程　林　王子喬　徐六妹　唐　嫻　周　泱　王　輝

(深圳市第三人民醫(yī)院，深圳518112)

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酵母表面展示多肽片段分析Δ42PD1的免疫原性①

程林王子喬徐六妹唐嫻周泱王輝

(深圳市第三人民醫(yī)院，深圳518112)

目的：分析Δ42PD1胞外區(qū)的免疫原性。方法：將Δ42PD1胞外區(qū)編碼基因分為6個(gè)片段，分別用PCR的方法進(jìn)行擴(kuò)增，并克隆至酵母表面展示質(zhì)粒pCTCON2。分別將重組酵母表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞，涂布SDCAA平板，挑取單細(xì)胞克隆于SGCAA培養(yǎng)基中誘導(dǎo)目的基因的表達(dá)。通過(guò)肌肉注射Δ42PD1真核表達(dá)質(zhì)粒加局部電穿孔的方法免疫BALB/c小鼠，制備鼠抗人Δ42PD1免疫血清。用流式細(xì)胞術(shù)的方法分析免疫血清與酵母表面展示的Δ42PD1多肽片段的結(jié)合。結(jié)果：PCR擴(kuò)增的Δ42PD1的6個(gè)片段的編碼序列全長(zhǎng)均110 bp,核酸序列分析顯示克隆的目的基因與GenBank中已經(jīng)登記的PD1基因序列100%同源；流式細(xì)胞術(shù)的結(jié)果發(fā)現(xiàn)酵母表面展示的Δ42PD1的F3和F2片段可與Δ42PD1的免疫血清發(fā)生明顯結(jié)合。結(jié)論：Δ42PD1的F3和F2片段是該分子的免疫優(yōu)勢(shì)區(qū)域，為制備Δ42PD1的單克隆抗體及表位篩選奠定了基礎(chǔ)。

程序性細(xì)胞死亡受體1；Delta-42程序性細(xì)胞死亡受體1；酵母表面展示；免疫原性；流式細(xì)胞術(shù)

程序性細(xì)胞死亡受體1(Programmed cell death 1，PD1)，又名CD279，屬CD28家族，為Ⅰ型跨膜蛋白，由胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)組成。其胞外區(qū)含有1個(gè)免疫球蛋白可變區(qū)樣結(jié)構(gòu)，胞內(nèi)區(qū)含有2個(gè)酪氨酸，分別組成免疫受體酪氨酸抑制模體和免疫受體酪氨酸轉(zhuǎn)換模體[1]。PD1誘導(dǎo)表達(dá)于活化的T細(xì)胞、B細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞以及單核細(xì)胞。與其配體PD-L1或PD-L2的相互作用后，PD1通過(guò)磷酸化酪氨酸模體繼而向細(xì)胞內(nèi)傳遞抑制性信號(hào)，抑制免疫細(xì)胞的活化和細(xì)胞因子的分泌，最終調(diào)節(jié)機(jī)體免疫活化和免疫耐受[2，3]。近年來(lái)，以PD1通路為靶點(diǎn)的中和抗體免疫療法在惡性腫瘤治療中顯示出顯著的療效，成為腫瘤免疫治療領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[4，5]。

