楊亞萍， 張可凡， 梁志紅， 楊海峰， 朱林燕

(暨南大學 1分析測試中心， 2醫(yī)學院藥理學教研室，廣東 廣州 510632； 3廣東省中醫(yī)院病理科，廣東 廣州 510120)

YANG Ya-ping1, ZHANG Ke-fan2, LIANG Zhi-hong1, YANG Hai-feng3, ZHU Lin-yan2

(1Analysis and Test Center, 2Department of Pharmacology, School of Medicine, Jinan University, Guangzhou 510632, China; 3Department of Pathology, Guangdong Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine, Guangzhou 510120, China. E-mail: yang_hf@126.com; linyanzhu_jnu@163.com)

?

·論 著·

雙硫侖螯合銅對MCF-7和MCF-10A細胞超微結構和力學特性的影響*

楊亞萍1▲， 張可凡2▲， 梁志紅1， 楊海峰3△， 朱林燕2△

(暨南大學1分析測試中心，2醫(yī)學院藥理學教研室，廣東 廣州 510632；3廣東省中醫(yī)院病理科，廣東 廣州 510120)

目的： 基于原子力顯微鏡(atomic force microscope，AFM)在納米級分辨率和皮牛級力學測量探討雙硫侖(disulfiram，DSF)螯合氯化銅復合物(DSF/Cu)對人乳腺癌MCF-7和正常乳腺上皮MCF-10A細胞膜超微結構及力學特性的影響。方法: 采用流式細胞術比較DSF/Cu作用于2種細胞后凋亡率和細胞周期的改變。AFM探測細胞表面形貌、超微結構、細胞高度、寬度及粗糙度的變化。利用AFM納米壓痕技術檢測DSF/Cu對2種細胞硬度(楊氏模量)的影響。結果: 流式細胞術結果顯示：DSF/Cu可顯著誘導MCF-7細胞凋亡，且呈濃度依賴性；而對MCF-10A細胞影響不大。細胞周期檢測顯示DSF/Cu對2種細胞的細胞周期影響不同。AFM 成像觀察發(fā)現，400 和 800 nmol/L的DSF/Cu 作用于MCF-7 細胞6 h后，細胞形態(tài)明顯皺縮，體積變小，表面變得平整，絲狀偽足明顯回縮、變短，有些變成了板狀偽足，甚至完全消失。進一步定量分析發(fā)現細胞寬度變小，高度增高，均方根粗糙度和平均粗糙度均減小，且呈濃度依賴性。而對MCF-10A 細胞則影響甚微。 最后，單細胞水平生物力學檢測顯示：DSF/Cu作用于MCF-7和MCF-10A細胞6 h后，2種細胞的楊氏模量隨藥物濃度的增加均有所增加，且呈濃度依賴性，但 MCF-7細胞增加的比例要遠遠高于MCF-10A細胞。結論: DSF/Cu可能通過特異性影響MCF-7細胞的生物力學特性發(fā)揮高效低毒的抗乳腺腫瘤作用。

雙硫侖； 原子力顯微鏡； 細胞凋亡； 楊氏模量

YANG Ya-ping1, ZHANG Ke-fan2, LIANG Zhi-hong1, YANG Hai-feng3, ZHU Lin-yan2

(1AnalysisandTestCenter,2DepartmentofPharmacology,SchoolofMedicine,JinanUniversity,Guangzhou510632,China;3DepartmentofPathology,GuangdongProvincialHospitalofTraditionalChineseMedicine,Guangzhou510120,China.E-mail:yang_hf@126.com;linyanzhu_jnu@163.com)

