陳紅蓮， 劉 輝， 楊旭光， 袁 磊

(漯河醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校，河南 漯河 462002)

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Notch3信號(hào)通路介導(dǎo)SAHA誘導(dǎo)的小細(xì)胞肺癌H446細(xì)胞凋亡*

陳紅蓮， 劉 輝， 楊旭光， 袁 磊△

(漯河醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校，河南 漯河 462002)

目的： 觀察辛二酰苯胺異羥肟酸(suberoylanilide hydroxamic acid， SAHA)對(duì)人小細(xì)胞肺癌H446細(xì)胞凋亡的影響，并探討其分子機(jī)制。方法: 選取人小細(xì)胞肺癌H446細(xì)胞作為研究對(duì)象，采用CCK-8法檢測(cè)SAHA的細(xì)胞毒作用并測(cè)定IC50，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡，轉(zhuǎn)染N3ICD真核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建高表達(dá)N3ICD的H446細(xì)胞系，采用RT-PCR法檢測(cè)Notch3的mRNA水平，采用Western blot法檢測(cè)Notch3、N3ICD、Puma和cleaved caspase-3的蛋白水平。結(jié)果: SAHA可顯著降低H446細(xì)胞存活率且呈劑量依賴性(P<0.05)，SAHA作用48 h的IC50為1.91 μmol/L；SAHA可誘導(dǎo)H446細(xì)胞凋亡且具有劑量依賴性(P<0.05)；H446細(xì)胞中Notch3基因表達(dá)呈陰性，SAHA可使H446細(xì)胞Notch3基因恢復(fù)表達(dá)并激活Notch3信號(hào)通路(P<0.05)；沉默Notch3基因可抑制SAHA對(duì)H446細(xì)胞的促凋亡作用(P<0.05)；N3ICD高表達(dá)使H446細(xì)胞中Puma和cleaved caspase-3蛋白水平升高(P<0.01)。結(jié)論: 在體外SAHA可激活人小細(xì)胞肺癌H446細(xì)胞Notch3信號(hào)通路，上調(diào)Puma蛋白表達(dá)水平，誘導(dǎo)H446細(xì)胞凋亡。

辛二酰苯胺異羥肟酸； 小細(xì)胞肺癌； Notch3； 細(xì)胞凋亡； H446細(xì)胞

近年來(lái)，肺癌的發(fā)病率和病死率一直位居全球首位。在我國(guó)，肺癌的發(fā)病率和病死率一直處于上升趨勢(shì)，目前在男性惡性腫瘤中占第一位，在女性中占第二位，已成為我國(guó)第一大癌癥[1]。小細(xì)胞肺癌(small-cell lung cancer，SCLC)約占全部肺癌發(fā)生率的15%，盡管SCLC對(duì)初始化療的敏感性高，但復(fù)發(fā)率高且二線治療有效率低，患者預(yù)后較差[2]。組蛋白去乙酰化酶抑制劑(histone deacetylase inhibitor，HDACi)是近年來(lái)出現(xiàn)的一種新型抗腫瘤藥物，因其抑瘤效果好、毒副作用少，受到國(guó)內(nèi)外的廣泛關(guān)注。研究表明HDACi在體外可通過(guò)阻滯細(xì)胞周期和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)揮抗腫瘤作用[3-4]。辛二酰苯胺異羥肟酸(suberoylanilide hydroxamic acid，SAHA)，又稱伏立諾他，是第2代羥肟酸類的HDACi，目前已經(jīng)進(jìn)入III期臨床實(shí)驗(yàn)[5]。然而目前關(guān)于SAHA對(duì)SCLC的抗腫瘤作用的研究較少[6-7]，SAHA對(duì)SCLC的治療作用還有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)。因此本研究在體外觀察了SAHA對(duì)人小細(xì)胞肺癌H446細(xì)胞凋亡的影響并探究其分子機(jī)制，旨在初步探討SAHA應(yīng)用于治療SCLC的潛在價(jià)值。

