劉緒華， 王孝慶， 王中蘇， 趙 航， 錢小偉， 曹 紅， 李 軍

(溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院麻醉科，浙江 溫州 325027)

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姜黃素減弱Aβ25-35致大鼠原代小膠質(zhì)細(xì)胞的神經(jīng)炎癥反應(yīng)*

劉緒華， 王孝慶， 王中蘇， 趙 航， 錢小偉， 曹 紅， 李 軍△

(溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院麻醉科，浙江 溫州 325027)

目的： 研究姜黃素(Cur)對(duì)β-淀粉樣蛋白(Aβ)刺激下大鼠原代小膠質(zhì)細(xì)胞活力及高遷移率族蛋白1(HMGB1)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)表達(dá)的影響。方法：取新生SD大鼠大腦皮層行混合膠質(zhì)細(xì)胞原代培養(yǎng)，搖床振搖法分離小膠質(zhì)細(xì)胞并行Iba-1免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定。在培養(yǎng)的小膠質(zhì)細(xì)胞中加入Aβ25-35作用24 h后，觀察細(xì)胞形態(tài)并用CCK-8實(shí)驗(yàn)確定造模濃度及Cur的治療濃度。將大鼠原代小膠質(zhì)細(xì)胞分為5組：正常組、Aβ25-35模型組、Cur組、Aβ25-35+Cur治療組、Aβ25-35+DMSO組；用Western blot法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)HMGB1、晚期糖基化終末產(chǎn)物受體(RAGE)、NF-κB的表達(dá)情況，取上清液用ELISA檢測(cè)HMGB1、IL-1β、TNF-α的表達(dá)。結(jié)果：Iba-1的陽(yáng)性率在95%以上，培養(yǎng)的大鼠原代小膠質(zhì)細(xì)胞可用于實(shí)驗(yàn)。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果示Aβ25-35活化誘導(dǎo)后，細(xì)胞內(nèi)的HMGB1、RAGE和NF-κB表達(dá)明顯升高(P<0.05)，加入姜黃素后細(xì)胞內(nèi)的HMGB1、RAGE和NF-κB表達(dá)明顯減少(P<0.05)。ELISA結(jié)果示Aβ25-35活化誘導(dǎo)后，細(xì)胞上清液中HMGB1、IL-1β、TNF-α明顯升高(P<0.05)，加入姜黃素后上清液中HMGB1、IL-1β、TNF-α明顯下降(P<0.05)。結(jié)論：姜黃素可明顯抑制Aβ25-35刺激下大鼠原代小膠質(zhì)細(xì)胞的神經(jīng)炎癥反應(yīng)。

阿爾茨海默??； 姜黃素； β-淀粉樣蛋白； 小膠質(zhì)細(xì)胞； 高遷移率族蛋白1

阿爾茲海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一種常見進(jìn)行性神經(jīng)退行性疾病。目前認(rèn)為β-淀粉樣蛋白(amyloid-β，Aβ)沉積引發(fā)的神經(jīng)炎癥反應(yīng)在AD過程中起核心作用，這一炎癥過程由激活小膠質(zhì)細(xì)胞(microglial，MG)誘導(dǎo)產(chǎn)生的炎性因子以及相關(guān)信號(hào)通路所驅(qū)動(dòng)，最終導(dǎo)致突觸和神經(jīng)元的損害[1]。高遷移率族蛋白1(high mobility group box-1 protein，HMGB1)是存在于真核細(xì)胞核內(nèi)的非組蛋白染色體結(jié)合蛋白，可直接促進(jìn)炎癥介質(zhì)釋放，調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)和組織損傷，因此HMGB1被認(rèn)為是一些神經(jīng)退行性疾病的危險(xiǎn)因素[2-4]。姜黃素(curcumin，Cur)是從傳統(tǒng)中藥姜黃的根莖中提取出來(lái)的一種脂溶性酚類色素，具有抗炎、抗氧化、抗斑塊、清除氧自由基、抗纖維化及防癌、抗癌等多種藥理作用[5]。本研究采用大鼠原代培養(yǎng)小膠質(zhì)細(xì)胞，用Aβ的活性片段Aβ25-35誘導(dǎo)活化大鼠原代培養(yǎng)小膠質(zhì)細(xì)胞建立炎癥模型，觀察姜黃素對(duì)Aβ刺激下大鼠原代小膠質(zhì)細(xì)胞活力、HMGB1、白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)表達(dá)的影響，探討姜黃素對(duì)AD作用的可能機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 動(dòng)物