2013年，香港大學(xué)陳志偉教授課題組在健康人外周血單個(gè)核細(xì)胞內(nèi)，利用RT-PCR的方法檢測(cè)到了PD1 mRNA的一種選擇性剪接異構(gòu)體。與全長(zhǎng)PD1編碼序列相比，該轉(zhuǎn)錄本在第2個(gè)外顯子的5′端框內(nèi)缺失了42個(gè)堿基，因此被命名為Δ42PD1[6]。與PD1不同的是，Δ42PD1不與PD-L1或PD-L2結(jié)合，也不與常見(jiàn)的幾株商業(yè)化的PD1單克隆抗體相結(jié)合。體外研究發(fā)現(xiàn)，重組PD1蛋白不能，但Δ42PD1可以刺激外周血單個(gè)核細(xì)胞分泌IL-1、IL-6和TNF-α等前炎性細(xì)胞因子，表明Δ42PD1也是一種功能性免疫調(diào)節(jié)蛋白[6]。本研究將Δ42PD1胞外區(qū)分為6個(gè)重疊的多肽片段，并展示在酵母細(xì)胞表面，用流式細(xì)胞術(shù)的方法分析了酵母表面多肽片段與Δ42PD1抗血清的結(jié)合，發(fā)現(xiàn)了第2和第3個(gè)多肽片段為Δ42PD1的免疫優(yōu)勢(shì)區(qū)域，為單克隆抗體的制備和表位篩選，繼而深入研究Δ42PD1的免疫調(diào)節(jié)功能奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料酵母表面展示表達(dá)質(zhì)粒pCTCON-2和EBY100畢赤酵母由香港大學(xué)陳志偉教授惠贈(zèng)。Δ42PD1真核表達(dá)質(zhì)粒pIRES-Δ42PD1和pVAX-Δ42PD1fc由本實(shí)驗(yàn)室(深圳市第三人民醫(yī)院肝病研究所艾滋病研究室)保存。高保真DNA聚合酶PrimeSTAR、DNA分子量Marker均購(gòu)自大連TaKaRa公司。限制性核酸內(nèi)切酶NheⅠ和BamHⅠ購(gòu)自Thermo公司。質(zhì)粒DNA提取純化試劑盒購(gòu)自Promega公司。鼠抗c-Myc抗體、PE標(biāo)記的兔抗鼠IgG二抗為美國(guó)Invitrogen公司產(chǎn)品。免疫用雌性8周齡BALB/c小鼠由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2方法

1.2.1小鼠免疫血清制備取BALB/c小鼠5只、雌性、6～8周齡。分別于第0、4、8周進(jìn)行3次免疫。免疫方法：取100 μg真核表達(dá)質(zhì)粒pVAX-Δ42PD1fc，于小鼠后腿肌肉處進(jìn)行注射，肌注后立即用TERESA基因?qū)雰x(上海塔瑞莎生物技術(shù)有限公司)進(jìn)行注射局部電穿孔。電穿孔的參數(shù)：針式電極、針距0.5 cm、電壓為60伏。于最后一次免疫后7～10 d采血，將5只小鼠血清混合，凍存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2PCR擴(kuò)增Δ42PD1基因片段以真核表達(dá)質(zhì)粒pIRES-Δ42PD1為模板，PCR分別擴(kuò)增人Δ42PD1基因的6個(gè)片段(F1-F6)。引物序列分別為，F(xiàn)1-F：5′-ACAA GCTAGC CTG CTC GTG GTG AC-3′， F1-R：5′-AACA GGATCC CAT GCG GTA CCA G-3′； F2-F：5′-ACAA GCTAGC GAG AGC TTC GTG CTA AAC-3′， F2-R：5′-AACA GGATCC GCC GGG CTG GCT GCG GTC-3′； F3-F：5′-ACAA GCTAGC GCC TTC CCC GAG GAC-3′， F3-R：5′-AACA GGATCC CAC GCT CAT GTG GAA G-3′； F4-F：5′-ACAA GCTAGC CCC AAC GGG CGT GAC-3′， F4-R：5′-AACA GGATCC GGG GGC CAG GGA GAT G-3′； F5-F：5′-ACAA GCTAGC TAC CTC TGT GGG GCC ATC-3′， F5-R：5′-AACA GGATCC TTC TGC CCT TCT CTC TG-3′； F6-F：5′-ACAA GCTAGC GAG CTC AGG GTG ACA G-3′， F6-R：5′-AACA GGATCC CAC CAG GGT TTG GAA C-3′。引物兩端均分別引入NheⅠ和BamHⅠ(加粗顯示)酶切位點(diǎn)，以便于進(jìn)行定向克隆。反應(yīng)條件為98℃預(yù)變性3 min，然后98℃ 10 s、60℃ 10 s、72℃ 20 s，擴(kuò)增35個(gè)循環(huán);最后72℃延伸5 min。產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.2.3酵母表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及雙酶切鑒定分別取重組真核表達(dá)質(zhì)粒pIRES-PD1、用限制性?xún)?nèi)切酶NheⅠ和BamHⅠ分別雙酶切1 μg酵母表達(dá)質(zhì)粒pCTCON-2和純化的PCR產(chǎn)物。酶切產(chǎn)物純化后用T4 DNA連接酶于16℃連接過(guò)夜，轉(zhuǎn)化TOP10 感受態(tài)細(xì)胞，分別涂布于含卡那霉素的LB平板上，37℃培養(yǎng)過(guò)夜。分別挑取平板上的菌落，擴(kuò)增后小量制備重組酵母表達(dá)質(zhì)粒。用限制性?xún)?nèi)切酶NheⅠ和BamHⅠ分別雙酶切1 μg重組酵母表達(dá)質(zhì)粒，產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，選取含有目的片段的質(zhì)粒進(jìn)行核酸序列測(cè)定，最后選100%同源的質(zhì)粒分別命名為pCTCON2-Δ42PD1-F1至F6。

