兩兩比較。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 小腸組織病理學改變

光學顯微鏡下可見，CLP術后20 h，小鼠腸絨毛壞死、大量炎癥細胞浸潤； 腸腔可見大量炎癥細胞、紅細胞及脫落壞死組織；小檗堿治療組腸絨毛及腸腔內(nèi)炎癥細胞浸潤、出血明顯輕于CLP組；各對照組腸道組織結(jié)構正常，腸絨毛結(jié)構清晰，見圖1。

2 小檗堿可顯著抑制膿毒癥小鼠腸道組織caspase-3的降解

如圖2所示，小鼠CLP術后 20 h，與假手術組相比，CLP組腸組織 caspase-3降解片段明顯增多(P<0.05)；膿毒癥小鼠術后給予小檗堿灌胃能顯著抑制腸組織caspase-3的切割(P<0.05)。Ber對照組與假手術組相比，腸組織cleaved caspase-3的含量差異無統(tǒng)計學顯著性。

Figure 1.Photomicrograph of intestine from the mice in sham group (A), CLP group (B), CLP+Ber group (C) and sham+Ber group (D). The intestine histological sections were stained with hematoxylin-eosin. Ber: berberine.

圖1 各組小鼠腸組織形態(tài)學改變

Figure 2.The effect of berberine on the protein levels of cleaved caspase-3 in the intestinal tissues 20 h after CLP operation. Mean±SEM.n=6.*P<0.05vssham group;▲P<0.05vsCLP group.

圖2 小檗堿對膿毒癥小鼠腸組織cleaved caspase-3含量的影響

3 小檗堿對膿毒癥小鼠腸組織凋亡相關蛋白表達的影響

與假手術組相比，膿毒癥小鼠腸組織線粒體的Bax、胞漿Cyt C，腸組織總提取蛋白中的Fas、FasL含量顯著增高，Bcl-2含量明顯降低，而FADD的含量未見明顯改變。小檗堿治療組可明顯逆轉(zhuǎn)上述蛋白的改變。假手術組和小檗堿對照組上述指標的差異無統(tǒng)計學顯著性,見圖3。

4 小檗堿對膿毒癥小鼠腸組織TH和DBH mRNA表達的影響

Figure 3.The protein levels of mitochondrial Bax, cytoplasmic cytochrome C, and Bcl-2, Fas, FasL, FADD in ileum total protein were determined by Western blot at 20 h after the operation. Mean±SEM.n=6.*P<0.05vssham group;▲P<0.05vsCLP group.

圖3 小檗堿對膿毒癥小鼠腸組織凋亡相關蛋白表達的影響

TH、DBH和GAPDH均呈現(xiàn)單一的熔解曲線峰，TM值分別為88.5 ℃、87.5 ℃和88.0 ℃，說明PCR引物設計特異性強，擴增產(chǎn)物單一。在小鼠復制膿毒癥模型20 h后，TH 和DBH的mRNA表達均較假手術組顯著增高(P<0.05)，給予小檗堿治療后，TH和DBH的mRNA表達較CLP組明顯降低，差異有統(tǒng)計學顯著性(P<0.05),見圖4。

討 論

本研究中， 我們首先觀察小鼠行盲腸結(jié)扎穿孔術后20 h腸組織形態(tài)學改變。光學顯微鏡下可見，CLP組小鼠腸絨毛充血水腫、壞死，大量炎癥細胞浸潤；腸腔可見大量炎癥細胞、紅細胞及脫落壞死組織。術后2 h內(nèi)給予小檗堿灌胃治療后，小鼠腸腔內(nèi)僅有少量炎癥細胞和壞死脫落組織。這些結(jié)果說明，小檗堿可明顯減輕膿毒癥小鼠腸道的炎癥反應，進一步證實了我們先前報道的結(jié)果[13]。

Gao等[14]發(fā)現(xiàn)，大鼠腹腔注射LPS 24 h后，TUNEL染色顯示小腸上皮細胞凋亡增多，caspase-3降解片段明顯增高。Khailova等[15]研究也發(fā)現(xiàn)，運

Figure 4.The mRNA expression of tyrosine hydroxylase and dopamine β-hydroxylase in the ileum detected by real-time PCR analysis 20 h after CLP operation. Sham group was recognized as a control and data was expressed as the ratio to sham group. Mean±SEM.n=6.*P<0.05vssham group;▲P<0.05vsCLP group.

