石小玉　陳少芬　古華平　盧　慧　李文林③

(南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，南昌330006)

?

·生物治療·

白介素-13對與乳腺癌細胞共培養(yǎng)的成纖維細胞SDF-1和EGF表達影響①

石小玉陳少芬古華平盧慧②李文林②③

(南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，南昌330006)

目的：為了探索白細胞介素-13(Interleukin-13,IL-13)在乳腺癌發(fā)展中的作用機制，我們研究了IL-13對與乳腺癌細胞共生長的成纖維細胞表達SDF-1(Stromal cell derived factor 1)和 EGF(Epidermal growth factor)的影響。方法：采用體外和荷瘤裸鼠體內(nèi)人乳腺癌細胞株MDA-MB-231和人成纖維細胞株CCC-ESF-1(ESF)共培養(yǎng)的方法，用定量PCR(RT-qPCR)方法、流式細胞術(shù)和Western blot方法檢測在IL-13作用下體外共培養(yǎng)的成纖維細胞SDF-1和EGF的表達，細胞增殖實驗Cell counting kit-8(CCK-8)觀察IL-13對體外共培養(yǎng)的乳腺癌細胞增殖的影響；免疫熒光激光共聚焦顯微鏡觀察在IL-13作用下荷瘤裸鼠體內(nèi)與乳腺癌細胞共生長的成纖維細胞SDF-1和EGF的表達，檢測IL-13對荷瘤裸鼠腫瘤體積的影響。結(jié)果：IL-13上調(diào)體外與乳腺癌細胞共培養(yǎng)的成纖維細胞SDF-1和EGF的表達,并促進共培養(yǎng)的乳腺癌細胞的增殖；IL-13上調(diào)荷瘤裸鼠乳腺癌組織成纖維細胞SDF-1和EGF的表達，并促進荷瘤裸鼠腫瘤生長。結(jié)論：IL-13上調(diào)與乳腺癌細胞共培養(yǎng)的成纖維細胞SDF-1和EGF的表達，IL-13對乳腺癌促進作用的分子機制涉及乳腺癌基質(zhì)成纖維細胞的SDF-1和EGF。

白細胞介素-13；成纖維細胞；乳腺癌；SDF-1;EGF

乳腺癌是全世界最常見的女性惡性腫瘤[1],在我國，乳腺癌發(fā)病率位居城鄉(xiāng)女性首位，是危害居民生命健康的最主要的惡性腫瘤之一[2]。乳腺癌的發(fā)病原因和機制復(fù)雜，尚需深入研究。白細胞介素-13(Interleukin-13,IL-13)是Th2細胞因子，參與纖維化、過敏性疾病、炎癥和腫瘤的發(fā)生發(fā)展[3]，有研究表明IL-13存在于乳腺癌組織,對乳腺癌的生長起著促進作用[4-6]。本文研究了在人成纖維細胞與人乳腺癌細胞共培養(yǎng)條件下IL-13對成纖維細胞SDF-1(Stromal cell derived factor 1)和EGF(Epidermal growth factor)表達的影響,以及IL-13對荷瘤裸鼠乳腺癌組織SDF-1和EGF表達的影響，試圖探索IL-13對乳腺癌作用的分子機制。

1　材料與方法

1.1主要實驗材料人成纖維細胞株CCC-ESF-1(文中簡稱ESF)來自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細胞中心，人乳腺癌細胞株MDA-MB-231來自中國科學(xué)院上海細胞資源中心，IL-13購自美國PeproTech 公司，DMEM-H 培養(yǎng)液購自美國Life Tech-Gibco 公司,RevertAid first strand cDNA 試劑盒購自Thermo Scientific USA，qPCR試劑IQ SYBR Green Supermix和SuperReal PreMix Plus (with SYBR green) 分別購自美國Bio-Rad和中國Tiangen 公司，Transwell 小室(孔徑0.4 μm)購自美國Fisher Scientifi公司，雌性裸鼠購自上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司[許可證號SCXK(滬)2012-0002]，SDF-1抗體和EGF抗體購自美國Santa Cruz，BCA蛋白濃度測定試劑盒購自中國Beyotime。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)和共培養(yǎng)ESF細胞和MDA-MB-231細胞分別加入DMEM-H培養(yǎng)基在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，10%胎牛血清，100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素,37℃，5%CO2，飽和濕度，細胞生長至80%～90%匯合時,進行傳代培養(yǎng)。采用培養(yǎng)板和Transwell小室對ESF細胞和MDA-MB-231細胞進行體外共培養(yǎng)，用于檢測ESF細胞SDF-1和EGF的表達。根據(jù)實驗要求分別接種細胞，接種在培養(yǎng)板的細胞用于各實驗。待培養(yǎng)板的細胞貼壁后,再把接種了細胞的Transwell 小室放到細胞已貼壁的培養(yǎng)板中進行共培養(yǎng),共培養(yǎng)的ESF細胞和MDA-MB-231細胞不直接接觸,但在同一培養(yǎng)液中,通過培養(yǎng)液相互影響，以便細胞分類實驗。

