周凡涵， 厲紅元

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院內(nèi)分泌乳腺外科，重慶 400016)

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WNT5B過表達(dá)對人乳腺癌MCF-7細(xì)胞活力及凋亡的影響

周凡涵， 厲紅元△

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院內(nèi)分泌乳腺外科，重慶 400016)

目的： 檢測WNT5B在人正常乳腺上皮細(xì)胞和乳腺癌細(xì)胞株中的表達(dá)，及過表達(dá)WNT5B后對人乳腺癌MCF-7細(xì)胞活力及凋亡的影響，探討WNT5B在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用。方法：采用RT-PCR法檢測正常乳腺上皮細(xì)胞和乳腺癌細(xì)胞中WNT5B的mRNA表達(dá)水平，將WNT5B的表達(dá)載體pcDNA3.1/WNT5B和空白對照載體pcDNA3.1分別瞬時轉(zhuǎn)染人乳腺癌MCF-7細(xì)胞，通過real-time PCR和Western blotting法分別在mRNA和蛋白水平驗(yàn)證WNT5B的表達(dá)效率；并通過CCK-8的方法檢測WNT5B過表達(dá)對人乳腺癌MCF-7細(xì)胞活力的影響，通過流式細(xì)胞術(shù)分別檢測過表達(dá)WNT5B對MCF-7細(xì)胞周期分布及凋亡比例的影響。結(jié)果：與正常乳腺上皮細(xì)胞相比，WNT5B在乳腺癌細(xì)胞中低表達(dá)；在乳腺癌細(xì)胞MCF-7中轉(zhuǎn)染W(wǎng)NT5B表達(dá)質(zhì)粒后，WNT5B表達(dá)上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05)；與對照組相比，過表達(dá)WNT5B后，MCF7細(xì)胞的活力明顯降低，處于S期細(xì)胞的量明顯增加，G1和G2/M期細(xì)胞明顯減少，且細(xì)胞凋亡比例明顯增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05)。結(jié)論：WNT5B在乳腺癌細(xì)胞中低表達(dá)，過表達(dá)WNT5B可使人乳腺癌細(xì)胞MCF-7阻滯在S期，抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

WNT5B； MCF-7細(xì)胞； 細(xì)胞凋亡

乳腺癌是嚴(yán)重威脅婦女身心健康的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率在國內(nèi)有逐年上升趨勢，雖然近年來對乳腺癌發(fā)病機(jī)理的研究已越來越廣泛，并且發(fā)現(xiàn)了多種因子及信號通路參與了乳腺癌的發(fā)生發(fā)展，但其在分子水平的發(fā)病機(jī)制尚需繼續(xù)探討[1-2]。

WNT信號通路功能廣泛、機(jī)制復(fù)雜，WNT5B作為WNT通路眾多配體之一，以旁分泌或自分泌的方式參與非經(jīng)典WNT通路[3]，并參與調(diào)控了多種腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡及侵襲轉(zhuǎn)移等過程[4-5]。有報道證實(shí)WNT5B的表達(dá)與結(jié)腸癌細(xì)胞的分化程度呈正相關(guān)，過表達(dá)WNT5B抑制WNT信號通路關(guān)鍵分子β-catenin的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[6-7]。然而WNT5B在乳腺癌細(xì)胞中的研究較少。本研究探討WNT5B在人正常乳腺上皮細(xì)胞和乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)情況，并通過構(gòu)建WNT5B真核過表達(dá)載體，上調(diào)WNT5B在人乳腺癌細(xì)胞MCF-7中的表達(dá)，研究過表達(dá)WNT5B后對人乳腺癌細(xì)胞MCF-7增殖與凋亡的影響，探討WNT5B在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用，進(jìn)而為乳腺癌的基因靶向治療提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 主要試劑與質(zhì)粒

1.1 主要試劑 Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑購自Invitrogen；總RNA提取試劑盒購自O(shè)mega；RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自TaKaRa；蛋白提取試劑盒購自上海碧云天生物；兔抗人WNT5B的I 抗購自Santa Cruz；β-actin的I抗購自北京鼎國生物技術(shù)有限公司，ECL發(fā)光試劑盒購自Thermo。