SPF級(jí)SD大鼠，雌雄不限，1～3 d 齡，由溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,動(dòng)物許可證編號(hào)為SCXK(浙)2010-0044。小膠質(zhì)細(xì)胞由大鼠大腦皮層分離提取。

2 主要試劑

Aβ25-35、姜黃素購(gòu)自Sigma；DMEM/F12培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)自Gibco；anti-Iba1 antibody購(gòu)自Wako；CCK-8檢測(cè)試劑購(gòu)自Dojindo；晚期糖基化終末產(chǎn)物受體(receptor for advanced glycation end products,RAGE)抗體、HMGB1抗體、NF-κB抗體、Toll樣受體4(Toll like receptor 4,TLR4)抗體購(gòu)自Abcam；小鼠HMGB1、IL-1β和TNF-α ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自R&D；小鼠多克隆抗β-actin抗體購(gòu)自Bioworld。

3 主要方法

3.1 大鼠原代小膠質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)和純度鑒定 取新生1～3 d 的SD大鼠，消毒后沿頭部縱軸打開顱腔分離出大腦皮質(zhì)，置于胰蛋白酶中剪成細(xì)小碎塊并消化5 min，加入等體積DMEM/F12培養(yǎng)基終止消化，吸管吹打分散成單細(xì)胞懸液并過濾。濾過液離心后吸去上清液，用上述DMEM/F12培養(yǎng)基重新懸浮細(xì)胞，以4×108/L細(xì)胞數(shù)接種于多聚賴氨酸包被的25 mL培養(yǎng)瓶中，置37 ℃、5% CO2及飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，約9～10 d細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶底后再次換液，次日置于37 ℃恒溫?fù)u床中以260 r/min振速搖動(dòng)處理2 h，收集搖晃下來(lái)的細(xì)胞懸液并接種到25 mL培養(yǎng)瓶和放置于蓋玻片的6孔板中，37 ℃、5% CO2及飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h，棄去未貼壁細(xì)胞，獲得的細(xì)胞即為純化的小膠質(zhì)細(xì)胞。將原代小膠質(zhì)細(xì)胞接種于6孔板中，用Iba1多克隆抗體(1∶500)標(biāo)記小膠質(zhì)細(xì)胞，用DAPI染核在熒光顯微鏡下觀察、采集圖像。通過計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)算細(xì)胞純度，隨機(jī)抽取10張細(xì)胞蓋片顯微鏡下觀察和照相并隨機(jī)抽取10個(gè)視野計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞，用Iba1染成紅色的為小膠質(zhì)細(xì)胞(陽(yáng)性細(xì)胞)。計(jì)算其與視野內(nèi)總細(xì)胞(用DAPI染成藍(lán)色)的比值，其平均值即為細(xì)胞純度，陽(yáng)性率大于95%以上即可用于實(shí)驗(yàn)。

3.2 CCK-8法測(cè)細(xì)胞活力 取大鼠原代小膠質(zhì)細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化后，吹打成單細(xì)胞懸液，將各組細(xì)胞按5×107/L的密度接種于96孔板上。16～24 h后細(xì)胞單層鋪滿孔底，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液，換液，各組加入不同梯度的藥物濃度。孵育24 h后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1 h，用酶標(biāo)儀測(cè)定在450 nm處的吸光度。細(xì)胞活力(%)=(各處理組吸光度-空白組吸光度)/(對(duì)照組吸光度-空白組吸光度)。

3.3 實(shí)驗(yàn)分組 將大鼠原代培養(yǎng)小膠質(zhì)細(xì)胞分為5組：正常組(normal cell組)：不做任何處理； Aβ25-35模型組：40 μmol/L Aβ25-35刺激細(xì)胞24 h；Cur組：加入終濃度為10 μmol/ L 的Cur孵育(姜黃素被溶解于DMSO中)細(xì)胞24 h； Aβ25-35+Cur治療組：同時(shí)加入10 μmol/L的姜黃素和40 μmol/L的Aβ25-35共同孵育細(xì)胞24 h； Aβ25-35+DMSO組：同時(shí)加入終濃度為10 μmol/L的Aβ25-35和0.2% DMSO共同孵育細(xì)胞24 h。