1.2.2RT-qPCR (Reverse transcription quantitative polymerase chain reaction)細胞培養(yǎng)72 h后加入IL-13(50 ng/ml)，30 min，收集細胞，Trizol-離心柱法提取細胞總RNA,取2 μl RNA 溶液于Merinton SMA4000 檢測，觀察A260/A280 比值及連續(xù)波長吸收峰，并計算RNA溶液濃度，判斷RNA提取質(zhì)量，A260/A280>2.0且<2.3，則可用于后續(xù)逆轉(zhuǎn)錄實驗。逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA主要步驟：總RNA溶液11 μl(約0.6～0.8 μg),隨機引物1 μl,混勻，離心，65℃干浴5 min，冰上冷卻，加5×Reaction Buffer 4 μl,RiboLock RNase抑制劑1 μl (20 U/μl),2 μl (10 mmol/L) dNTP(mix) Revert Aid MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶1 μl,總體積20 μl，混勻，25℃ 5 min，接著42℃ 60 min，70℃ 5 min終止反應(yīng)，-20℃保存cDNA。PCR擴增反應(yīng)主要步驟：IQ SYBR Green Supermix或2×SuperRead PreMix plus (with SYBR Green Ⅰ)10 μl,順向引物1 μl (10 μmol)，逆向引物1 μl (10 μmol),cDNA 8 μl (10 μmol),總體積20 μl；50℃ 3 min，95℃ 3 min(IQ SYBR Green Supermix)或15 min(2×SuperRead PreMix plus)， 95℃ 10 s (SDF-1) 或95℃ 6 s (EGF)，63.5℃ 30 s (SDF-1)或60.5℃ 25 s (EGF)，40個循環(huán)；72℃ 7 min延伸；熔解曲線65℃～95℃,溫度以0.5℃/10 s的速率上升。實驗結(jié)果由熒光定量PCR分析軟件Bio-Rad CFX Manager自動進行統(tǒng)計和計算。SDF-1引物：上游引物：5′-CAGGTGGTGGCTTAACAGG-3′，下游引物：5′-AAGAGGAGGTGAAGGCAGTG-3′；EGF引物：上游引物5′-CAAAACGCCGAAGACTTACC-3′，下游引物5′-GACCATCCAGAGCCAGACAC-3′。

1.2.3免疫熒光流式細胞術(shù)細胞培養(yǎng)72 h后加入IL-13(50 ng/ml)，40 min，PBS漂洗細胞2遍，消化和收集細胞。用4%的多聚甲醛溶液固定細胞30 min，0.1%Triton X-100作用細胞5～10 min，5%的BSA溶液作用細胞60 min。加入一抗37℃孵育2 h，PBS漂洗3次，離心去上清。加入二抗/IgG-FITC，室溫避光孵育60 min，PBS漂洗3次，離心去上清。加入500 μl FCM buffer重懸細胞，流式細胞儀檢測。

1.2.4Western blot實驗細胞培養(yǎng)72 h后加入IL-13(50 ng/ml)，40 min，洗滌和收集培養(yǎng)的細胞，加入細胞裂解液,4℃，30 min,把細胞碎片和裂解液移至離心管，4℃ 12 000 r/min離心5 min，收集離心后的上清分裝轉(zhuǎn)移到離心管中放于-20℃保存。根據(jù)BCA蛋白濃度測定試劑盒說明書配制不同濃度的蛋白標(biāo)準(zhǔn)品,在酶標(biāo)儀562 nm下比色測定，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。把待測樣品放入96孔板中，加 BCA 工作液，在酶標(biāo)儀562 nm下比色測定,記錄各孔吸光值,在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得相應(yīng)蛋白含量。聚丙烯酰胺凝膠蛋白電泳(10%分離膠，5%濃縮膠),每泳道20 μg蛋白質(zhì),濃縮膠電泳電流為25 mA，分離膠電泳電流為30 mA， 將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜,5%去脂牛奶封閉,一抗分別與PBS、0.1% Tween-20和5%去脂牛奶混合,膜放入該混合液中4 ℃過夜,洗滌后加入二抗,ECL顯色,Image J軟件分析各條帶光密度。