材 料 和 方 法

1 材料

人小細(xì)胞肺癌H446細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)；胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)和RPMI-1640培養(yǎng)基購(gòu)自HyClone；SAHA購(gòu)自Sigma；TRIzol試劑、RIPA裂解液、CCK-8試劑盒、Annexin V-FITC凋亡檢測(cè)試劑盒和ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購(gòu)自碧云天；脂質(zhì)體Lipofectamine 2000購(gòu)自Invitrogen；RT-PCR試劑盒和PCR引物購(gòu)自大連寶生物公司；無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自北京康為世紀(jì)公司；Notch3干擾質(zhì)粒(pRS-shNotch3)和空載體(pRS)購(gòu)自O(shè)riGene；人Notch3胞內(nèi)段(Notch3 intracellular domain，N3ICD)真核表達(dá)質(zhì)粒(hN3ICD-pCDF1-MCS2-EF1-copGFP)和空質(zhì)粒(pCDF1-MCS2-EF1-copGFP)購(gòu)自Addgene；抗Notch3、Puma、cleaved caspase-3和β-actin抗體購(gòu)自Cell Signaling Technology。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人小細(xì)胞肺癌H446細(xì)胞在含10% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液中，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%時(shí)，以0.25%的胰蛋白酶消化，按1∶3的比例傳代。

2.2 SAHA工作液的配制 SAHA用DMSO配制成10 mmol/L的儲(chǔ)備液，分裝后于-20 ℃保存。使用時(shí)用含1% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液進(jìn)行稀釋，配制成所需SAHA濃度的工作液。

2.3 CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞活力 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H446細(xì)胞，制成密度為1×108/L的細(xì)胞懸液，以每孔100 μL接種于96孔板，于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。吸去原培養(yǎng)液，各孔分別加入200 μL含有不同濃度SAHA的工作液(0.1 μmol/L、0.2 μmol/L、0.4 μmol/L、0.8 μmol/L、1.6 μmol/L、3.2 μmol/L和6.4 μmol/L)，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)調(diào)零孔和對(duì)照孔(0.1% DMSO)，于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。每孔加入20 μL CCK-8溶液，37 ℃培養(yǎng)1 h，用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔450 nm波長(zhǎng)吸光度A值。細(xì)胞存活率=加藥孔A值/對(duì)照孔A值×100%。采用SPSS 16.0軟件Probit回歸模型計(jì)算SAHA對(duì)細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(half maximal inhibitory concentration，IC50)。

2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H446細(xì)胞，制成密度為1×109/L的細(xì)胞懸液，以每孔2 mL接種于6孔板，于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。吸去原培養(yǎng)液，各孔分別加入2 mL含有不同濃度SAHA的工作液(0.5 μmol/L、1 μmol/L和2 μmol/L)，同時(shí)設(shè)對(duì)照組(0.1% DMSO)，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。收集各孔細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞1次，用預(yù)冷的結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，加入Annexin V-FITC輕輕混勻后于室溫避光孵育15 min。1 000 r/min離心5 min，棄上清，重懸細(xì)胞于預(yù)冷的結(jié)合緩沖液中，加入PI染色液輕輕混勻后于4 ℃避光保存，立即用流式細(xì)胞儀分析檢測(cè)。

2.5 RT-PCR檢測(cè)Notch3的mRNA表達(dá) 參照TRIzol說(shuō)明書抽提上述各組細(xì)胞總RNA，取2 μg總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄條件：42 ℃ 60 min，70 ℃ 15 min，所得反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液于-20 ℃凍存?zhèn)溆谩Ｈ? μL上述反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液進(jìn)行PCR，PCR反應(yīng)條件為94 ℃ 1 min;94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)。引物采用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)，經(jīng)PubMed BLAST驗(yàn)證。Notch3的上游引物為5′-CCC-AGGGTGTCTTCCAGATT-3′，下游引物為5′-ATGTCCTGGTGCAGTCTCTC-3′，PCR產(chǎn)物為409 bp；GAPDH的上游引物為5′-CCTGACCTGCCGTCTAGAAA-3′，下游引物為5′-TACTCCTTGGAGGCCATGTG-3′，PCR產(chǎn)物為276 bp。PCR產(chǎn)物采用瓊脂糖凝膠電泳成像，使用ImageJ軟件進(jìn)行條帶灰度值分析。

2.6 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 將Notch3干擾質(zhì)粒、人N3ICD表達(dá)質(zhì)粒和空質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染H446細(xì)胞；轉(zhuǎn)染方法參照Lipofectamine 2000操作說(shuō)明書進(jìn)行，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，得到4組細(xì)胞：shControl組為轉(zhuǎn)染pRS質(zhì)粒的H448細(xì)胞；shNotch3組為轉(zhuǎn)染pRS-shNotch3質(zhì)粒的H446細(xì)胞；control組為轉(zhuǎn)染pCDF1-MCS2-EF1-copGFP質(zhì)粒的H448細(xì)胞;N3ICD組為轉(zhuǎn)染hN3ICD-pCDF1-MCS2-EF1-copGFP質(zhì)粒的H446細(xì)胞。