3.4 Western blot分析 細(xì)胞接種在6孔板中，分組方法同上。24 h后收獲細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，經(jīng)制膠、上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、孵育 I 抗、 II 抗后曝光，用Quantity One軟件分析目的蛋白HMGB1、RAGE、TLR4、NF-κB、內(nèi)參照蛋白β-actin的平均光密度值。

3.5 ELISA檢測(cè)HMGB1、IL-1β、TNF-α在培養(yǎng)上清中的濃度 細(xì)胞接種在6孔板中，分組方法同上。24 h后提取上清液。按ELISA試劑盒說明書操作，測(cè)定上清液中HMGB1、IL-1β、TNF-α的濃度。用酶標(biāo)儀測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)品及樣本吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度和吸光度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣本HMGB1、IL-1β、TNF-α濃度。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，應(yīng)用SPSS 19.0及GraphPad Prism5統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析并作圖。組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，方差齊則組內(nèi)兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)，否則采用Tamhane’s T2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 大鼠原代小膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果

1.1 倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài) 混合細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，細(xì)胞貼壁，可見透光性較好的小膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞及部分紅細(xì)胞。10 d左右細(xì)胞分層，上層為半貼壁，呈圓形，透光性較好，主要為小膠質(zhì)細(xì)胞及少量的少突膠質(zhì)細(xì)胞，下層細(xì)胞主要為星形膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元。通過機(jī)械振搖法分離后的小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)基本不變。接種約1 h后，小膠質(zhì)細(xì)胞貼壁。培養(yǎng)24 h后，小膠質(zhì)細(xì)胞完全貼壁，形態(tài)不規(guī)則，多為蜘蛛狀、梭形及橢圓形，見圖1。

Figure 1.The morphological observation of the microglial cells after purification by mechanical shaking separation under inverted microscope.

圖1 倒置顯微鏡正常小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)

1.2 小膠質(zhì)細(xì)胞的純度鑒定 Iba-1是小膠質(zhì)細(xì)胞、巨噬細(xì)胞表面的特異性抗原，且不會(huì)與神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)生交叉反應(yīng)。小膠質(zhì)細(xì)胞Iba-1免疫熒光術(shù)鑒定顯示小膠質(zhì)細(xì)胞陽(yáng)性率達(dá)95%以上，見圖2。

Figure 2.The specific marker Iba-1 expression of microglia by immunofluorescence staining.

圖2 小膠質(zhì)細(xì)胞中特異性標(biāo)志物Iba-1的表達(dá)

2 造模濃度、時(shí)間和治療濃度的確定

2.1 Aβ25-35對(duì)大鼠原代小膠質(zhì)細(xì)胞存活率的影響 在細(xì)胞培養(yǎng)基中加入不同濃度的Aβ25-35(5、10、20、40、80 μmol/L)，細(xì)胞活力明顯下降，且呈時(shí)間與劑量依賴性(P<0.05)，見表1。如圖3所示，小膠質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)后6 h細(xì)胞活力開始下降，約24 h 下降達(dá)高峰值，此后為一平臺(tái)，細(xì)胞活力變化不大。故選擇造模時(shí)間為24 h，通過計(jì)算得到其半抑制濃度(IC50)為63.17 μmol/ L，為此選擇Aβ25-35的造模濃度為40 μmol/ L。

2.2 姜黃素對(duì)大鼠原代小膠質(zhì)細(xì)胞存活率的影響 觀察不同濃度姜黃素(1.25、2.5、5、10、20 μmol/L)

Figure 3.The effect of Aβ25-35at different concentrations on the activity of microglia at different time points. Mean±SD.n=16.