1.2.5人乳腺癌細胞與人成纖維細胞共生長的荷瘤裸鼠模型ESF細胞和MDA-MB-231細胞共培養(yǎng)72 h， PBS洗滌細胞，取100 μl細胞懸液(細胞濃度：2×106MDA-MB-231細胞，1×106ESF細胞)植入6周的雌性裸鼠右側(cè)胸壁乳腺內(nèi)，每隔1 d用游標(biāo)卡尺測量瘤體的最長徑(a)和最短徑(b)，根據(jù)公式計算腫瘤體積,V(mm3)= ab2/2[7]。以腫瘤長徑達5 mm為成瘤，當(dāng)腫瘤長徑為7 mm左右時，將荷瘤裸鼠分為4組：ESF+MDA-MB-231+IL-13組；ESF+MDA-MB-231組；MDA-MB-231組和MDA-MB-231+IL-13組。對實驗組進行腫瘤組織內(nèi)多點注射IL-13，每個點50 μl，共4個點，腫瘤塊中心1個點，圍繞腫瘤中心再分布3個點，每次注射IL-13的總濃度為1 μg/kg,每隔1 d注射，注射9次。對照組瘤體內(nèi)給予生理鹽水200 μl。IL-13干預(yù)后的第21天將裸鼠頸椎脫臼處死，將腫瘤組織塊放入10%福爾馬林固定液中固定。

1.2.6免疫熒光激光共聚焦顯微鏡觀察荷瘤裸鼠腫瘤組織石蠟包埋切片，切片脫蠟后進行免疫熒光實驗。主要步驟如下：0.01 mol/L 枸櫞酸緩沖液(pH6.0) 微波修復(fù)抗原，自然冷卻至室溫，PBS漂洗3次。1%BSA 37℃封閉30 min，滴加一抗4℃ 孵育過夜，次日取出濕盒，轉(zhuǎn)至室溫平衡30 min，PBS 漂洗3 次。滴加熒光二抗，37℃孵育避光60 min，PBS 漂洗3 次，每次5 min。DAPI 室溫染細胞核10 min，PBS洗3次，封片。激光共聚焦顯微鏡下觀察，拍照,Image-Pro Plus 軟件分析熒光強度。

1.2.7細胞增殖實驗采用Cell Counting Kit-8(CCK-8)檢測體外培養(yǎng)的MDA-MB-231細胞的增殖，細胞接種在24孔培養(yǎng)板,接種了ESF細胞的Transwell 小室插入24孔培養(yǎng)板內(nèi)進行共培養(yǎng)。每組設(shè)5個復(fù)孔,檢測第1天～第5天的MDA-MB-231細胞增殖狀況，依據(jù)CCK-8 Kit說明書,各孔加入20 μl CCK-8溶液,培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1～3 h,從每份樣品中取100 μl液體移至96孔板,放入酶標(biāo)儀,450nm波長處測定吸光值。