1.2.4酵母轉(zhuǎn)化及外源基因誘導(dǎo)表達(dá)分別將酵母表面展示表達(dá)質(zhì)粒pCTCON2-Δ42PD1-F1至F6分別用LiAC的方法轉(zhuǎn)化酵母菌EBY100，涂布SDCAA平板，置30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d。挑取單個(gè)酵母克隆，在5 ml SDCAA培養(yǎng)基(2%葡萄糖、0.67%無(wú)氨基酸酵母氮源、0.5%酪氨酸、1.36%Na2HPO4·12H2O、0.85%NaH2PO4·H2O)中于30℃培養(yǎng)箱中擴(kuò)增2 d，并分別命名為Yeast-Δ42PD1-F1至F6。將擴(kuò)增后的酵母細(xì)胞轉(zhuǎn)移至SGCAA培養(yǎng)基(2%半乳糖、0.67 %無(wú)氨基酸酵母氮源、0.5%酪氨酸、1.36%Na2HPO4·12 H2O、0.85%NaH2PO4·H2O)中，于20℃震蕩培養(yǎng)36 h，以誘導(dǎo)外源基因的表達(dá)。

1.2.5流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)抗血清與酵母表面展示多肽的結(jié)合取200 μl誘導(dǎo)后的酵母細(xì)胞，離心后，100 μl流式緩沖液(PBS+2%FBS+0.1%NaN3)重懸，加2 μl免疫血清或0.5 μg鼠抗c-Myc單克隆抗體，4℃避光反應(yīng)30 min，流式緩沖液洗3次后，100 μl流式緩沖液中加入0.2 μg PE標(biāo)記兔抗鼠熒光二抗，4℃避光反應(yīng)30 min，洗滌后用流式細(xì)胞儀(BD FACS Calibur)檢測(cè)。

2　結(jié)果

2.1PCR擴(kuò)增Δ42PD1多肽片段的編碼序列除在L25和A26之間缺失了14個(gè)氨基酸殘基(圖1中箭頭標(biāo)示缺失的位置及序列)之外，Δ42PD1胞外區(qū)氨基酸序列與PD1完全一致。從L27至156V的130個(gè)氨基酸殘基被分為6個(gè)多肽片段(Fragment-1至6)，每個(gè)片段含30個(gè)氨基酸殘基，且各片段間具有10個(gè)氨基酸殘基的重疊(圖1)。以質(zhì)粒pIRES-Δ42PD1為模板，通過(guò)PCR的方法擴(kuò)增圖1所示Δ42PD1的6個(gè)多肽片段的編碼DNA序列(Δ42PD1-F1至F6)，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析，在預(yù)期110 bp的位置上出現(xiàn)目的片段的條帶(圖2)。