近年來，乳腺癌作為女性最常見的惡性腫瘤，全世界患者數量增長迅速，且患病年齡呈現出明顯降低趨勢。臨床上，由于多藥耐藥性和毒副作用導致乳腺癌患者的治療效果差，并易引起復發(fā)和轉移[1]。雙硫侖(disulfiram，DSF)又名戒酒硫，是一種能夠抑制醇乙醛脫氫酶的二硫代氨基甲酸鹽藥物，可致酒精代謝產物乙醛在體內蓄積，使嗜酒者產生對酒精的厭惡而用于戒酒治療[2]。近20年來，有大量研究證實，DSF與多種二價金屬陽離子如銅(copper, Cu)、鋅、鎘等螯合后，可以顯著增強其抗腫瘤活性，如抑制腫瘤血管的形成[3]，抑制眼部黑色素瘤向肝的轉移[4]，抑制泛素-蛋白酶系統(tǒng)的活性等[5]，且同時能夠保護正常細胞[6]。此外，DSF/Cu還能明顯增強癌細胞對傳統(tǒng)化療藥物和放療的敏感性[7]。

在細胞由正常向惡性演變的過程中，通常伴隨有復雜的生物力學及細胞骨架重塑的過程，對腫瘤的侵襲和轉移至關重要。癌細胞的硬度明顯低于相對應的正常細胞，且侵襲能力越強的癌細胞越軟，變形能力越強[8]。因此，可以根據細胞硬度(楊氏模量)的不同來辨識癌細胞和正常細胞，而且細胞的硬度及黏彈力可反映腫瘤的惡性程度。有報道，藥物可以通過影響細胞生物力學特性和細胞骨架發(fā)揮抗腫瘤效應[9]。本文擬以人乳腺癌MCF-7細胞和正常乳腺上皮MCF-10A細胞為研究對象，探討DSF/Cu對乳腺癌和正常乳腺上皮細胞的不同細胞毒作用及生物力學特性的不同影響，為DSF/Cu臨床抗乳腺癌治療提供實驗依據。

材 料 和 方 法

1 材料與試劑

雙硫侖和氯化銅購自Sigma；RPMI-1640 培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶、青霉素和鏈霉素均購自Gibco；Annexin V-FITC/PI Apoptosis Detection Kit購自eBioscience；PI/RNase Staining Buffer購自BD Pharmingen；150Al-G 硅探針(Bulgaria)；AFM液體池探針(Bruker)；其它試劑均為國產分析純。細胞培養(yǎng)板、移液管、離心管、平皿和培養(yǎng)瓶均為Corning 產品。BD Falcon細胞過濾網為BD Pharmingen產品；流式細胞儀(Coulter Gallios)為Beckman Coulter產品；原子力顯微鏡(BioScope Catalyst NanoScope-V)為Veeco產品；倒置顯微鏡(IX51)為Olympus產品。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng) 人乳腺癌MCF-7和正常乳腺上皮MCF-10A細胞用含10% 胎牛血清、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的RPMI-1640 培養(yǎng)基，置于5% CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中進行常規(guī)培養(yǎng)。每隔2 d用0.25% 胰酶和0.1% EDTA消化傳代。

2.2 檢測DSF/Cu對MCF-7和MCF-10A 細胞周期的影響 MCF-7和MCF-10A 細胞接種于6 孔板中，培養(yǎng)24 h 后分別換含0、400和800 nmol/L DSF/Cu的培養(yǎng)基2 mL繼續(xù)培養(yǎng)6 h。 收集細胞與培養(yǎng)基于EP 管內，1 000 r/min 離心5 min，去除上清液，加入500 μL PBS 洗滌2 次，加入1 mL 70% 冷乙醇，于4 ℃下固定過夜，1 000 r/min離心5 min，沉淀細胞，吸去上清液，加入500 μL PBS 洗滌2 次、染色，每管樣品中分別加入200 μL PI/RNase 染色液充分混合并重懸細胞，37 ℃室溫避光孵育10 min，用BD Falcon細胞過濾網過濾細胞，上流式細胞儀檢測，用激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長630 nm檢測PI熒光信號。獲取至少10 000個細胞，用MidFit軟件分析細胞周期的分布。