圖4 小檗堿對膿毒癥小鼠腸組織TH和DBH mRNA表達的影響

用盲腸結(jié)扎穿孔術復制小鼠膿毒癥模型24 h后，腸上皮細胞caspase-3激活的陽性細胞數(shù)顯著增多，服用益生菌可通過激活蛋白激酶B來下調(diào)TLR4的表達，顯著抑制膿毒癥小鼠腸上皮細胞凋亡情況，保護腸屏障。這說明，膿毒癥可導致腸上皮細胞凋亡，進而破壞腸屏障功能，這是膿毒癥腸損傷的一個重要機制。本研究發(fā)現(xiàn)，膿毒癥小鼠術后20 h，回腸組織凋亡蛋白酶caspase-3降解片段顯著增多，而術后給予小檗堿灌胃治療可顯著抑制caspase-3蛋白酶的降解，這表明，抑制腸上皮細胞凋亡可能是小檗堿防治膿毒癥性腸損傷的一個重要機制。

為了進一步驗證小檗堿防治膿毒癥性腸損傷的上述機制，我們采用Western blot檢測小鼠回腸組織中Fas、FasL、FADD的含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)膿毒癥小鼠腸組織Fas和FasL含量顯著增高，而FADD未見明顯改變，運用小檗堿治療均可明顯降低Fas和FasL的含量。Fas是細胞外源性凋亡途徑中重要受體蛋白，F(xiàn)as蛋白識別其配體FasL后，F(xiàn)as三聚化與接頭蛋白FADD結(jié)合形成死亡誘導信號復合物，激活caspase-8、10及其下游的caspase-3，最終導致細胞凋亡。促凋亡蛋白Bid是聯(lián)系外源性凋亡途徑和內(nèi)源性凋亡途徑的中間介質(zhì)[16]。在Bid作用下，內(nèi)源性凋亡途徑激活，線粒體外膜通透性增加，細胞色素C通過線粒體PT孔釋放到胞漿，進一步激活caspase-9而導致細胞凋亡。于是我們進一步檢測小鼠回腸組織中線粒體蛋白Bax、胞漿蛋白Cyt C及總蛋白中Bcl-2的含量改變。結(jié)果顯示，小鼠CLP術后20 h，膿毒癥模型組腸組織線粒體Bax、胞漿Cyt C含量顯著增高，總蛋白中Bcl-2含量明顯降低。運用小檗堿灌胃治療可明顯逆轉(zhuǎn)線粒體Bax、胞漿Cyt C及總蛋白Bcl-2的上述改變。這些結(jié)果進一步證明，抑制腸上皮細胞凋亡是小檗堿抑制膿毒癥性腸損傷的重要機制。Perrone等[17]研究也發(fā)現(xiàn)，膿毒癥小鼠24 h腸組織蛋白Bax、Fas、FasL顯著增高，Bcl-2被顯著抑制，而FADD有增高的趨勢但差異無統(tǒng)計學顯著性，這與我們的結(jié)果一致。以上結(jié)果可見，小檗堿可通過抑制內(nèi)、外源性凋亡通路來抑制膿毒癥所致的腸上皮細胞凋亡。