2.2Δ42PD1多肽片段酵母表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建將圖2中的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化后，利用NheⅠ和BamHⅠ限制性?xún)?nèi)切酶，分別將Δ42PD1的6個(gè)多肽片段的編碼序列定向克隆至酵母表面展示載體pCTCON-2中，構(gòu)建Δ42PD1多肽片段酵母表面展示表達(dá)質(zhì)粒pCTCON2-Δ42PD1-F1至F6，然后通過(guò)雙酶切的方法進(jìn)行鑒定。結(jié)果如圖3所示，在預(yù)期的位置看到了Δ42PD1-F1至F6的條帶。最后將質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，比對(duì)結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒中目的基因與GenBank中PD1(NM_005018)的序列100%同源。

圖1　Δ42PD1胞外區(qū)氨基酸序列及各個(gè)多肽片段的位置Fig.1　Amino acid sequence and peptide-fragment position of Δ42PD1 extracellular region

圖2　PCR擴(kuò)增Δ42PD1的6個(gè)多肽片段編碼序列Fig.2　Amplification of six fragments of Δ42PD1 via PCR

2.3Δ42PD1多肽片段免疫原性預(yù)測(cè)通過(guò)DNAstar Protean軟件，以Jameson-Wolf方案分析Δ42PD1的6個(gè)多肽片段的免疫原性。結(jié)果如圖4所示，氨基酸殘基的免疫原性高低用抗原性指數(shù)(Antigenic index)表示，分值在-1.7至1.7之間，分值越高，表示免疫原性越強(qiáng)。Δ42PD1的6個(gè)多肽片段各含有2個(gè)免疫優(yōu)勢(shì)區(qū)域。其中，多肽片段Δ42PD1-F1、Δ42PD1-F4的免疫優(yōu)勢(shì)區(qū)域較短，Δ42PD1-F5的2個(gè)免疫優(yōu)勢(shì)區(qū)域分值均較低，Δ42PD1-F6的第一個(gè)免疫優(yōu)勢(shì)區(qū)域分值較低。因此預(yù)測(cè)Δ42PD1的6個(gè)多肽片段中F3和F2的免疫原性最強(qiáng)，F(xiàn)1、F4和F6次之，F(xiàn)5最弱。

2.4Δ42PD1多肽片段免疫原性分析為了進(jìn)一步鑒定Δ42PD1各個(gè)多肽片段的免疫原性，我們通過(guò)肌肉注射真核表達(dá)質(zhì)粒DNA加局部電穿孔的免疫方法，制備鼠抗人Δ42PD1的免疫血清。然后用流式細(xì)胞術(shù)的方法分析免疫血清中Δ42PD1的多克隆抗體對(duì)酵母表面展示的Δ42PD1各個(gè)多肽片段的結(jié)合。結(jié)果如圖5所示，6株酵母細(xì)胞均能檢測(cè)到c-Myc標(biāo)簽的表達(dá)，表明Δ42PD1的6個(gè)多肽片段均得到正確的表達(dá)且被展示到酵母細(xì)胞表面。Δ42PD1的免疫血清與F3和F2的結(jié)合能力最強(qiáng)，F(xiàn)5、F1和F4次之，F(xiàn)6最弱，表明Δ42PD1的F3和F2片段的免疫原性最強(qiáng)，F(xiàn)6片段的免疫原性最弱。F6片段的免疫原性明顯低于預(yù)測(cè)情況，可能是因?yàn)槊庖哐逯苽鋵?shí)驗(yàn)中所使用的免疫原Δ42PD1羧基端融合了兔IgG的Fc段，使其形成二聚體，顯著降低了F6片段在分子表面的暴露程度，降低了該片段的免疫原性。

