林佳瓊， 陳美姬， 郭瑞鮮， 張偉杰， 智喜梅， 鄧海鷗， 許 翎， 黎映蘭， 吳 文△

(1南方醫(yī)科大學，廣東 廣州 510515； 2廣東省人民醫(yī)院， 廣東省醫(yī)學科學院，廣東省老年醫(yī)學研究所東病區(qū)內(nèi)分泌科，廣東 廣州 510080； 3中山大學附屬醫(yī)院第一醫(yī)院黃埔院區(qū)兒科，廣東 廣州 510700；4中山大學中山醫(yī)學院生理學教研室，廣東 廣州 510080)

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壞死性凋亡介導高糖引起的人臍靜脈內(nèi)皮細胞損傷*

林佳瓊1, 2， 陳美姬3， 郭瑞鮮4， 張偉杰2， 智喜梅2， 鄧海鷗2， 許 翎2， 黎映蘭2， 吳 文2△

(1南方醫(yī)科大學，廣東 廣州 510515；2廣東省人民醫(yī)院， 廣東省醫(yī)學科學院，廣東省老年醫(yī)學研究所東病區(qū)內(nèi)分泌科，廣東 廣州 510080；3中山大學附屬醫(yī)院第一醫(yī)院黃埔院區(qū)兒科，廣東 廣州 510700；4中山大學中山醫(yī)學院生理學教研室，廣東 廣州 510080)

目的： 研究壞死性凋亡是否介導高糖(HG)誘導的人臍靜脈內(nèi)皮細胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)損傷。方法: CCK-8法檢測細胞存活率；Western blot法測定受體相互作用蛋白3(RIP3)、cleaved caspase-3的蛋白水平；羅丹明123染色熒光顯微鏡照相法檢測線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential，MMP)；雙氯熒光素(DCFH-DA)染色熒光顯微鏡照相法測定胞內(nèi)活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)的水平。結果: 應用不同濃度葡萄糖(10、20和40 mmol/L)處理HUVECs 24 h，RIP3的蛋白水平隨葡萄糖劑量增加而升高，40 mmol/L時達高峰；應用40 mmol/L葡萄糖處理HUVECs 3 h、6 h、9 h、12 h和24 h能上調(diào)RIP3的蛋白水平，于9 h達最高峰；應用20 μmol/L凋亡蛋白酶抑制劑Z-VAD-FMK預處理HUVECs 30 min促進RIP3表達；應用100 μmol/L壞死性凋亡抑制劑necrostatin-1預處理HUVECs 1 h能抑制HG誘導HUVECs的細胞存活率降低，ROS過度生成及MMP丟失，但能升高 cleaved caspase-3的蛋白水平。結論: 壞死性凋亡介導高糖引起的人臍靜脈內(nèi)皮細胞損傷，但與內(nèi)皮細胞凋亡存在負相關。

壞死性凋亡； 細胞凋亡； 高糖； 人臍靜脈內(nèi)皮細胞； Necrostatin-1

高血糖可通過多種病理生理機制引起血管內(nèi)皮細胞功能失調(diào)。血管內(nèi)皮功能異常主要是內(nèi)皮細胞的損傷或死亡導致功能的紊亂，從而導致多種并發(fā)癥的發(fā)生。傳統(tǒng)認為細胞死亡方式包括凋亡、壞死及自噬。既往認為凋亡是caspase依賴的可調(diào)控的程序性細胞死亡[1]，而壞死是一種被動的非可控的細胞死亡方式。然而，近年來，Degterev等[2]報道了一種新的細胞死亡方式，一種與壞死具有相似的形態(tài)學特征，但其方式為可調(diào)控的非caspase依賴性的程序性細胞壞死，即在caspase抑制的條件下，死亡受體與配體的結合可觸發(fā)壞死性凋亡(necroptosis)。受體交互作用蛋白1(receptor-interacting protein 1，RIP1)和受體交互作用蛋白3(receptor-interacting protein 3，RIP3)形成復合物和磷酸化是壞死性凋亡發(fā)生的關鍵，因此是壞死性凋亡發(fā)生的特異性生化標志物[3-4]。我們的研究證實[5]高糖可引起人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞的損傷，包括細胞存活率降低、活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)生成增多、線粒體損傷及細胞凋亡增加，近年，壞死性凋亡被認為是可能參與高血糖引起心肌死亡的一個重要的介導者[6]，因此，我們推測高糖也可以通過壞死性凋亡引起血管內(nèi)皮細胞的損傷。