2　結(jié)果

2.1IL-13上調(diào)與人乳腺癌細胞共培養(yǎng)的人成纖維細胞SDF-1的表達細胞培養(yǎng)72 h后加IL-13(50 ng/ml)，IL-13作用30 min后，用RT-qPCR檢測IL-13對與MDA-MB-231細胞共培養(yǎng)的ESF細胞表達SDF-1 mRNA的影響。RT-qPCR結(jié)果顯示(圖1A)，與各組比較，ESF+MDA-MB-231共培養(yǎng)組加IL-13后ESF細胞SDF-1 mRNA的表達顯著上調(diào)(P<0.05)；未加IL-13的ESF+MDA-MB-231共培養(yǎng)組的ESF細胞SDF-1 mRNA的表達遠比ESF+MDA-MB-231+IL-13共培養(yǎng)組低(P<0.05)；ESF單獨培養(yǎng)組加IL-13后ESF細胞SDF-1 mRNA的表達遠比ESF+MDA-MB-231+IL-13共培養(yǎng)組低(P<0.05)。這些結(jié)果表明，IL-13能上調(diào)與乳腺癌細胞共培養(yǎng)的ESF細胞SDF-1 mRNA的表達，乳腺癌細胞與成纖維細胞共培養(yǎng)能增強IL-13對SDF-1 mRNA的上調(diào)作用。用免疫熒光流式細胞術(shù)檢測IL-13對SDF-1蛋白表達的影響，細胞培養(yǎng)72 h后加IL-13(50 ng/ml)，IL-13作用40 min后，收集細胞進行檢測。流式細胞儀結(jié)果顯示(圖1B),與其他各組比較，ESF+MDA-MB-231+ IL-13共培養(yǎng)組ESF細胞SDF-1 蛋白表達的峰值右移，表明SDF-1 蛋白表達上調(diào)，說明IL-13可上調(diào)與乳腺癌細胞共培養(yǎng)的ESF細胞SDF-1蛋白的表達,這一結(jié)果與RT-qPCR的實驗結(jié)果相互印證。

2.2 IL-13可上調(diào)與人乳腺癌細胞共培養(yǎng)的人成纖維細胞EGF的表達細胞培養(yǎng)72 h后加IL-13(50 ng/ml)，30 min，用RT-qPCR檢測IL-13對與MDA-MB-231細胞共培養(yǎng)的ESF細胞表達EGF mRNA的影響。RT-qPCR結(jié)果顯示(圖2A)，與單獨培養(yǎng)組和未加IL-13共培養(yǎng)組比較，加IL-13上調(diào)共培養(yǎng)組ESF細胞EGF mRNA 水平(P<0.05)，ESF組EGF的表達比其他組低(P<0.05)。Western blot實驗檢測IL-13對EGF蛋白表達的影響，細胞培養(yǎng)72 h后加IL-13(50 ng/ml)，IL-13作用40 min后，收集細胞進行檢測。Western blot實驗結(jié)果顯示(圖2B、C),與其他各組比較，ESF+MDA-MB-231+IL-13共培養(yǎng)組ESF細胞EGF表達上調(diào)(P<0.05)。表明成纖維細胞在與乳腺癌細胞共培養(yǎng)的狀況下，IL-13能促進成纖維細胞表達EGF。

圖1　IL-13上調(diào)與MDA-MB-231細胞共培養(yǎng)的ESF細胞SDF-1的表達Fig.1　SDF-1 up-regulated by IL-13 in ESF cells co-cultured with MDA-MB-231 cellsNote: A .RT-qPCR analysis of the mRNA expression levels of SDF-1;B.Flow cytometry analysis of the protein expression levels of SDF-1.*.P<0.05;#.P>0.05.

2.3IL-13上調(diào)荷瘤裸鼠乳腺癌組織成纖維細胞SDF-1的表達荷瘤裸鼠乳腺癌組織切片HE染色后于光學(xué)顯微鏡下觀察腫瘤組織一般狀況，可見腫瘤組織呈實體樣結(jié)構(gòu)，有豐富的毛細血管，腫瘤細胞核大，核仁著色深且明顯，可見核分裂像(圖3A)。免疫熒光標(biāo)記后于激光共聚焦顯微鏡下觀察IL-13對腫瘤組織SDF-1表達的影響，鏡下可見ESF+MDA-MB-231+IL-13組的腫瘤組織出現(xiàn)較強的SDF-1表達，而ESF+MDA-MB-231組的腫瘤組織熒光較弱(圖3B)。Image-Pro Plus軟件分析熒光強度(圖3C)，ESF+MDA-MB-231+IL-13組腫瘤組織的熒光強度顯著高于ESF+MDA-MB-231組，在MDA-MB-231+IL-13組和MDA-MB-231組未見SDF-1明顯表達,表明IL-13可促進荷瘤裸鼠乳腺癌組織成纖維細胞表達SDF-1。

圖2　IL-13上調(diào)與MDA-MB-231細胞共培養(yǎng)的ESF細胞EGF的表達Fig.2　EGF up-regulated by IL-13 in ESF cells co-cultured with MDA-MB-231 cellsNote: A.RT-qPCR analysis of the mRNA expression levels of EGF;B.Western blot analysis of the protein expression level of EGF;C.Quantification of EGF protein expression levels from Western blot assay by Image J software.*.P<0.05;#.P>0.05.