2.3 Annexin V-FITC/PI 雙染法檢測細胞凋亡率 分組同上，收集各組細胞，于4 ℃ 離心5 min，1 200 r/min，冷PBS 漂洗細胞2 次。棄上清，將細胞重懸于200 μL binding buffer，各加入5 μL Annexin V-FITC和PI，混勻后室溫避光孵育15 min，再加入200 μL binding buffer重懸細胞，上流式細胞儀檢測。用激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長525 nm 和630 nm分別檢測FITC和PI熒光信號。獲取至少10 000個細胞，用Kaluza軟件分析細胞凋亡率。

2.4 AFM成像觀察 將多聚賴氨酸浸泡消毒過的蓋玻片置于6孔板中，按1×108/L接種細胞，加入不同濃度的DSF/Cu孵育6 h 后，用1% 戊二醛固定細胞10 min，用超純水洗滌細胞3 次，自然晾干。將制備好的樣品置于原子力顯微鏡的XY 掃描臺上，定位待掃描樣品區(qū)域，采用ScanAsyst mode成像，150Al-G 硅探針，微懸臂的彈性系數為2.8 N/m，掃描速度為 0.8 Hz。用AFM 圖像自帶軟件NanoScope Analysis 8.14對掃描方向上出現的低頻背景噪音做平滑處理。

2.5 AFM單細胞水平檢測生物力學特性 AFM單細胞力學測量在RPMI-1640培養(yǎng)基進行，采用接觸模式，前進速度為1.63 m/s，掃描速度為0.8 Hz。選用AFM探針，半徑為20 nm，彈簧常數為0.7 N/m，用熱噪聲方法校準彈性系數。使用相同的探針在每組3～5細胞測量超過1 000條力-距離曲線，用楊氏模量表示細胞的彈性，通過NanoScope Analysis 8.14計算和分析所有參數。

3 統(tǒng)計學處理

實驗數據以均數±標準差(mean±SD)表示，采用SPSS 17.0 進行統(tǒng)計學分析，多組間比較應用單因素方差分析，組間均數比較應用SNK-q檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 DSF/Cu對MCF-7和MCF-10A細胞凋亡的影響

流式細胞儀Annexin V/FITC雙染法檢測DSF/Cu誘導MCF-7和MCF-10A細胞凋亡率的變化。與對照組相比，400和800 nmol/L DSF/Cu作用乳腺癌MCF-7細胞6 h后，MCF-7細胞凋亡率分別增加至(24.06±15.2)%和(54.08±18.32)%，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；而正常乳腺上皮MCF-10A細胞的凋亡率，由對照組的(0.30±0.24)%，略微增加至(2.97±2.06)%和(6.95±1.87)%，見圖1。這表明DSF/Cu可顯著誘導MCF-7細胞凋亡，而對MCF-10A細胞影響不大。

Figure 1.Apoptosis of MCF-7 and MCF-10A cells stained with Annexin V-FITC/PI after treated with 400 and 800 nmol/L of DSF/Cu for 6 h determined by flow cytometry. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group.

圖1 不同濃度DSF/Cu 對MCF-7和MCF-10A細胞凋亡的影響

2 DSF/Cu對MCF-7 細胞和MCF-10A細胞周期的影響

為了進一步說明DSF/Cu對MCF-7 和MCF-10A細胞的毒性殺傷作用，流式細胞儀檢測DSF/Cu對MCF-7 和MCF-10A細胞周期影響。DSF/Cu作用于MCF-7細胞6 h后，與對照組G2/M期細胞比例(10.21±0.89)% 相比，400、800 nmol/L DSF/Cu 處理的MCF-7 G2/M 期細胞比例分別增加到(19.50±2.64)%和(22.16±0.51)%，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；同時伴有G0/G1期細胞比例由對照組的(40.07±0.29)%減少到(28.17±1.69)%和(28.72±1.48)%，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。DSF/Cu對正常乳腺上皮MCF-10A細胞的周期也有影響，但與MCF-7有不同。主要表現在G0/G1期的比例升高，而S期比例降低，見圖2。

Figure 2.Cell cycle of MCF-7 and MCF-10A cells after treated with 400 and 800 nmol/L of DSF/Cu for 6 h determined by flow cytometry. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group.