2.7 Western blot法檢測(cè)蛋白水平 用RIPA裂解各組細(xì)胞提取總蛋白，用紫外分光光度法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，然后進(jìn)行SDS-PAGE電泳并轉(zhuǎn)移至PVDF膜，用封閉液(5% BSA/TBST)封閉1 h，加入Notch3、Puma、cleaved caspase-3和β-actin的I抗(均1∶1 000稀釋)，4 °C孵育過(guò)夜，TBST洗膜3次，加入II抗(1∶1 000稀釋)室溫下孵育1 h，TBST洗膜3次，加入ECL進(jìn)行發(fā)光反應(yīng)，暗室X膠片顯影，拍照后使用ImageJ軟件進(jìn)行灰度分析，β-actin蛋白條帶為內(nèi)參照。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 16.0分析數(shù)據(jù)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。兩組間比較采用t檢驗(yàn)；多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，并用Bonferroni校正的t檢驗(yàn)進(jìn)行各組均數(shù)間的兩兩比較。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 SAHA抑制H446細(xì)胞活力

CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，自0.2 μmol/L開始，隨著SAHA濃度逐漸升高，H446細(xì)胞存活率逐漸降低(P<0.05)，當(dāng)SAHA濃度達(dá)到6.4 μmol/L時(shí)H446細(xì)胞存活率降至最低(P<0.05)，這表明SAHA對(duì)H446細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用具有劑量依賴性。SAHA作用48 h的IC50為1.91 μmol/L，見圖1。

Figure 1.The effect of SAHA on the viability of H446 cells. Mean±SD.n=5.*P<0.05vs0 μmol/L.

圖1 SAHA對(duì)H446細(xì)胞存活率的影響

2 SAHA促進(jìn)H446細(xì)胞凋亡

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，按照各不同濃度SAHA 組(0 μmol/L、0.5 μmol/L、1 μmol/L和2 μmol/L)，H446細(xì)胞的凋亡率依次升高(P<0.05)；2 μmol/L SAHA組的H446細(xì)胞凋亡率最高(P<0.05)。這表明SAHA促進(jìn)H446細(xì)胞凋亡且具有劑量依賴性，見圖2。

Figure 2.The effect of SAHA on the apoptosis of H446 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 μmol/L.

圖2 SAHA對(duì)H446細(xì)胞凋亡的影響

3 SAHA促進(jìn)H446細(xì)胞中Notch3和N3ICD蛋白表達(dá)

Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)照組H446細(xì)胞中的Notch3和N3ICD蛋白呈陰性表達(dá)；然而經(jīng)不同濃度SAHA作用48 h后，H446細(xì)胞中Notch3和N3ICD的蛋白表達(dá)均呈陽(yáng)性，且隨著SAHA濃度的增加兩者的表達(dá)水平依次升高(P<0.05)，2 μmol/L SAHA組H446細(xì)胞中Notch3和N3ICD的蛋白表達(dá)水平最高(P<0.05)。這表明SAHA可激活H446細(xì)胞Notch3信號(hào)通路，見圖3。

4 SAHA促進(jìn)H446細(xì)胞中Notch3 mRNA表達(dá)

RT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)照組H446細(xì)胞中Notch3和N3ICD的mRNA表達(dá)呈陰性；經(jīng)不同濃度SAHA作用48 h后，H446細(xì)胞中Notch3的mRNA表達(dá)均呈陽(yáng)性，且隨著SAHA濃度的增加而依次升高(P<0.05)，2 μmol/L SAHA組H446細(xì)胞中Notch3的mRNA表達(dá)水平最高(P<0.05)。這表明SAHA可恢復(fù)H446細(xì)胞Notch3基因的表達(dá)，見圖4。

Figure 3.The effect of SAHA on the protein levels of Notch3 and N3ICD in the H446 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 μmol/L.

圖3 SAHA對(duì)H446細(xì)胞中Notch3和N3ICD蛋白水平的影響

Figure 4.The effect of SAHA on the mRNA level of Notch3 in the H446 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 μmol/L.

圖4 SAHA對(duì)H446細(xì)胞中Notch3 mRNA水平的影響

5 沉默Notch3對(duì)細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示， shNotch3組的H446細(xì)胞凋亡率與對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性；shControl+SAHA組的H446細(xì)胞凋亡率與對(duì)照組相比明顯升高(P<0.05)；與shControl+SAHA組相比，shNotch3+SAHA組H446細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.05)，此2組中SAHA的終濃度均為1 μmol/L。這表明沉默Notch3基因可抑制SAHA對(duì)H446細(xì)胞的促凋亡作用，見圖5。

Figure 5.The effect ofNotch3 silencing on the apoptosis of H446 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05 vs shControl group;#P<0.05vsshControl+SAHA group.