圖3　IL-13上調(diào)荷瘤裸鼠乳腺癌組織成纖維細胞SDF-1的表達Fig.3　SDF-1 up-regulated by IL-13 in fibroblasts of breast tumor tissue of tumor-burdened nude miceNote: A.HE (Hematoxylin,Eosin ) staining for breast tumor tissue of tumor-burdened nude mice; B. SDF-1 figures of immunofluo-rescence and laser confocal microscope; C. Analysis the fluorescence intensity of SDF-1 by Image-Pro Plus software.*.P<0.05;#.P>0.05.

2.4 IL-13上調(diào)荷瘤裸鼠乳腺癌組織成纖維細胞EGF的表達圖4A顯示荷瘤裸鼠乳腺癌組織EGF的表達，可見ESF+MDA-MB-231+IL-13組的腫瘤組織出現(xiàn)較強的熒光，其他各組的腫瘤組織熒光較弱。Image-Pro Plus軟件分析熒光強度(圖4B)，ESF+MDA-MB-231+IL-13組EGF的熒光強度與其他各組比較顯著增強(P<0.05)，MDA-MB-231+IL-13組熒光強度與MDA-MB-231組比較無顯著性差異，說明IL-13未上調(diào)MDA-MB-231組EGF的表達，IL-13的靶細胞主要是成纖維細胞并能上調(diào)成纖維細胞EGF的表達。我們觀察到在無成纖維細胞的MDA-MB-231組EGF的表達，說明乳腺癌細胞呈現(xiàn)EGF的基礎(chǔ)表達,但IL-13對乳腺癌細胞表達EGF無顯著影響。

圖4　IL-13上調(diào)荷瘤裸鼠乳腺癌組織成纖維細胞EGF的表達Fig.4　EGF up-regulated by IL-13 in fibroblasts of breast tumor tissue of tumor-burdened nude miceNote: A.EGF figures of immunofluorescence and laser confocal microscope; B. Analysis the fluorescence intensity of EGF by Image-Pro Plus software.*.P<0.05;#.P>0.05.

圖5　IL-13促進與ESF細胞共培養(yǎng)的MDA-MB-231細胞的增殖Fig.5　IL-13 promotes proliferation of MDA-MB-231 cells co-cultured with ESF cellsNote: 1-5.Indicated the days of cell culture，*.P<0.05；#.P>0.05.

Group1d3d5d7d9dESF+MDA-MB-231+IL-13131.67±7.07157.25±10.23173.78±13.54234.56±15.14355.76±18.211)ESF+MDA-MB-231132.50±8.12156.83±9.06173.97±12.87233.81±14.94284.23±17.55Group11d13d15d17d19d21dESF+MDA-MB-231+IL-13489.13±21.011)631.09±24.651)791.13±31.611)989.54±35.331)1202.67±40.781)1428.32±43.671)ESF+MDA-MB-231377.67±19.31499.78±21.53598.96±23.78713.23±25.67825.44±29.77961.35±34.77

Note：Compared with ESF+MDA-MB-231，1)P<0.05.

2.5 IL-13促進乳腺癌細胞增殖和乳腺癌生長圖5為體外培養(yǎng)的MDA-MB-231細胞增殖實驗結(jié)果,第1天各組MDA-MB-231細胞的增殖無顯著差異(P>0.05)，第2天至第5天ESF+MDA-MB-231+IL-13共培養(yǎng)組的MDA-MB-231細胞增殖與各組比較細胞增殖速度顯著增快(P<0.05)，ESF+MDA-MB-231共培養(yǎng)組的MDA-MB-231細胞增殖與單獨培養(yǎng)的MDA-MB-231+IL-13組和MDA-MB-231組比較增殖速度顯著增快(P<0.05),表明IL-13可促進與成纖維細胞共培養(yǎng)的乳腺癌細胞增殖，共培養(yǎng)組乳腺癌細胞的增殖速度要高于單獨培養(yǎng)的乳腺癌細胞。表1為測量荷瘤裸鼠移植瘤體積的實驗結(jié)果，IL-13干預(yù)的第1天至第7天ESF+MDA-MB-231+IL-13組的移植瘤體積與ESF+MDA-MB-231組比較無顯著差異(P>0.05)，IL-13干預(yù)的第9天至第21天ESF+MDA-MB-231+IL-13組的移植瘤體積顯著大于ESF+MDA-MB-231組(P<0.05)。