圖3　重組酵母表面展示質(zhì)粒酶切圖譜Fig.3　Restriction mapping analysis of recombinant yeast surface displaying plasmids

圖4　DNAstar分析Δ42PD1多肽片段免疫原性 Fig.4　Analysis of immunogenicity of Δ42PD1 fragments via DNAstar software

圖5　流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Δ42PD1免疫血清與表面展示Δ42PD1片段的酵母細(xì)胞的結(jié)合Fig.5　Binding of Δ42PD1 anti-serum to yeast cells surface-displaying Δ42PD1 fragments determined via flowcytometry

3　討論

人PD1基因位于人2號(hào)染色體q37.3，長(zhǎng)約10 kb。早期的研究發(fā)現(xiàn)，PD1基因缺陷型小鼠導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)小鼠發(fā)生一系列自身免疫性疾病，首次揭示了PD1缺陷與自身免疫的關(guān)系[7]。后來(lái)逐漸證實(shí)，人體內(nèi)PD1的異常與系統(tǒng)性紅斑狼瘡、心肌炎、腦脊髓炎、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化和Ⅰ型糖尿病等多種嚴(yán)重自身免疫性疾病的發(fā)生密切相關(guān)[8-10]。然而，PD1的過(guò)度表達(dá)會(huì)導(dǎo)致抗原特異性T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞功能耗竭，最終引起持續(xù)性感染以及腫瘤的發(fā)生[11，12]。而阻斷PD1與PD-L1的相互作用可部分轉(zhuǎn)逆特異性CTL細(xì)胞的功能，進(jìn)而促進(jìn)病毒和腫瘤細(xì)胞的清除[13，14]。此外，PD1參與母胎免疫耐受的誘導(dǎo)和妊娠的維持[15]，并通過(guò)調(diào)節(jié)分泌型IgA的多樣化保持黏膜菌群與宿主免疫系統(tǒng)的共生平衡[16]。

人PD1基因包含5個(gè)外顯子。在Δ42PD1被發(fā)現(xiàn)之前，已經(jīng)報(bào)道了另外4種PD1的選擇性剪接轉(zhuǎn)錄本：PD1Δex2、PD1Δex3、PD1Δex2,3、PD1Δex2,3,4[17]。其中PD1Δex3因缺失跨膜區(qū)而被分泌至細(xì)胞外，可結(jié)合PD1配體，競(jìng)爭(zhēng)性阻斷細(xì)胞表面PD1與配體的結(jié)合，可導(dǎo)致自身免疫性疾病的發(fā)生[18]。而PD1的另外3個(gè)選擇性剪接異構(gòu)體PD1Δex2、PD1Δex2，3、PD1Δex2，3,4尚未見(jiàn)功能相關(guān)的報(bào)道。Δ42PD1因缺失14個(gè)氨基酸，可能導(dǎo)致其空間構(gòu)象發(fā)生變化，使其不能與PD-L1和PD-L2相互結(jié)合[6]。而結(jié)構(gòu)的變化進(jìn)一步導(dǎo)致功能的變化：Δ42PD1可通過(guò)某種(某些)未知的受體，刺激外周血單個(gè)核細(xì)胞分泌IL-1、IL-6、TNFα等炎癥性細(xì)胞因子[6]，表明Δ42PD1是一種新發(fā)現(xiàn)的免疫調(diào)節(jié)蛋白，且其免疫功能與PD1不同。因此揭示Δ42PD1在生理?xiàng)l件下的免疫功能，及其與相關(guān)疾病發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系顯得尤為重要。