圖3 Aβ25-35對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞活力的影響

表1 不同濃度Aβ25-35作用不同時(shí)間對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞活力的影響

Table 1.The effects of Aβ25-35on the viability of microglial cells at different concentrations and different time points (Mean±SD.n=16)

Aβ25-356h12h24h36h48h0μmol/L100.12±15.02125.32±9.36130.45±12.35128.34±16.18135.24±12.615μmol/L97.34±13.15*98.73±5.14**90.48±8.13**91.24±19.25**92.75±20.27**10μmol/L95.75±15.04*90.89±6.08**85.73±19.31**87.35±4.05**85.36±17.31**20μmol/L90.58±21.24*85.36±15.03**80.16±8.27**78.54±22.16**79.38±3.62**40μmol/L87.34±13.17*80.58±2.02**75.56±21.26**74.39±6.34**72.56±21.38**80μmol/L75.78±5.26**50.58±21.01**45.49±16.16**47.57±14.26**40.67±17.39**

*P<0.05，**P<0.01vs0 μmol/L group.

作用24 h后對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞存活率的影響。如圖4所示，20 μmol/L Cur對(duì)細(xì)胞的毒性明顯強(qiáng)于陰性對(duì)照組和其它幾組，抑制率可達(dá)51.7%。因此選擇對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞沒有抑制作用的最高姜黃素濃度為10 μmol/ L，與空白對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。

3 倒置顯微鏡下各組小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變

正常組小膠質(zhì)細(xì)胞在孵育4 h左右即能貼壁，胞體較小，少量細(xì)胞有細(xì)小突起；Aβ25-35組和Aβ25-35+DMSO組貼壁速度明顯慢于正常組，細(xì)胞出現(xiàn)聚集狀態(tài)，胞體伸出一個(gè)或多個(gè)樹枝狀突起，連接周圍細(xì)胞，突起粗大；Cur組和Aβ25-35+Cur組的細(xì)胞胞體肥大，核仁明顯，細(xì)胞間以突觸相連，見圖5。

4 Aβ和姜黃素對(duì)大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞HMGB1表達(dá)的影響

與正常組相比，Aβ25-35活化誘導(dǎo)24 h后，HMGB1的表達(dá)明顯升高(P<0.05)，單純姜黃素處理對(duì)HMGB1影響不明顯。Aβ25-35+Cur組加入姜黃素共同孵育后，與Aβ25-35組相比，HMGB1明顯下降(P<0.05)，而DMSO與Aβ25-35(DMSO為姜黃素的溶劑)共同孵育后，HMGB1表達(dá)較Aβ25-35組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見圖6。

Figure 4.The effect of Cur at different concentrations on the activity of microglia cells. Mean±SD.n=15.*P<0.05vs0 μmol/L.

圖4 Cur對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞活力的影響

Figure 5.The morphological changes of the microglia under inverted microscope (×20).

圖5 倒置顯微鏡下小膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)改變

5 Aβ和姜黃素對(duì)大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞RAGE、TLR4及NF-κB表達(dá)的影響

Aβ25-35活化誘導(dǎo)24 h后，RAGE、TLR4 and NF-κB的表達(dá)明顯升高(P<0.01)，單純姜黃素處理對(duì)三者無(wú)明顯影響,Aβ25-35和姜黃素共同孵育后，RAGE、TLR4和NF-κB均明顯下降(P<0.05)。DMSO與Aβ25-35共同孵育后，RAGE、TLR4、NF-κB表達(dá)較Aβ25-35組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見圖6。

6 Aβ和姜黃素對(duì)大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)上清中HMGB1、IL-1β和TNF-α濃度的影響

與正常組相比，Aβ25-35活化誘導(dǎo)24 h后，上清液中的HMGB1、 IL-1β和TNF-α明顯升高(P<0.01)。Aβ25-35與姜黃素共同孵育后，HMGB1、 IL-1β和TNF-α明顯下降(P<0.01)。DMSO與Aβ25-35(DMSO為姜黃素的溶劑)共同孵育后，HMGB1、IL-1β和TNF-α較Aβ25-35單獨(dú)處理組的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見圖7。

Figure 6.The protein levels of HMGB1, RAGE, TLR4 and NF-κB in the microglia with different treatments. Mean±SD.n=13.*P<0.05,**P<0.01vsnormal cell group;#P<0.05,##P<0.01vsAβ25-35group.