1.2 WNT5B真核過表達(dá)載體的構(gòu)建 根據(jù)WNT5B基因在GenBank中的cDNA序列(NM_030775)設(shè)計(jì)特異性引物，上游引物為5’-CCGctcgagATGCCCAGCCTGCTGCTG-3’(含XhoI酶切位點(diǎn))，下游引物為5’-CGCggatccTTTACAGATGTACTGGTCCACGA-3’(含BamH I酶切位點(diǎn))，引物由上海生工合成。提取乳腺癌細(xì)胞MCF-7總RNA，并以逆轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，膠回收，按照pcDNA3.1操作手冊構(gòu)建重組載體，測序和酶切鑒定pcDNA3.1/WNT5B過表達(dá)載體。由實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存。

2 方法

2.1 MCF-7細(xì)胞的培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 MCF-7細(xì)胞由重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院分子腫瘤及表觀遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)室儲存，培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基中，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)分為空載體組(pcDNA3.1)和實(shí)驗(yàn)組(pcDNA3.1/WNT5B)。轉(zhuǎn)染前24 h消化收集細(xì)胞并計(jì)數(shù)，按每孔1×105個接種入6孔培養(yǎng)板中，當(dāng)細(xì)胞融合達(dá)到70%～80%時,按脂質(zhì)體Lipofectamine 2000說明書分別轉(zhuǎn)染pcDNA3.1/WNT5B和空載體pcDNA3.1，培養(yǎng)48 h提取總RNA，72 h提取總蛋白。

2.2 Real-time PCR法檢測WNT5B的mRNA表達(dá)水平 細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后分別提取各組細(xì)胞的總RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。用于Real-time PCR檢測WNT5B的上游引物為5’-AAATGCCACGGCGTC-TCG-3’，下游引物為5’-GGG TGAAGCGGCTGTTGA-3’；β-actin的上游引物為5’-TCCTGTGGCATCCACGAAACT-3’，下游引物為5’-GAAGCATTTGCGGTGGACGAT-3’。Real-time PCR的反應(yīng)條件為95 ℃ 3 min；95 ℃ 5 s、60 ℃ 15 s、72 ℃ 15 s， 39個循環(huán)；65 ℃ 15 s。采用 2-ΔΔCt法計(jì)算并分析mRNA的相對表達(dá)量。

2.3 Western blotting法檢測WNT5B蛋白的表達(dá)水平 細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后分別提取各組細(xì)胞的總蛋白，BCA法測定各組蛋白濃度，加適量上樣緩沖液100 ℃煮沸變性5 min，按每孔上樣量為40 mg進(jìn)行SDS-PAGE后，電轉(zhuǎn)至PVDF轉(zhuǎn)印膜上，用含5%脫脂奶粉PBST液封閉2 h；鼠抗人WNT5B單克隆抗體(1∶1 000)4 ℃孵育過夜；PBST清洗 10 min 3次；加羊抗鼠II抗(1∶1 000)室溫孵育40 min；用ECL化學(xué)發(fā)光法檢測并計(jì)算WNT5B蛋白的相對表達(dá)量。

2.4 CCK-8檢測過表達(dá)WNT5B對MCF細(xì)胞活力的影響 轉(zhuǎn)染24 h的各組細(xì)胞消化收集，按每孔2 000個接種于96孔中，待細(xì)胞貼壁后記為1 d，分別在1 d、2 d、3 d、4 d、5 d加入10 mL CCK-8液，37 ℃孵育2 h后，在450 nm處測定吸光度(A)值。

2.5 細(xì)胞凋亡的檢測 轉(zhuǎn)染48 h后用不含EDTA的胰酶消化各組細(xì)胞，1 000 r/min離心收集，按照Annexin V-PE細(xì)胞凋亡檢測試劑盒操作步驟上流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡。

2.6 細(xì)胞周期分布的檢測 轉(zhuǎn)染72 h后消化收集各組細(xì)胞，預(yù)冷70%無水乙醇-20 ℃過夜固定細(xì)胞，加入500 μL含碘化丙啶的PBS，4 ℃靜置30 min，洗滌后流式細(xì)胞儀上檢測細(xì)胞周期分布。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 19.0進(jìn)行，所有數(shù)據(jù)均以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，兩組間參數(shù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間參數(shù)兩兩比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 WNT5B在乳腺正常上皮和不同乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)