圖2 不同濃度DSF/Cu 對MCF-7和MCF-10A細胞周期的影響

3 DSF/Cu對MCF-7和MCF-10A細胞表面超微結構的影響

AFM成像顯示：對照組MCF-7細胞呈紡錘形，整個胞體表面分布有大小不等的凹陷或突起，非常粗糙，且胞體四周布滿細絲狀偽足。從放大的圖片可以清晰地觀察到絲狀偽足似“樹枝狀”分布。 經400 和800 nmol/L DSF/Cu作用6 h后，細胞形態(tài)皺縮，細胞變小，表面逐漸變得平整，絲狀偽足明顯回縮、變短，尤其在800 nmol/L組，絲狀偽足有些變成了板狀偽足，甚至完全消失。而對正常MCF-10A細胞影響甚微，見圖3。

定量分析顯示：與對照組MCF-7細胞寬度(46.9±2.88)μm相比，作用400和800 nmol/L DSF/Cu組分別減小為(34.93±7.16)μm和(21.30±0.94)μm，呈濃度依賴性，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。而細胞高度與對照組(1.56±0.23)μm相比，400和800 nmol/L DSF/Cu組分別增加為(2.43±0.92)μm和(3.98±0.71)μm，呈濃度依賴性，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。均方根粗糙度(root-mean-square roughness，Rq)和平均粗糙度(average roughness，Ra)，與對照組相比，加藥組均減小，呈濃度依賴性，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01)。而對MCF-10A細胞基本沒有影響，見圖3、4。

4 DSF/Cu對MCF-7和MCF-10A細胞生物力學的影響

通過單細胞力學檢測顯示：當不同濃度 DSF/Cu 作用 MCF-7 和MCF-10A細胞6 h 后，2種細胞的楊氏模量隨藥物濃度的增加，均有所增加，呈濃度依賴性，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。但是，作用400和800 nmol/L DSF/Cu 6 h 后，MCF-7 細胞的楊氏模量分別增加了將近 1.3 倍和 2.5 倍，而MCF-10A細胞僅僅增加 0.1 倍和0.3 倍，MCF-7 細胞增加的比例要遠遠高于MCF-10A 細胞，見圖5。

Figure 3.The morphological changes of MCF-7 and MCF-10A cells after treated with 400 and 800 nmol/L of DSF/Cu for 6h determined by atomic force microscopy. A1～A6: magnified images of filopodia in the edge of cell corresponding to the region indicated by blue frame in B1～B6, respectively; B1～B6: peak force error images; C2～C6: height images; D1～D6: three-dimensional morphology images.

圖3 不同濃度DSF/Cu 對MCF-7和MCF-10A細胞膜表面形貌的影響

Figure 4.Histograms of statistical results of morphological changes of MCF-7 and MCF-10A cells after treated with 400 and 800 nmol/L of DSF/Cu for 6 h determined by atomic force microscopy. Rq: root-mean-square roughness; Ra: average roughness. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vs0 nmol/L group.

圖4 不同濃度DSF/Cu對MCF-7和MCF-10A細胞高度、寬度和粗糙度的影響

討 論

乳腺癌屬上皮源性惡性腫瘤，惡性程度高，有著高度的侵襲性及轉移性，患者5 年生存率僅60%左右。臨床上以乳腺癌根治術和輔助化療為主，但手術治療對機體造成的大面積損傷、化療藥物的毒副作用以及巨額的醫(yī)療費等問題，嚴重影響乳腺癌患者的療效，導致癌癥的復發(fā)。因此，尋找并研發(fā)高效低毒的分子靶向治療藥物不失為一種可行的臨床抗乳腺癌治療手段。