圖6 各組HMGB1、RAGE、TLR4和NF-κB的蛋白水平比較

討 論

人們一直認(rèn)為Aβ沉積是導(dǎo)致AD的主要原因，但隨著研究的深入，與 Aβ清除直接相關(guān)的MG逐漸被重視。在AD病程進(jìn)展的不同階段MG起到了不同的作用，在可見的Aβ形成之前MG的積聚是有益的，在AD的早期階段MG起到了吞噬和清除Aβ的作用，從而保護(hù)大腦不受到Aβ的毒性損傷；隨著病情的進(jìn)展，MG對(duì)Aβ的清除能力逐漸下降[1]，大量Aβ沉積使MG活化并增殖，并過量釋放NO、TNF-α、IL-6等促炎因子，介導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞的炎癥損傷。因此，MG在AD的病情發(fā)展中起到了至關(guān)重要的作用。本研究采用原代小膠質(zhì)細(xì)胞建立AD模型，相較于細(xì)胞株更貼近體內(nèi)環(huán)境，能更好地模擬AD，因此更具說服力及研究?jī)r(jià)值。

Figure 7.The releases of HMGB1, IL-1β and TNF-α in the culture supernatant in each group. Mean±SD.n=8.**P<0.01vsnormal cell group;##P<0.01vsAβ25-35group.

圖7 各組上清液中HMGB1、IL-1β和TNF-α濃度比較

AD中Aβ的重要形式是Aβ1-40和Aβ1-42，Aβ斑塊中最主要的成分是Aβ1-42，它更易于聚集，有很強(qiáng)的神經(jīng)毒性，Aβ1-40是Aβ主要的可溶性形式，主要存在于血液循環(huán)之中[6]。Aβ25-35被認(rèn)為是Aβ1-42的活性片段，于37 ℃水浴箱孵育7 d左右，即為“聚集”狀態(tài)。但目前關(guān)于小膠質(zhì)細(xì)胞與Aβ相互作用的資料卻甚少。我們的CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示一定時(shí)間內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞活性隨著Aβ25-35濃度增大而減小，24 h后無(wú)明顯變化。故選擇24 h為造模時(shí)間，Aβ的造模濃度為40 μmol/L。

近年來(lái)的研究表明，HMGB1可能在記憶損害相關(guān)性疾病、慢性神經(jīng)退行性變疾病及進(jìn)行性神經(jīng)炎癥相關(guān)疾病中發(fā)揮關(guān)鍵作用[2]。臨床研究證明，AD 患者顳葉皮質(zhì)中的HMGB1水平升高[3]。在腦室內(nèi)注射 Aβ建立的 AD 動(dòng)物模型中，腦室內(nèi)注射HMGB1加劇神經(jīng)元的死亡，并延遲淀粉樣蛋白的清除[4]。離體細(xì)胞實(shí)驗(yàn)也表明，原代培養(yǎng)的MG同時(shí)加入 Aβ1-42和HMGB1，Aβ1-42在細(xì)胞表面聚集增加，HMGB1 抑制MG對(duì) Aβ1-42的吞噬作用[3-4]。HMGB1 還抑制MG對(duì) Aβ1-40的降解，延遲 Aβ1-40的清除。以上研究均表明HMGB1 在 AD 發(fā)病機(jī)制中可能發(fā)揮重要作用，但其具體的機(jī)制至今尚不明確。HMGB1引起的損傷是通過 TLR4 和 RAGE 兩者共同介導(dǎo)的[7]。RAGE是最早被確定的HMGB受體，兩者結(jié)合通過激活 Ras 或 p38MAPK、ERK1/2，最終激活 NF-κB[8-9]。HMGB1與 TLR4結(jié)合后激活 MyD88、IL-1 受體相關(guān)激酶、TNF 受體相關(guān)因子等使IκB磷酸化降解從而激活NF-κB[10-11]。NF-κB 過度活化誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞諸多炎癥因子及酶的表達(dá)如 TNF-α、IL-1β、iNOS 等，導(dǎo)致炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)引起神經(jīng)元凋亡[12]。本研究用Western blot法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與正常組小膠質(zhì)細(xì)胞相比，Aβ25-35模型組HMGB1、RAGE、TLR4和NF-κB的表達(dá)顯著升高，說明Aβ增加了HMGB1的表達(dá)，促進(jìn)了NF-κB通路活化。