Real-time PCR的結(jié)果顯示，與人正常乳腺上皮細(xì)胞MCF10A相比，WNT5B在人乳腺癌細(xì)胞株T47D、MCF-7和MDA-MB-231中低表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖1。

Figure 1.The mRNA expression of WNT5B in different breast cancer cell lines detected by real-time PCR. Mean±SD.n=3.*P<0.05，**P<0.01vsMCF-10A.

圖1 WNT5B mRNA在不同乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)情況

2 載體轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞效率的檢測

Real-time PCR和Western blot實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，與空載體組相比，實(shí)驗(yàn)組MCF-7細(xì)胞中WNT5B在mRNA和蛋白水平上的表達(dá)明顯增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05),見圖2、3。這說明轉(zhuǎn)染成功，可進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

Figure 2.The mRNA expression of WNT5B in the MCF-7 cells. detected by real-time PCR. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsvector group.

圖2 ReaL-time PCR檢測MCF-7細(xì)胞中WNT5B mRNA的表達(dá)

3 WNT5B過表達(dá)對乳腺癌 MCF-7細(xì)胞活力的影響

通過CCK-8的方法檢測WNT5B過表達(dá)對MCF7細(xì)胞活力的影響，結(jié)果如圖4所示。與對照組相比，過表達(dá)WNT5B的人乳腺癌細(xì)胞MCF7的細(xì)胞活力明顯下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05)。

Figure 3.The protein expression of WNT5B in MCF-7 cells detected by Western blotting. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsvector group.

圖3 MCF-7細(xì)胞中WNT5B在蛋白水平的表達(dá)

Figure 4.The effect of WNT5B up-expression on the viability of MCF-7 cells measured by CCK-8 assay. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsvector group.

圖4 經(jīng)CCK-8檢測，過表達(dá)WNT5B的MCF-7細(xì)胞活力低于對照組細(xì)胞

4 過表達(dá)WNT5B對乳腺癌MCF7細(xì)胞周期分布的影響

流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期的結(jié)果顯示，與空載體組相比，實(shí)驗(yàn)組中S期細(xì)胞數(shù)量明顯增加，G1和G2/M期細(xì)胞數(shù)量減少，說明過表達(dá)WNT5B可將乳腺癌細(xì)胞阻滯在S期，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05),見圖5。

5 過表達(dá)WNT5B對乳腺癌MCF7細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞術(shù)檢測凋亡的結(jié)果顯示，過表達(dá)WNT5B后，與空載體組相比實(shí)驗(yàn)組中細(xì)胞凋亡的比例明顯增加(P<0.05)，見圖6。這說明過表達(dá)WNT5B能促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的凋亡。

Figure 5.The cell cycle was examined by flow cytometry in the MCF-7 cells with WNT5B over-expression by transfection with plasmid pcDNA3.1/WNT5B for 72 h. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsvector group.

圖5 流式細(xì)胞術(shù)檢測過表達(dá)WNT5B對乳腺癌MCF-7細(xì)胞周期分布的影響

Figure 6.The cell apoptosis was analyzed by flow cytometry in the MCF-7 cells with WNT5B over-expression by transfection with plasmid pcDNA3.1/WNT5B for 28 h. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsvector group.