3　討論

IL-13是Th2細胞因子，參與纖維化、過敏性疾病、炎癥和腫瘤的發(fā)生發(fā)展，腫瘤在發(fā)展過程中常常伴有Th2細胞因子相關(guān)的纖維化和炎癥[3]，人乳腺癌基質(zhì)微環(huán)境可呈現(xiàn)與IL-13相關(guān)的炎癥和纖維化，這將促進乳腺癌的發(fā)展[8]。IL-13介導(dǎo)的乳腺基質(zhì)成纖維細胞的異常活性將導(dǎo)致乳腺上皮細胞的惡性選擇[6,9,10]，成纖維細胞是基質(zhì)微環(huán)境中的主要細胞，參與基質(zhì)的形成，在基質(zhì)的構(gòu)建中起著重要的作用，成纖維細胞的功能異常會改變基質(zhì)的正常組成成分，增加基質(zhì)非正常組成成分[11]。IL-13異常增高介導(dǎo)的免疫失衡可能是成纖維細胞功能異常的主要原因之一，功能異?；钴S的成纖維細胞通過分泌大量生長因子和基質(zhì)成分等引起的基質(zhì)炎癥、纖維化等病理變化是細胞惡性選擇的主要原因之一[12]。

在本研究中，我們建立了體外人乳腺癌細胞與人成纖維細胞共培養(yǎng)模型，研究了IL-13對體外共培養(yǎng)的成纖維細胞表達SDF-1和EGF的影響。建立了人乳腺癌細胞與人成纖維細胞共生長的荷瘤裸鼠模型， 用IL-13對荷瘤裸鼠進行干預(yù)，檢測IL-13對荷瘤裸鼠乳腺癌組織表達SDF-1和EGF的影響?？紤]到荷瘤裸鼠體內(nèi)乳腺癌細胞與成纖維細胞共生長的腫瘤組織用組織塊分離的方法將會導(dǎo)致一些細胞結(jié)構(gòu)破壞和細胞成分的喪失，影響對SDF-1和EGF 的檢測，因此我們主要采取原位的檢測方法。

我們的體外實驗結(jié)果顯示，IL-13可上調(diào)與人乳腺癌細胞共培養(yǎng)的人成纖維細胞SDF-1和EGF的表達， mRNA的檢測結(jié)果和蛋白表達的實驗結(jié)果相互印證。我們的體內(nèi)實驗結(jié)果顯示，用IL-13進行荷瘤裸鼠體內(nèi)干預(yù)能上調(diào)荷瘤裸鼠乳腺癌組織成纖維細胞SDF-1和EGF的表達。這些結(jié)果表明，IL-13靶向成纖維細胞，通過上調(diào)成纖維細胞SDF-1和EGF的表達來作用于乳腺癌細胞。

SDF-1主要由基質(zhì)細胞分泌，也稱CXCL12 ，是CXC 家族的主要成員[13]。 SDF-1能誘導(dǎo)細胞遷移、激活中性粒細胞并參與炎癥反應(yīng)。有研究表明SDF-1表達上調(diào)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移相關(guān)[14,15]，SDF-1可直接作用腫瘤細胞促進腫瘤的生長，或募集內(nèi)皮前祖細胞誘導(dǎo)腫瘤血管生成從而使腫瘤生長[16,17]。我們的研究顯示，IL-13上調(diào)了成纖維細胞SDF-1的表達，表明IL-13是SDF-1的上游激活子，是SDF-1的正調(diào)控因子，乳腺癌細胞與成纖維細胞共培養(yǎng)能增強IL-13對SDF-1的上調(diào)作用，說明這種共培養(yǎng)的微環(huán)境有助于IL-13上調(diào)SDF-1。體內(nèi)實驗結(jié)果顯示用IL-13干預(yù)荷瘤裸鼠移植瘤，ESF+MDA-MB-231+IL-13組SDF-1的表達顯著高于ESF+MDA-MB-231組，我們觀察到荷瘤裸鼠MDA-MB-231+IL-13組和MDA-MB-231組未見SDF-1明顯表達，表明IL-13主要是靶向荷瘤裸鼠腫瘤組織中的成纖維細胞。