圖5 沉默Notch3對(duì)H446細(xì)胞凋亡的影響

6 N3ICD高表達(dá)對(duì)H446細(xì)胞中Puma和cleaved caspase-3蛋白水平的影響

Western blot實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，N3ICD組H446細(xì)胞中促凋亡蛋白Puma的表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)；同時(shí)凋亡執(zhí)行蛋白caspase-3被活化，cleaved caspase-3蛋白水平較對(duì)照組顯著升高(P<0.05)。這表明Notch信號(hào)通路可通過(guò)Puma促進(jìn)H446細(xì)胞凋亡,見圖6。

討 論

臨床上一般按生物學(xué)行為和臨床病程將肺癌分為SCLC和非小細(xì)胞肺癌(non-small-cell lung cancer，NSCLC)。SCLC患者在就診時(shí)常常已經(jīng)處于播散狀態(tài)。SCLC對(duì)化療敏感性高，一線化療后局限期SCLC化療有效率可達(dá)70%以上，廣泛期SCLC也達(dá)60%以上。盡管SCLC的一線治療效果明顯，但大多數(shù)SCLC患者仍會(huì)復(fù)發(fā)，預(yù)后差，局限期SCLC患者的中位生存期只有14～20個(gè)月，廣泛期SCLC患者更是低至9～11個(gè)月。對(duì)于早期復(fù)發(fā)的SCLC患者，由于化療耐藥目前尚缺乏有效的二線治療藥物，二線治療的有效率不足10%[2]。因此在一線和二線治療之間使用安全高效的化療藥物或靶向藥物進(jìn)行維持治療，以延長(zhǎng)SCLC患者的生存期，是值得探索的臨床治療模式。

Figure 6.The effect of N3ICD on the protein levels of Puma and cleaved caspase-3 in the H446 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖6 N3ICD過(guò)表達(dá)對(duì)H446細(xì)胞Puma和cleaved caspase-3蛋白水平的影響

在本研究中，CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力和流式細(xì)胞術(shù)的分析結(jié)果表明，SAHA對(duì)人小細(xì)胞肺癌H446細(xì)胞具有顯著的抑制作用且呈劑量依賴性。SAHA可誘導(dǎo)H446細(xì)胞中Notch3和N3ICD蛋白的表達(dá)以及Nocth3的mRNA表達(dá)，這表明SAHA可激活H446細(xì)胞中Notch3信號(hào)通路。為探究Notch3信號(hào)通路是否參與了SAHA所誘導(dǎo)的H446細(xì)胞凋亡，我們首先采用shRNA技術(shù)沉默Notch3基因，結(jié)果顯示抑制Notch3表達(dá)可抑制SAHA誘導(dǎo)的H446細(xì)胞凋亡，隨后我們又將人N3ICD真核高表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至H446細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)N3ICD高表達(dá)可使H446細(xì)胞中的Puma和cleaved caspase-3蛋白水平顯著升高，這表明SAHA可通過(guò)激活Notch3信號(hào)通路上調(diào)Puma促進(jìn)H446凋亡。本研究結(jié)果為SAHA應(yīng)用于臨床治療SCLC患者提供了一定的理論依據(jù)，但由于本研究?jī)H采用了一種人SCLC細(xì)胞系，具有一定的局限性，也未探究SAHA與其它化療藥物聯(lián)用的有效性和安全性。因此SAHA對(duì)其它SCLC細(xì)胞的抑瘤作用以及SAHA與其它化療藥物的聯(lián)合使用將是本研究團(tuán)隊(duì)下一步擬探究的問(wèn)題。

SAHA在體外已證實(shí)對(duì)多種惡性腫瘤具有較好的抗腫瘤效果，包括肺癌[6-7]、乳腺癌[8]、神經(jīng)母細(xì)胞瘤[9]、膽管癌[10]和口腔癌[11]。Bruzzese等[6]的研究發(fā)現(xiàn)，SAHA可誘導(dǎo)人小細(xì)胞肺癌H209和H526細(xì)胞凋亡，這可能與其提高細(xì)胞中ROS水平有關(guān)；同時(shí)還發(fā)現(xiàn)SAHA可使小細(xì)胞肺癌H209和H526細(xì)胞阻滯于G1期。最新的一項(xiàng)研究表明，SAHA可通過(guò)促進(jìn)Noxa和/或Bim基因表達(dá)誘導(dǎo)多種SCLC細(xì)胞凋亡[7]。以上研究結(jié)果表明， SAHA對(duì)SCLC的抑制作用可能與其誘導(dǎo)的細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞凋亡有關(guān)，但具體的分子機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