為此，本文在人臍靜脈內(nèi)皮細胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)建立高糖損傷模型，旨在探討：高糖是否引起HUVECs產(chǎn)生壞死性凋亡；壞死性凋亡與凋亡之間的相互作用；壞死性凋亡是否參與高糖誘導HUVECs的多種損傷。

材 料 和 方 法

1 材料

壞死性凋亡抑制劑necrostatin-1(Nec-1)、凋亡蛋白酶抑制劑Z-VAD-FMK、DCFH-DA和羅丹明123(rhodamine 123，Rh123)購自Sigma；CCK-8試劑盒購自Dojindo；胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購自Gibco；cleaved caspase-3抗體購自Cell Signaling Technology；RIP3抗體購自Abcam；HUVECs購自廣州吉妮歐公司。

2 方法

2.1 人臍靜脈內(nèi)皮細胞的體外培養(yǎng) 細胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)基，同時加入1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素，置于5% CO2、37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞融合達80%后，用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化，適度消化后加完全培養(yǎng)基終止胰蛋白酶的消化作用。用滅菌Tip頭將瓶壁細胞吹落形成細胞懸液。1 200 r/min離心5 min, 棄上清, 按1∶3傳代。實驗前換用無血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)12 h，然后進行分組實驗。

2.2 實驗分組 實驗分為4組：正常對照(control)組；高糖(high glucose, HG)損傷組：應用40 mmol/L葡萄糖處理HUVECs 24 h；Z-VAD-FMK+HG組：20 μmol/L Z-VAD-FMK 作用于HUVECs 30 min，撤去，用PBS洗2次，接著用40 mmol/L葡萄糖作用 24 h；Nec-1+HG組：100 μmol/L Nec-1 作用于HUVECs 1 h，撤去，用PBS洗2次，接著用40 mmol/L葡萄糖作用24 h；Z-VAD-FMK組：20 μmol/L Z-VAD-FMK作用于HUVECs 30 min，撤去，用PBS洗2次，無血清培養(yǎng)基DMEM培養(yǎng)24 h；Nec-1組：100 μmol/L Nec-1作用于HUVECs 1 h，撤去，用PBS洗2次，無血清培養(yǎng)基DMEM培養(yǎng)24 h。

2.3 CCK-8法測定細胞存活率 根據(jù)CCK-8試劑盒說明書檢測HUVECs活力。將HUVECs以每孔5 000細胞的密度接種于96孔板，當細胞生長80%時，給予不同處理。于每孔加入無血清培養(yǎng)基稀釋的CCK-8工作液100 μL，輕搖，37 ℃孵育2 h，使用酶標儀檢測各孔吸光度(A)，波長設定為450 nm。按公式：細胞存活率(%)=處理組A/對照組A×100%，求出處理組細胞存活率，重復5次。

2.4 Western blot法檢測RIP3和cleaved caspase-3的蛋白水平 將HUVECs接種于60 mm培養(yǎng)皿中，貼壁生長至80%時給予不同處理因素，棄培養(yǎng)液，用預冷的PBS洗2次，各皿加入80 μL裂解液后置4 ℃裂解30 min，12 000 r/min離心15 min，取上清，蛋白濃度采用BCA法進行測定?？偟鞍捉?jīng)SDS-PAGE分離后，轉移到PVDF膜上。用5%脫脂奶粉封閉90 min，分別加入抗RIP3和cleaved caspase-3的I抗(1∶1 000)4 ℃過夜，然后用TBST洗10 min 3次，加入II抗(1∶10 000)，室溫孵育60 min，然后再用TBST洗10 min 3次。PVDF膜用ECL發(fā)光液顯色，暗室曝光，凝膠成像系統(tǒng)掃描分析結果。

2.5 細胞內(nèi)ROS含量的檢測 2’-7’-二氯熒光乙酰乙酸鹽(DCFH-DA)是一種自身不能發(fā)熒光的化合物，可自由穿過細胞膜，被胞內(nèi)活性氧氧化為有熒光的DCF。通過檢測DCF的熒光強度即可反映細胞內(nèi)ROS的水平。將HUVECs接種于6孔培養(yǎng)板中，當細胞生長貼壁生長至80%時，給予各實驗組不同的處理因素后，棄培養(yǎng)液，PBS 沖洗3次，將HUVECs與10 μmol/L DCFH-DA于37 ℃孵育30 min，再用PBS沖洗3次。在熒光顯微鏡下隨機選取5個不重復區(qū)攝片，采用ImageJ 1.41軟件分析5個視野綠色熒光強度平均值，進而對每組的各個樣本進行統(tǒng)計分析。實驗重復5次。