DSF分子式為C10H20N2S4，屬二硫代氨基甲酸鹽家族，擁有該家族的一般特性，即R1R2NC(S)SR3功能基團分子，以自身的巰基自發(fā)地結合金屬元素Cu，螯合形成一種新的復合物DSF/Cu，該化合物具有顯著的抗腫瘤效應[10-11]。有報道DSF/Cu顯著誘導了乳腺癌細胞MCF10DCIS.com的細胞形態(tài)改變和核凋亡染色，同時抑制糜蛋白酶的活性，而對正常乳腺上皮細胞MCF-10A影響不大[6]。本研究進一步發(fā)現DSF/Cu在劑量為400和800 nmol/L、作用6 h即可顯著誘導乳腺癌MCF-7細胞凋亡；而對正常乳腺上皮MCF-10A細胞幾乎無凋亡作用。檢測DSF/Cu對細胞周期的影響，發(fā)現DSF/Cu阻滯MCF-7細胞于G2/M期，伴有G0/G1期細胞的減少。而對MCF-10A細胞主要阻滯于G0/G1期。我們和前人的研究結果表明：DSF/Cu對乳腺癌細胞具有很強的細胞毒性作用，而對正常細胞卻影響很少，具有特異高效低毒的抗乳腺癌作用。

目前關于DSF/Cu抗腫瘤的作用機制尚不完全明確?，F有的研究提示其主要作為蛋白酶體抑制劑抑制NF-κB通路以及激活ROS，影響氧化還原穩(wěn)態(tài)通過線粒體途徑誘導細胞凋亡等功能有關。Xu等[12]報告DSF/Cu能夠通過抑制NF-κB、激活ROS誘導急性淋巴細胞白血病Molt4細胞和淋巴瘤Raji細胞凋亡并抑制其增殖。 Chen等[6]報告DSF/Cu通過抑制乳腺癌細胞的20S和26S蛋白酶體的糜蛋白酶樣活性，增加p27蛋白、上調促凋亡基因 Bax及激活caspase家族成員，最終促使細胞凋亡。在細胞凋亡過程中通常伴有細胞形貌、超微結構的改變[13]。本實驗從納米級水平上定性定量地分析了DSF/Cu分別誘導MCF-7和MCF-10A細胞的超微結構變化。

Figure 5.Young’s modulus of the MCF-7 and MCF-10A cells after treated with 400 and 800 nmol/L of DSF/Cu for 6 h determined by AFM. Mean±SD.n=1 000～1 200.**P<0.01vs0 nmol/L group.

圖5 不同濃度 DSF/Cu 對MCF-7 和MCF-10A 細胞楊氏模量的影響

結果顯示：DSF/Cu作用MCF-7細胞6 h后細胞形態(tài)皺縮、細胞變小、變圓，高度增加，Rq和Ra均下降，細胞絲狀偽足明顯回縮，變短，進而完全消失。而對正常MCF-10A細胞影響甚微。DSF/Cu對正常細胞和腫瘤細胞的超微結構的影響差異進一步說明DSF/Cu能夠選擇性殺傷癌細胞而不影響正常細胞。AFM 不僅是一種具有納米級空間分辨率的表面成像工具，可獲得二維、三維圖像，對細胞表面形貌進行可視化表征；還可在皮牛級水平測量細胞的機械力學性質，比如楊氏模量和黏附力等，在研究細胞的生物力學功能、細胞與藥物的相互作用，尤其抗腫瘤藥物的抗癌機制等方面發(fā)揮了重要的作用[14-15]，也成為當前研究的熱點之一。我們進一步利用AFM的壓痕技術并采集分析細胞與針尖之間隨位移的變化作用力的改變，從而得到力-距離曲線，原位檢測單個細胞的機械特性。結果顯示：在未加藥的情況下，人正常乳腺上皮MCF-10A細胞的楊氏模量要遠遠高于乳腺癌MCF-7細胞，將近增加了7倍，說明腫瘤細胞更軟，變形能力很強，有助于癌細胞的轉移，增加侵襲能力和惡性程度。當不同濃度DSF/Cu作用MCF-7和MCF-10A細胞6 h后，2種細胞的楊氏模量隨藥物濃度的增加，均有所增加，呈劑量依賴關系。然而，400和800 nmol/L DSF/Cu作用后的MCF-7細胞的楊氏模量分別增加了1.3倍和2.5倍，相比而言，MCF-10A細胞僅僅增加了0.1倍和0.3倍。由此可見，DSF/Cu對腫瘤細胞發(fā)揮更顯著地細胞毒性作用，通過增加其硬度，降低變形能力來發(fā)揮抗腫瘤作用；而對正常細胞的影響小很多，這與我們前面得到的DSF/Cu對乳腺癌細胞具有高效低毒的細胞毒作用結果一致。