有報道稱[18]，在膿毒癥早期(2 h)大鼠肝門靜脈和循環(huán)中NE含量增高，且門靜脈中NE含量較循環(huán)中NE含量顯著增多；相反，當CLP造模之前切除大鼠腸道可以阻止NE的升高。腸源性NE通過α2-AR受體途徑可促進肝臟枯否氏細胞釋放TNF-α，導致肝功能障礙[5, 9]。膿毒癥時腸源性NE的產(chǎn)生對腸自身亦可造成不良影響[8]。研究發(fā)現(xiàn)，NE可促進放射線誘導的腸上皮細胞凋亡[10]，還可通過下調(diào)Bcl-2的表達而誘導乳鼠內(nèi)皮細胞凋亡[19]。我們前面的研究結(jié)果已經(jīng)證實，小檗堿可以抑制膿毒癥誘導的腸上皮細胞凋亡，而膿毒癥時，小檗堿對腸源性NE的生成和釋放的影響尚不清楚。TH和DBH在組織中常被認為是去甲腎上腺素能遞質(zhì)神經(jīng)支配的特異性標記物，是NE合成的主要限速酶[20]。于是我們提取小鼠腸組織RNA檢測其TH和DBH的mRNA表達。研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠復制膿毒癥模型20 h后，TH和DBH的mRNA表達均較假手術明顯增高，給予小檗堿治療后，TH和DBH的mRNA表達明顯降低。而Zhou等[21]的研究表明，膿毒癥后2 h和20 h，腸組織TH的mRNA水平及蛋白含量顯著增高，這與我們的研究結(jié)果一致。

綜上所述，小檗堿可減輕膿毒癥性腸損傷，抑制內(nèi)源性和外源性的細胞凋亡途徑減輕膿毒癥所致的腸上皮細胞凋亡。然而，小檗堿是否通過抑制腸源性NE的產(chǎn)生和釋放來減輕膿毒癥誘導的腸上皮細胞凋亡，還有待進一步深入驗證。

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(責任編輯： 陳妙玲， 余小慧)

Berberine inhibits enterocyte apoptosis in septic mice

LI Hong-mei, XING Yun, TANG Xiang-xu, YANG Duo-meng, WANG Hua-dong, Lü Xiu-xiu, QI Ren-bin, LU Da-xiang

(DepartmentofPathophysiology,SchoolofMedicine,JinanUniversity，KeyLaboratoryofPathophysiology,StateAdministrationofTraditionalChineseMedicineofThePeople’sRepublicofChina,Guangzhou510632,China.E-mail:twhd@jnu.edu.cn)

AIM: To observe the effects of berberine (Ber) on enterocyte apoptosis in septic mice and its possible mechanism. METHODS: Male C57BL/6 mice (8～10 weeks old) were randomly divided into sham group, cecal ligation and puncture (CLP) group, CLP+Ber group and sham+Ber group. The mice in CLP group underwent CLP ope-ration, and the mice in sham groups suffered a similar operation except the ligation and puncture. After the sham or CLP operation, the mice were administered intragastrically with distilled water or berberine (50 mg/kg) within 2 h. After 20 h, the mice were killed with excess pentobarbital sodium and the ileum tissues were removed. The histological changes of the intestine were observed and the enterocyte apoptosis was examined by determining the protein level of cleaved caspase-3. Furthermore, mitochondrial Bax, cytoplasm cytochrome C (Cyt C) and the total proteins of Bcl-2, Fas, FasL and Fas-associated protein with death domain (FADD) were examined by Western blot. The mRNA expression of tyrosine hydroxylase (TH) and dopamine beta-hydroxylase (DBH) was measured by real-time PCR. RESULTS: The extensive ileum injuries, including remarkably increased leukocytes and necrosis of intestinal villus were observed 20 h after CLP. In CLP group, the protein levels of cleaved caspase-3, cytoplasm Cyt C， as well as Fas, FasL were significantly increased, but the Bcl-2 level was decreased. Bax translocation into mitochondria was promoted. However, FADD was not changed significantly. The mRNA expression of TH and DBH was also increased sharply in CLP group. On the contrary, treatment with berberine made a considerable alleviating alteration in the ileum of the septic mice.CONCLUSION: Treatment with berberine provides protective effects on intestinal injury in septic mice by reducing enterocyte apoptosis, and its possible mechanism may be involved in the inhibition of the endogenous and exogenous apoptosis pathways.

Berberine; Sepsis; Intestine; Apoptosis; Norepinephrine

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△ 通訊作者 Tel: 020-85220241;E - mail: twhd@jnu.edu.cn

R363; R515.3

A

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