2.6 細胞線粒體膜電位(mitochondria membrane potential，MMP)的測定 Rh123是一種可被線粒體吸收的綠色熒光染料，其吸收值隨細胞MMP的改變而變化，因此可根據(jù)其熒光強度來間接反映MMP的高低。將HUVECs接種于6孔培養(yǎng)板中，貼壁生長至大約80%時，給予各實驗組不同的處理因素，棄培養(yǎng)液，用PBS沖洗3次，予10 μg/L Rh123于37 ℃避光孵育45 min, 再用PBS沖洗3次。在熒光顯微鏡下隨機地選取5個不重復區(qū)攝片。用ImageJ 1.41軟件分析各視野平均熒光強度，進而對每組的各個樣本進行統(tǒng)計分析。實驗重復5次。

3 統(tǒng)計學處理

實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，用SPSS 20.0統(tǒng)計學軟件進行統(tǒng)計分析，組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，采用SNK-q檢驗進行均數(shù)之間的兩兩比較，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 壞死性凋亡抑制劑Nec-1對抗高糖引起的細胞毒性

予HG(40 mmol/L葡萄糖)處理HUVECs 24 h，可引起細胞毒性，使細胞存活率降低，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學顯著性(P<0.01)。在高糖處理HUVECs前，予100 μmol/L Nec-1預處理HUVECs 1 h，可明顯抑制HG的細胞毒性，使細胞存活率明顯上升，與HG組相比，差異有統(tǒng)計學顯著性(P<0.01)。而單獨100 μmol/L Nec-1預處理HUVECs 1 h不引起細胞毒性，見圖1。

Figure 1.Inhibitor of necroptosis Nec-1 protected HUVECs against HG-induced cytotoxicity. Mean±SD.n=5.**P<0.01vscontrol；##P<0.01vsHG.

圖1 壞死性凋亡抑制劑Nec-1保護HUVECs對抗高糖引起的細胞毒性

2 高糖促進人臍靜脈內(nèi)皮細胞的RIP3蛋白表達

使用不同濃度(10～40 mmol/L)的葡萄糖處理HUVECs 24 h均能促進RIP3蛋白的表達，與對照組分別相比，差異均有統(tǒng)計學顯著性(P<0.01)，且葡萄糖在40 mmol/L時RIP3的表達最高；使用HG(40 mmol/L)處理HUVECs 3～24 h可上調(diào)RIP3蛋白水平(P<0.01)，其中在9 h時RIP3的表達水平達到最高峰，見圖2。

Figure 2. High glucose (40 mmol/L glucose, HG) up-regulated the expression level of RIP3 in the HUVECs. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol.

圖2 高糖促進HUVECs的RIP3表達

3 壞死性凋亡介導高糖引起的人臍靜脈內(nèi)皮細胞的氧化應激

如圖3顯示，HG處理HUVECs 24 h可使胞內(nèi)DCFH的平均熒光強度(MFI)明顯增強，與正常對照組相比，差異有統(tǒng)計學顯著性(P<0.01)。應用100 μmol/L濃度的Nec-1預處理1 h可使MFI從(163.2±18.5)%減少至(122.0±36.4)%，可明顯抑制HG誘導的胞內(nèi)ROS堆積，與HG組相比，差異有統(tǒng)計學顯著性(P<0.01)。而應用100 μmol/L濃度的Nec-1處理HUVECs 1 h 對胞內(nèi)ROS生成無明顯作用。

Figure 3. The inhibitor of necroptosis Nec-1 reduced HG-induced accumulation of reactive oxygen species (ROS) in the HUVECs. Mean±SD.n=5.**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsHG.

圖3 壞死性凋亡通路抑制劑Nec-1減少高糖引起的HUVECs內(nèi)活性氧的堆積

4 壞死性凋亡介導高糖引起的人臍靜脈內(nèi)皮細胞的線粒體損傷

HG作用HUVECs 24 h使胞內(nèi)Rh123的MFI明顯降低，從(258.2±32.5)%降低至(119.2±9.4)%，兩組比較差異有統(tǒng)計學顯著性(P<0.01)。但是，在HG 處理HUVECs前，應用100 μmol/L濃度的Nec-1預處理1 h可使MFI升高至(169.8±13.4)%，與HG處理組相比，差異有統(tǒng)計學顯著性(P<0.01)。100 μmol/L濃度的Nec-1作用HUVECs 1 h對胞內(nèi)MMP生成無明顯作用，見圖4。

Figure 4. The inhibitor of necroptosis Nec-1 attenuated HG-induced dissipation of mitochondrial membrance potential (MMP) in the HUVECs. Mean±SD.n=5.**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsHG.