綜上所述，本研究證實DSF/Cu可顯著誘導人乳腺癌MCF-7細胞凋亡，而對正常乳腺上皮MCF-10A細胞影響較小。這可能與乳腺癌細胞和正常乳腺上皮細胞的生物力學差異有關。本研究為進一步探討DSF/Cu影響細胞生物力學差異的分子機制如細胞骨架蛋白的排列等奠定前期實驗基礎；并且AFM以其納米級超高分辨率和皮牛級力學測定可檢測出藥物處理后細胞反應的差異，這一優(yōu)點可用于抗癌藥物的篩選。

[1] Zghair AN， Sharma R， Sharma AK. Hormone responsive breast cancer and BRCA1 mutation: mechanism， regulation and iron-mediated effects[J].Curr Pharm Biotechnol， 2014， 15(12):1113-1124.

[2] Suh JJ， Pettinati HM， Kampman KM， et al. The status of disulfiram: a half of a century later[J]. J Clin Psychopharmacol， 2006， 26(3):290-302.

[3] Han J， Liu L， Yue X， et al. A binuclear complex constituted by diethyldithiocarbamate and copper(I) functions as a proteasome activity inhibitor in pancreatic cancer cultures and xenografts[J].Toxicol Appl Pharmacol， 2013， 273(3):477-483.

[4] Brar SS， Grigg C， Wilson KS， et al. Disulfiram inhibits activating transcription factor/cyclic AMP-responsive element binding protein and human melanoma growth in a metal-dependent mannerinvitro， in mice and in a patient with metastatic disease[J].Mol Cancer Ther，2004，3(9):1046-1060.

[5] Li LH， Yang HJ， Chen D， et al. Disulfiram promotes the conversion of carcinogenic cadmium to a proteasome inhibitor with pro-apoptotic activity in human cancer cells[J].Toxicol Appl Pharmacol，2008，229(2):206-214.

[6] Chen D， Cui QC， Yang H，et al. Disulfiram， a clinically used anti-alcoholism drug and copper-binding agent， induces apoptotic cell death in breast cancer cultures and xenografts via inhibition of the proteasome activity[J].Cancer Res， 2006， 66(21):10425-10433.

[7] Wang YY， Li WD， Patel SS， et al. Blocking the formation of radiation-induced breast cancer stem cells[J].Oncotarget， 2014， 5(11):3743-3755.

[8] Zhao XQ， Zhong YX， Ye T， et al. Discrimination between cervical cancer cells and normal cervical cells based on longitudinal elasticity using atomic force microscopy[J].Nanoscale Res Lett， 2015， 10:482.

[9] Luo Q， Kuang DD， Zhang BY， et al. Cell stiffness determined by atomic force microscopy and its correlation with cell motility[J].Biochim Biophys Acta， 2016， 1860(9): 1953-1960.

[10]Yip NC， Fombon IS， Liu P， et al. Disulfiram modulated ROS-MAPK and NFκB pathways and targeted breast cancer cells with cancer stem cell-like properties[J].J Cancer， 2011， 104(10):1564-1574.