姜黃素作為一種香料被廣泛用于食品中。研究發(fā)現(xiàn)姜黃素促進(jìn)AD患者巨噬細(xì)胞吞噬Aβ[13]，破壞Aβ 纖維前體的穩(wěn)定性[14]，并且減少Aβ誘導(dǎo)的氧自由基產(chǎn)物水平。本研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素是一種抗炎藥物，能抑制小膠質(zhì)細(xì)胞釋放炎癥介質(zhì)。但是姜黃素在AD中的具體抗炎機(jī)制目前還不明確。本研究條件下，與Aβ25-35模型組相比，Aβ25-35+Cur治療組的HMGB1、RAGE、TLR4、NF-κB的蛋白水平顯著下降，提示姜黃素可能通過下調(diào)HMGB1的表達(dá)，抑制NF-κB信號(hào)通路來(lái)減弱小膠質(zhì)細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，從而對(duì)AD起到治療作用。

總之，Aβ25-35可活化誘導(dǎo)大鼠原代小膠質(zhì)細(xì)胞分泌IL-1β、TNF-α等炎癥因子，姜黃素可減輕其細(xì)胞毒性和炎癥反應(yīng)，機(jī)制可能與下調(diào)HMGB1的表達(dá)，抑制NF-κB通路的促炎癥反應(yīng)有關(guān)。

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(責(zé)任編輯： 林白霜， 余小慧)

Curcumin reduces neuroinflammation stimulated by Aβ25-35in primary rat microglial cells

LIU Xu-hua, WANG Xiao-qing, WANG Zhong-su, ZHAO Hang, QIAN Xiao-wei, CAO Hong, LI Jun

(DepartmentofAnesthesiology,TheSecondAffiliatedHospitalofWenzhouMedicalUniversity,Wenzhou325027,China.E-mail:lijun0068@163.com)

AIM: To investigate the effects of curcumin (Cur) on the expression of High mobility group box 1 protein (HMGB1), interleukin-1β (IL-1β), tumor necrosis factor-α (TNF-α) in amyloid-β (Aβ)-induced primary rat microglial cells. METHODS: Microglia were derived from the cerebral cortices of postnatal rat brains. The cells were identified by immunocytochemistry using mouse anti rat Iba-1 monoclonal antibody. A cell model using primary rat microglial cells incubated with Aβ25-35as an inflammation model of Alzheimer’s disease (AD) was set up. The morphological characters of primary rat microglial cells were observed. The concentration of Aβ25-35and the treatment concentration of curcumin were selected by CCK-8 assay. Cultured primary rat microglial cells were divided into 5 groups: normal cell group, Aβ25-35group, Cur group, Aβ25-35+Cur group and Aβ25-35+DMSO group. The expression of HMGB1, NF-κB, and receptor for advanced glycation end products (RAGE) was detected by Western blot. The levels of HMGB1, IL-1β, and TNF-α in the culture supernatant were measured by ELISA. RESULTS: The purity of primary microglias determined by Iba-1 immunofluorescence was more than 95%. The protein levels of HMGB1, RAGE and NF-κB were significantly increased after Aβ25-35stimulation. After treatment with Cur, the protein levels of HMGB1, RAGE and NF-κB were significantly decreased (P<0.05). The levels of HMGB1, IL-1β and TNF-α in the supernatant were significantly increased after Aβ25-35stimulation. Cur significantly decreased the level of HMGB1, IL-1β and TNF-α in the supernatant. CONCLUSION: Curcumin significantly inhibits neuroinflammation stimulated by Aβ25-35in primary rat microglial cells.

Alzheimer’s disease; Curcumin; Amyloid-β; Microglial; High mobility group box 1 protein

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2016- 01- 25

2016- 07- 01

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 81271204);浙江省科技廳公益項(xiàng)目(No. 2016C37098)

△通訊作者 Tel： 0577-88002925; E-mail： lijun0068@163.com

R363.2; R749.1+6

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.09.017