圖4 壞死性凋亡通路抑制劑Nec-1減少高糖引起的HUVECs線粒體膜電位丟失

5 壞死性凋亡抑制劑促進HG引起的人臍靜脈內(nèi)皮細胞的凋亡

使用HG處理HUVECs 24 h， cleaved caspase-3的蛋白水平明顯增加，與對照組相比，差異有統(tǒng)計學顯著性(P<0.01)；值得注意的是，在HG處理HUVECs前，應用100 μmol/L濃度的壞死性凋亡抑制劑Nec-1預處理HUVECs 1 h，能明顯促進cleaved caspase-3蛋白水平的上調(diào)，與HG處理組比較，差異有統(tǒng)計學顯著性(P<0.01)。100 μmol/L濃度的Nec-1本身對cleaved caspase-3的基礎水平無明顯影響，見圖5。

6 凋亡抑制劑促進HG引起的人臍靜脈內(nèi)皮細胞的壞死性凋亡

HG處理HUVECs 24 h，RIP3蛋白表達明顯增加，與對照組相比，差異有統(tǒng)計學顯著性(P<0.01)。在HG處理HUVECs前，應用20 μmol/L凋亡蛋白酶抑制劑Z-VAD-FMK預處理HUVECs 30 min明顯促進RIP3蛋白的表達，與HG處理組比較，差異有統(tǒng)計學顯著性(P<0.05)。20 μmol/L濃度的Z-VAD-FMK本身對RIP3的基礎表達水平無明顯影響，見圖6。

Figure 5.The inhibitor of necroptosis Nec-1 up-regulated the protein level of cleaved caspase-3 in the HUVECs. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsHG.

圖5 壞死性凋亡抑制劑Nec-1促進HUVECs的cleaved caspase-3蛋白水平上調(diào)

Figure 6.The inhibitor of apoptosis Z-VAD-FMK enhanced the expression level of RIP3 in the HUVECs. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol;#P<0.05vsHG.

圖6 凋亡蛋白酶抑制劑Z-VAD-FMK促進RIP3蛋白的表達

討 論

既往研究認為，壞死是一種意外死亡，與凋亡程序性死亡截然不同，它是無序的被動死亡，無從調(diào)控。近年，壞死性凋亡的發(fā)現(xiàn)顛覆了傳統(tǒng)的認識，它將為臨床疾病的治療提供新的靶點。壞死性凋亡形態(tài)上既具有壞死的特性(包膜完整性破壞、細胞體積及胞內(nèi)細胞器膨脹)，可以通過釋放損傷相關分子模式(damage-associated molecular patterns，DAMPs)和激活炎癥小體NLRP3而促進炎癥的發(fā)生[7]，又具備有凋亡通路可調(diào)控死亡的程序性。越來越多的研究表明壞死性凋亡在多種疾病和組織損傷如腦缺血、腎損傷及心肌梗死中起著重要作用[8]，Luedde 等[9]報道，在缺血心肌損傷中，RIP3表達增多；敲除RIP3則能保護心肌對抗缺血性損傷。也有研究發(fā)現(xiàn)[10]，壞死性凋亡特別是RIP3與動脈粥樣硬化的發(fā)展有關。近年，高血糖對壞死性凋亡的作用引起學者們的重視。在鏈脲霉素誘導的糖尿病小鼠發(fā)生心肌纖維化和心肌肥厚的同時，伴隨著心肌RIP3表達增多[11]。但是，高糖對血管內(nèi)皮細胞RIP3的影響迄今未明。為了證實壞死性凋亡是否與高糖引起的血管病變有關，我們進行了多方面的探討。本研究觀察到，隨著葡萄糖濃度的增加，HUVECs的RIP3蛋白表達明顯增加，提示HG是誘導血管內(nèi)皮細胞壞死性凋亡的誘導劑。進一步研究還發(fā)現(xiàn)，壞死性凋亡抑制劑Nec-1可以抑制HG引起的血管內(nèi)皮細胞損傷，使細胞存活率升高，ROS生成及MMP丟失均減少。提示HG可以通過壞死性凋亡誘導人臍靜脈內(nèi)皮細胞損傷。