圖6 流式細(xì)胞術(shù)檢測過表達(dá)WNT5B對乳腺癌MCF-7細(xì)胞凋亡比例的影響

討 論

乳腺癌是一種全身性疾病，其發(fā)生發(fā)展的機(jī)制復(fù)雜，近幾年乳腺癌的發(fā)病率在我國逐年攀升[7]，而其治療的方法仍沒有較大的改善，因此探索分子水平上或其相關(guān)領(lǐng)域更有效、更安全的治療方法成為乳腺癌研究領(lǐng)域的當(dāng)務(wù)之急。當(dāng)前針對WNT信號通路與乳腺癌的研究受到重視[8-9]。WNT5B作為WNT通路眾多配體之一，通過WNT信號通路參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展。文獻(xiàn)報道WNT5B在乳腺癌、結(jié)腸癌等多種腫瘤中低表達(dá)[10-12]；Bradley等[5]研究發(fā)現(xiàn)在骨肉瘤細(xì)胞中WNT5B通過抑制JNK信號的中斷影響軟骨細(xì)胞的增殖與遷移；Kato等[13]在人肺癌A549細(xì)胞和人胰腺癌Panc-1細(xì)胞中的研究發(fā)現(xiàn)，WNT5B參與了上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，進(jìn)而影響腫瘤細(xì)胞的侵襲能力，促進(jìn)腫瘤的惡性增殖，提示W(wǎng)NT5B對腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移、分化等過程起著重要作用。

我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，與癌旁組織相比WNT5B在乳腺癌組織中明顯低表達(dá)，且與腫瘤大小顯著相關(guān)[11]。然而WNT5B在乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)及具體的分子作用機(jī)制是未知的；基于此，本研究首先探討了WNT5B在正常乳腺上皮細(xì)胞和不同乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)，結(jié)果顯示W(wǎng)NT5B在乳腺癌細(xì)胞中明顯低表達(dá)，與前期研究結(jié)果一致。為了研究WNT5B在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用，成功構(gòu)建了WNT5B的真核過表達(dá)載體，瞬時轉(zhuǎn)染入人乳腺癌細(xì)胞MCF-7。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)過表達(dá)WNT5B后，MCF7細(xì)胞活力受到明顯抑制，而細(xì)胞周期被阻滯在S期，細(xì)胞凋亡比例也明顯增加，表明在乳腺癌細(xì)胞中，低表達(dá)的WNT5B可能作為腫瘤抑制因子，參與調(diào)節(jié)乳腺癌的發(fā)生與發(fā)展，然而WNT5B是如何靶定相關(guān)信號通路或轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮作用，仍不明確，這也是我們下一步工作的重點(diǎn)。

綜上所述，WNT5B可能作為抑癌因子調(diào)控人乳腺癌細(xì)胞MCF-7的增殖與凋亡，但其具體機(jī)制及所涉及的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑尚不明確，是否與非經(jīng)典的WNT信號通路相關(guān)，有待于進(jìn)一步研究，同時本實(shí)驗(yàn)可為乳腺癌的基因治療提供新的思路。

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(責(zé)任編輯： 陳妙玲， 羅 森)

Effects of WNT5B over-expression on viability and apoptosis of human breast cancer cell line MCF-7

ZHOU Fan-han, LI Hong-yuan

(DepartmentofEndocrineandBreastSurgery,TheFirstAffiliatedHospitalofChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016,China.E-mail:L_hongyan@yeah.net)

AIM: To detect the expression of WNT5B in normal breast epithelial cells and different breast cancer cell lines, and to investigate the effects of WNT5B over-expression on the viability and apoptosis of human breast cell line MCF-7.METHODS: The mRNA expression of WNT5B was detected by RT-PCR in different breast cancer cells. MCF-7 cells were transfected with plasmid pcDNA3.1/WNT5B or pcDNA3.1, and the expression of WNT5B at mRNA and protein levels was examined in the 2 groups by real-time PCR and Western blotting, respectively. Subsequently, the changes of cell viability and cell apoptosis were analyzed by CCK-8 assay and flow cytometry, respectively. RESULTS: The expression of WNT5B in the breast cancer cell lines was lower than that in MCF10A cells. The WNT5B expression in the MCF-7 cells in experimental group was significantly higher than that in vector group (P<0.05). However, the cell viability in experimental group decreased significantly as compared with vector group (P<0.05). The number of the cells in S-phase obviously increased, while the percentage of the cells in G1-phase and G2/M-phase decreased compared with vector group. The number of apoptotic cells in WNT5B group was significantly higher than that in vector group. CONCLUSION: The expression of WNT5B is decreased in breast cancer cells. WNT5B over-expression significantly inhibits the cell growth and promotes the cell apoptosis in breast cancer MCF7 cells.

WNT5B; MCF-7 cells; Apoptosis

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