結(jié)構(gòu)的變化導(dǎo)致幾株商業(yè)化PD1單克隆抗體不能識(shí)別Δ42PD1，阻礙了對(duì)該分子功能的研究進(jìn)程。為鑒定Δ42PD1的免疫優(yōu)勢(shì)區(qū)域，進(jìn)而制備單克隆抗體。本研究采用酵母表面展示技術(shù)，將Δ42PD1胞外區(qū)多肽片段展示在酵母細(xì)胞表面，并通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)其與Δ42PD1免疫血清的結(jié)合，進(jìn)而分析Δ42PD1的免疫優(yōu)勢(shì)區(qū)域。與化學(xué)合成的多肽片段相比較，展示在酵母表面的多肽片段可以更大程度的保持其天然構(gòu)象[19]，更適合用于抗原優(yōu)勢(shì)區(qū)域的分析；其次，酵母表面展示的方法也更廉價(jià)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與軟件預(yù)測(cè)的結(jié)果類(lèi)似，Δ42PD1的免疫優(yōu)勢(shì)區(qū)域主要集中在F2和F3。然而，F(xiàn)6實(shí)際的免疫原性顯著低于預(yù)測(cè)結(jié)果，可能由于軟件是對(duì)肽片段進(jìn)行預(yù)測(cè)，不包含蛋白整體構(gòu)象的信息以及膜蛋白的位阻效應(yīng)的信息?？傊狙芯孔C實(shí)Δ42PD1的免疫優(yōu)勢(shì)區(qū)域位于47E～76A之間，為單克隆抗體的制備及其生理功能的研究奠定了基礎(chǔ)。

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[收稿2015-12-17修回2016-01-26]

(編輯倪鵬)

Analysis of immunogenicity of Δ42PD1 via yeast surface displaying peptide fragments

CHENG Lin,WANG Zi-Qiao,XU Liu-Mei,TANG Xian,ZHOU Yang,WANG Hui.

The Third People′s Hospital of Shenzhen,Shenzhen 518112,China

Objective:To analyze the immunogenicity of the extracellular region of Δ42PD1.Methods: Six fragments of Δ42PD1 extracellular region-encoding sequence were amplified by PCR,and were cloned into pCTCON2 vector,a yeast surface displaying vector.Yeast cells were transfected with Δ42PD1 fragment-carrying plasmids,then yeast cells were spread on SDCAA plates.Single cell clones were selected and cultured in SGCAA media to induce expression of the target genes.Mouse anti-human Δ42PD1 anti-serum were generated by immunization of BALB/c mice via intramuscular injection of Δ42PD1-carrying plasmid plus in-situ electroporation.The binding of anti-serum with yeast cells surface-displaying Δ42PD1 fragments were analyzed using flowcytometry.Results: Nucleotide sequences analysis indicated that the amplified six fragments of Δ42PD1 sequence length were 110 bp,and the isolated sequence of Δ42PD1 fragments were 100% homology with PD1 gene previously registered in GenBank.Results from flowcytometry showed that among the six fragments of Δ42PD1 displaying on the surface of yeast cells,F3 and F2 profoundly bound Δ42PD1-specific polyclonal antibodies.Conclusion: F3 and F2 of Δ42PD1 is an immunogenic dominant region,which pave the way for generation of Δ42PD1-specific monoclonal antibody and epitope mapping.

PD1;Δ42PD1;Yeast surface display;Immunogenicity;Flowcytometry

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.09.019

及指導(dǎo)教師：王輝(1963年-)，女，碩士，教授，主任醫(yī)師，主要從事艾滋病臨床治療方面的研究，E-mail：huiwang98@yahoo.com。

R392.11

A

1000-484X(2016)09-1333-05

①本文為國(guó)家自然科學(xué)基金(31500750)、廣東省自然科學(xué)基金(2016A030313030)和深圳市科技創(chuàng)新基金(JCYJ2014 0411111718162，JCYJ20150402111430650)資助項(xiàng)目。作者簡(jiǎn)介：程林(1980年-)，男，博士，助理研究員，主要從事病毒感染與抗病毒免疫方面的研究，E-mail：chenglin252@163.com。