許多研究發(fā)現(xiàn)，RIP1和RIP3形成復合物和磷酸化是壞死性凋亡發(fā)生的關鍵[12-13]，RIP復合物處在凋亡與壞死性凋亡的分叉口，起著決定細胞死亡方式的調(diào)控作用。因此，凋亡與壞死性凋亡存在密切的聯(lián)系，二者存在部分的重合。壞死性凋亡抑制劑Nec-1可以特異性地抑制壞死性凋亡，而不影響正常細胞的生理功能，可明確細胞是否發(fā)生壞死性凋亡。而Caspase抑制劑Z-VAD-FMK是一種泛aspase抑制劑，可以抑制由caspase激活引起的細胞凋亡。對于凋亡與壞死性凋亡的相互轉化，目前研究主要集中于兩個方面。一方面是抑制凋亡后，可以促進壞死性凋亡的發(fā)生[3-4]。本研究也觀察到了這一點，當給予凋亡蛋白酶抑制劑Z-VAD抑制凋亡時，RIP3的表達明顯升高。另一方面，抑制壞死性凋亡可以抑制或促進凋亡發(fā)生。有研究表明，壞死性凋亡抑制劑Nec-1可以降低cleaved caspase-3的蛋白水平[14]。而相反地，Han等[15]發(fā)現(xiàn)，高濃度紫草素可激活癌細胞株HL60的壞死性凋亡通路使細胞死亡，而在使用Nec-1抑制壞死性凋亡后，細胞轉而發(fā)生凋亡。我們在高糖損傷HUVECs模型中，發(fā)現(xiàn)應用Nec-1抑制壞死性凋亡后，cleaved caspase-3的蛋白水平明顯上調(diào)，提示促進細胞轉向凋亡，這與Han等[15]的結果近似。上述這些不同的研究結論提示，在不同的病理損傷及不同的細胞實驗模型中，細胞死亡方式的相互轉化形式可能不盡一致，很值得進一步探討。

綜上所述，本研究證實：(1) HG可誘導HUVECs發(fā)生壞死性凋亡；(2) 壞死性凋亡介導HG引起的氧化應激與線粒體損傷；(3) 壞死性凋亡與凋亡可存在相互轉化，即抑制壞死性凋亡后，細胞死亡可轉化為凋亡，反之亦然。上述結果對進一步揭示糖尿病血管病變病理生理機制有重要的意義。

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(責任編輯： 林白霜， 羅 森)

Necroptosis mediates high glucose-induced injury in human umbilical vein endothelial cells

LIN Jia-qiong1, 2, CHEN Mei-ji3, GUO Rui-xian4, ZHANG Wei-jie2, ZHI Xi-mei2, DENG Hai-ou2, XU Ling2, LI Ying-lan2, WU Wen2

(1SouthernMedicalUniversity,Guangzhou510515,China;2DepartmentofEndocrinology,EastWard,GuangdongGeriatricInstitute,GuangdongAcademyofMedicalSciences,GuangdongGeneralHospital,Guangzhou510080,China;3DepartmentofPediatrics,HuangpuDivisionofTheFirstAffiliatedHospitalofSunYat-senUniversity,Guangzhou510700,China;4DepartmentofPhysiology,ZhongshanSchoolofMedicine,SunYat-senUniversity,Guangzhou510080,China.E-mail:wuwen1964@163.com)

AIM: To explore whether necroptosis contributes to the high glucose (HG)-induced damage in human umbilical vein endothelial cells (HUVECs). METHODS: The protein levels of receptor-interacting protein 3 (RIP3) and cleaved caspase-3 were detected by Western blot. The intracellular levels of reactive oxygen species (ROS) were determined by DCFH-DA staining followed by photofluorography. Mitochondrial membrane potential (MMP) was measured by rhodamine 123 staining followed by photofluorography. RESULTS: Treatment of HUVECs with HG at different concentrations (10, 20 and 40 mmol/L glucose) for 24 h gradually enhanced the expression levels of RIP3. Treatment of HUVECs with HG (40 mmol/L glucose) for different time (3 h, 6 h, 9 h, 12 h and 24 h) also up-regulated the expression levels of RIP3, peaking at 9 h. Pretreatment of HUVECs with 20 μmol/L Z-VAD-FMK (an inhibitor of caspase) for 30 min before exposure to HG enhanced the expression level of RIP3. Pretreatment of HUVECs with 100 μmol/L necrostatin-1 (an inhi-bitor of necroptosis) for 1 h before exposure to HG alleviated the HG-induced injuries, such as a decrease in cell viability, an increase in ROS generation and dissipation of MMP, but up-regulated the protein level of cleaved caspase-3. CONCLUSION: Necroptosis mediates HG-induced injury in HUVECs. There is a negative interacting between necroptosis and apoptosis.

Necroptosis; Apoptosis; High glucose; HUVECs; Necrostatin-1

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1000- 4718(2016)09- 1608- 06

2016- 04- 25

2016- 05- 31

國家自然科學基金資助項目(No. 81450062)；廣東省自然科學基金資助項目(No. 2015A030313872)

△通訊作者 Tel： 020-83827812； E-mail： wuwen1964@163.com

R329.21

A

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