EGF能刺激上皮細胞運動和成纖維細胞的遷移、參與上皮的形成和傷口的愈合。過度表達EGF可刺激細胞增殖以及腫瘤的形成[18-20]。本研究的結(jié)果顯示IL-13上調(diào)成纖維細胞EGF的表達，說明EGF參與IL-13的信號通路，IL-13是EGF的上游分子，乳腺癌細胞與成纖維細胞共培養(yǎng)能增強IL-13對EGF的上調(diào)作用，表明腫瘤微環(huán)境對IL-13的功能發(fā)揮具有協(xié)同作用。我們觀察到荷瘤裸鼠無成纖維細胞的MDA-MB-231組呈現(xiàn)EGF的基礎(chǔ)表達，對該組進行IL-13干預(yù)，未見MDA-MB-231組EGF表達顯著上調(diào)，說明乳腺癌細胞表達EGF,但IL-13對乳腺癌細胞表達EGF無顯著影響，IL-13主要是靶向腫瘤基質(zhì)成纖維細胞。

本研究的體外乳腺癌細胞增殖實驗及荷瘤裸鼠腫瘤體積的測量，均顯示IL-13能促進乳腺癌細胞的增殖和腫瘤體積的增大。我們的研究提示IL-13通過上調(diào)SDF-1和EGF來促進乳腺癌的發(fā)展。

綜上所述，IL-13靶向體外與乳腺癌細胞共培養(yǎng)的成纖維細胞，上調(diào)了成纖維細胞SDF-1和EGF的表達，并促進了乳腺癌細胞的增殖；對于乳腺癌細胞與成纖維細胞共生長的荷瘤裸鼠的腫瘤組織，IL-13的干預(yù)導(dǎo)致了腫瘤組織成纖維細胞SDF-1和EFG的表達上調(diào)，并促進荷瘤裸鼠腫瘤體積增大；這些結(jié)果提供了IL-13對乳腺癌作用機制的新資料，并提示IL-13的信號通路涉及SDF-1和EGF。IL-13/SDF-1和IL-13/EGF信號通路的其他相關(guān)分子還需進一步研究。

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[收稿2015-12-29]

(編輯倪鵬)

Effects of IL-13 on SDF-1 and EGF expression in fibroblasts co-cultured with breast cancer cells

SHI Xiao-Yu,CHEN Shao-Fen,GU Hua-Ping,LU Hui，LI Wen-Lin.

Basic Medical School,Medical College of Nanchang University,Nanchang 330006,China

Objective:The effects of IL-13(Interleukin-13) on SDF-1(Stromal cell derived factor 1) and EGF(Epidermal growth factor) expression in fibroblasts co-cultured with breast cancer cells were investigated to explore the mechanism for IL-13 in the development of breast cancer.Methods: The co-culture of human breast cancer cell line MDA-MB-231 with the human skin fibroblast line CCC-ESF-1 (ESF) was used in vitro and in tumor-burdened nude mice.The effects of IL-13 on SDF-1 and EGF expression in the co-cultured fibroblasts in vitro were analyzed using reverse transcription quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR),flow cytometry and Western blot assay.The proliferation of the co-cultured human breast cancer cells in vitro was detected by Cell counting kit-8(CCK-8).The effects of IL-13 on SDF-1 and EGF expression in the fibroblasts of tumor tissue of tumor-burdened nude mice were analyzed using immunofluorescence and laser confocal microscope,and the tumor volumes were examined.Results: IL-13 could up-regulate SDF-1 and EGF expression in the fibroblasts co-cultured with breast cancer cells in vitro,and promoted the proliferation of the co-cultured breast cancer cells.In tumor-burdened nude mice,IL-13 enhanced SDF-1 and EGF expression of fibroblasts in tumor tissue,and accelerated tumor growth.Conclusion: IL-13 up-regulates SDF-1 and EGF expression of fibroblasts co-cultured with breast cancer cells.The molecular mechanism of promoting effect of IL-13 on breast cancer relates to SDF-1 and EGF of fibroblasts in breast cancer stroma.

Interleukin-13;Fibroblast;Breast tumor;SDF-1;EGF

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.09.013

，E-mail:liwenlin999@sina.com。

石小玉(1955年-)，女，碩士，教授，主要從事腫瘤免疫學(xué)研究，E-mail：shixiaoyu999@163.com。

R392.12

A

1000-484X(2016)09-1303-06

①本文為國家自然科學(xué)基金重大研究計劃培育項目(No.91229118)。

②南昌大學(xué)江西省醫(yī)學(xué)生物高技術(shù)重點實驗室，南昌 330006。