Notch3信號(hào)通路在肺癌中似乎扮演著雙重角色。一些研究表明，Notch3信號(hào)通路可促進(jìn)NSCLC細(xì)胞增殖、侵襲和腫瘤干細(xì)胞富積[12-14]。但也有研究發(fā)現(xiàn)，Notch3可抑制NSCLC細(xì)胞增殖和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[15]。Hassan等[16]研究發(fā)現(xiàn)，在受檢的6個(gè)NSCLC細(xì)胞系中Notch3蛋白表達(dá)均呈陽(yáng)性，28例NSCLC病理組織中Notch3蛋白陽(yáng)性率接近80%；與之相反，在受檢的5個(gè)SCLC細(xì)胞系中除H69AR和SBC-3以外其余3個(gè)SCLC細(xì)胞系的Notch3蛋白表達(dá)呈陰性，12例SCLC病理組織中Notch3蛋白表達(dá)均為陰性；在NSCLC細(xì)胞系A(chǔ)549和H2170細(xì)胞以及SCLC細(xì)胞系H69AR中沉默Notch3基因可抑制細(xì)胞增殖和侵襲并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；與之相反，高表達(dá)N3ICD可抑制SCLC細(xì)胞系H1688細(xì)胞增殖和侵襲并誘導(dǎo)其凋亡。這些研究結(jié)果表明，Notch3信號(hào)通路究竟是發(fā)揮促癌作用還是抗癌作用取決于細(xì)胞類型，Notch3信號(hào)通路對(duì)SCLC的抑制作用尚需更多實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

綜上所述，本研究表明，SAHA在體外可激活人小細(xì)胞肺癌H446細(xì)胞Notch3信號(hào)通路，進(jìn)而上調(diào)Puma蛋白表達(dá)，最終導(dǎo)致H446細(xì)胞凋亡。這加深了對(duì)SAHA抑瘤作用的認(rèn)識(shí)，然而SAHA在體內(nèi)是否也通過(guò)該機(jī)制發(fā)揮作用尚待進(jìn)一步闡明。

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(責(zé)任編輯： 陳妙玲， 羅 森)

Notch3 pathway mediates SAHA-induced apoptosis in human small-cell lung cancer H446 cells

CHEN Hong-lian, LIU Hui, YANG Xu-guang, YUAN Lei

(LuoheMedicalCollege,Luohe462002,China.E-mail:fzyx_yl@163.com)

AIM: To investigate the effect of suberoylanilide hydroxamic acid (SAHA) on the apoptosis of human small-cell lung cancer H446 cells and its possible mechanism. METHODS: H446 cells were incubated in the medium containing SAHA. CCK-8 assay was used to detect the anti-tumor effect of SAHA on the H446 cells, and IC50values of SAHA were calculated. Flow cytometry was used to analyze the apoptosis. AfterNotch3 gene was silenced, the pro-apopto-tic effect of SAHA on the H446 cells was inhibited (P<0.05). Eukaryotic expression plasmid containingN3ICDwas transfected into the H446 cells, so that N3ICD was expressed in the H446 cells. The mRNA expression of Notch3 was measured by RT-PCR. The protein levels of Notch3, N3ICD, Puma and cleaved caspase-3 were determined by Western blot. RESULTS: SAHA remarkably reduced the cell viability in a dose-dependent manner (P<0.05), and the IC50value of SAHA was 1.91 μmol/L. SAHA induced apoptosis in a dose-dependent manner (P<0.05). The expression ofNotch3 gene was negative in the H446 cells, SAHA reactivatedNotch3 gene and Notch3 pathway in a dose-dependent manner (P<0.05).Notch3 knockdown inhibited apoptosis induced by SAHA (P<0.05). Over-expression of N3ICD up-regulated the protein levels of Puma and cleaved caspase-3.CONCLUSION: SAHA induces apoptosis in human small-cell lung cancer H446 cells by activating Notch3 pathway and up-regulating the protein level of Puma.

Suberoylanilide hydroxamic acid; Small-cell lung cancer; Notch3; Apoptosis; H446 cells

雜志網(wǎng)址： http://www.cjpp.net

1000- 4718(2016)09- 1556- 06

2016- 04- 19

2016- 06- 20

河南省科技廳科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(No.142102310203)；漯河醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校自然科學(xué)研究計(jì)劃項(xiàng)目(No.2013-S-LMC04)

△通訊作者 Tel： 0395-2969424； E-mail： fzyx_yl@163.com

R734.2; R730.23

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.09.004