[11]Allensworth JL， Evans MK， Bertucci F， et al. Disulfiram (DSF) acts as a copper ionophore to induce copper-dependent oxidative stress and mediate anti-tumor efficacy in inflammatory breast cancer[J].Mol Oncol， 2015， 9(6):1155-1168.

[12]Xu B， Shi PC， Fombon IS， et al. Disulfiram/copper complex activated JNK/c-jun pathway and sensitised cytotoxicity of doxorubicin in doxorubicin resistant leukemia HL60 cells[J]. Blood Cells Mol Dis， 2011， 47(4):264-269.

[13]李夢佳， 馬蓮順， 楊亞萍， 等. 大黃素阻抑人乳腺癌MCF-7細胞增殖和細胞周期進程[J].中國病理生理雜志， 2013， 29(8):1417-1421.

[14]Zhang L， Yang F， Cai JY， et al. In-situ detection of resveratrol inhibition effect on epidermal growth factor receptor of living MCF-7 cells by Atomic Force Microscopy[J]. Biosens Bioelectron， 2014， 15:271-277.

[15]Pi J， Li BL， Tu LY， et al. Investigation of quercetin-induced HepG2 cell apoptosis-associated cellular biophysical alterations by atomic force microscopy[J].Scanning， 2016， 38(2):100-112.

(責任編輯： 林白霜， 羅 森)

Effects of DSF/Cu on surface ultrastructures and mechanical properties of human breast cancer and normal breast epithelial cells

AIM: To study the effects of disulfiram/copper complex (DSF/Cu) on ultrastructures and mechanical properties of human breast cancer and normal breast epithelial cells by atomic force microscopy (AFM) based on the nanoscale resolution and piconewton force measurement level. METHODS: The change of cell cycle and apoptotic rate of MCF-7 cells and MCF-10A cells induced by DSF/Cu were compared by flow cytometry. The cell surface morphology, ultrastructure, height, width and roughness were detected by AFM. The effects of DSF/Cu on the hardness (Young’s modulus) of the 2 kinds of cells were determined by AFM with indentation technique. RESULTS: DSF/Cu significantly induced apoptosis of the MCF-7 cells in a dose-dependent manner， whereas had little effect on the MCF-10A cells. The cell cycle analysis showed that DSF/Cu induced G2/M arrest in the MCF-7 cells, but led to G0/G1arrest in the MCF-10A cells. The AFM images showed that the MCF-7 cells shrank and showed smaller and smoother morphology, and the filopodia were retracted obviously, even some became into lamellipodia, or disappeared completely after treated with DSF/Cu at concentrations of 400 and 800 nmol/L. The quantitative analysis indicated that the MCF-7 cells showed smaller width and larger height, and the root mean square roughness and average roughness were decreased significantly in a dose-dependent manner after treated with DSF/Cu at concentrations of 400 and 800 nmol/L. However, little effect in the MCF-10A cells was observed. The biomechanics test at a single cell level demonstrated that the Young’s modulus of the MCF-7 cells and MCF-10A cells were both increased, yet the proportion increased in the MCF-7 cells was much higher than that in the MCF-10A cells after treated with DSF/Cu at concentrations of 400 and 800 nmol/L. CONCLUSION: DSF/Cu has strong antitumor effect on breast cancer with high efficiency and low toxicity by changing the properties of the biomechanics specifically.

Disulfiram; Atomic force microscopy; Apoptosis; Young’s modulus

雜志網址： http://www.cjpp.net

1000- 4718(2016)09- 1537- 08

2016- 05- 04

2016- 07- 13

國家自然科學基金資助項目(No.31070997；No.81372382)；廣東省自然科學基金資助項目(No.S2013010013780；No.2015A030313363)；廣東省醫(yī)學科研基金資助項目(No.A2015506)

△通訊作者 楊海峰 Tel： 020-81887233； E-mail： yang_hf@126.com； 朱林燕 Tel： 020-85226219； E-mail： linyanzhu_jnu@163.com

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R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.09.001