鄭源強(qiáng)　于玖軒　韓新榮　石艷春

(內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)自治區(qū)分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，呼和浩特010058)

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·基礎(chǔ)免疫學(xué)·

固有免疫功能相關(guān)的microRNAs在布魯氏菌病患者中的表達(dá)情況①

鄭源強(qiáng)于玖軒韓新榮②石艷春

(內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)自治區(qū)分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，呼和浩特010058)

目的：研究與固有免疫相關(guān)的14種microRNAs在布病患者中的表達(dá)情況。方法：采用實(shí)時(shí)定量PCR方法，測(cè)定布病患者和健康志愿者血清中microRNAs的表達(dá)水平。結(jié)果：在檢測(cè)的14種microRNAs中，13種在布病患者中表達(dá)下調(diào)，其中布病患者和健康志愿者之間的Ct值差異>1的microRNAs共有9種，并且miR-122、miR-145a、miR-155、miR-301a和miR-146a這5種microRNAs在布病患者血清中的表達(dá)水平明顯降低(P<0.01)。結(jié)論：布病患者中miR-122、miR-145a、miR-155、miR-301a和miR-146a的表達(dá)被明顯抑制，在布病診斷中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

固有免疫；microRNAs；布魯氏菌病；生物診斷標(biāo)記

布魯氏菌病(簡(jiǎn)稱(chēng)布病)是一種全球廣泛流行的人畜共患病，為我國(guó)法定乙類(lèi)傳染病。布病不僅造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，而且嚴(yán)重威脅生命健康與安全，已成為一種重大公共衛(wèi)生問(wèn)題。布病患者往往缺乏典型的癥狀，臨床表現(xiàn)主要包括發(fā)熱、出汗、關(guān)節(jié)痛/關(guān)節(jié)炎、肝脾腫大、肌肉疼痛等[1]。臨床實(shí)踐中，布病容易被誤診或延遲診斷，導(dǎo)致疾病慢性化，遷延難治。核酸檢測(cè)已被證實(shí)可用于布病早期診斷，使診斷窗口前移[2]。然而，由于臨床樣本中布氏菌的濃度極低、血清抗體與細(xì)菌DNA水平之間一致性較低等問(wèn)題，難以對(duì)診斷技術(shù)和疾病預(yù)后進(jìn)行評(píng)估。因此，與宿主免疫應(yīng)答相關(guān)的新型生物標(biāo)記對(duì)布病診斷和預(yù)后判斷具有重要的價(jià)值。

microRNAs(miRNAs)是一類(lèi)約為22個(gè)核苷酸大小的非編碼單鏈RNA，對(duì)多種生物功能具有重要的調(diào)節(jié)作用[3,4]。已證實(shí)miRNAs參與病原體感染中宿主的固有免疫和獲得性免疫應(yīng)答過(guò)程[5,6]。miRNAs作為診斷或預(yù)后判斷的生物標(biāo)記已在許多類(lèi)型疾病中被證實(shí)。然而，相比于在腫瘤中已知的重要作用，miRNAs在感染性疾病尤其是細(xì)菌感染所致疾病中的作用還研究較少。布氏菌能夠利用多種機(jī)制抵御宿主固有免疫應(yīng)答，從而有利于布氏菌在宿主內(nèi)長(zhǎng)期存活并形成持續(xù)性慢性感染[7]。布氏菌感染是否會(huì)影響血清中與固有免疫應(yīng)答相關(guān)miRNAs的表達(dá)尚不清楚。本研究中，我們分別利用混合樣品和訓(xùn)練樣品，分析布病患者和健康志愿者中與固有免疫相關(guān)miRNAs的表達(dá)水平，探討這些miRNAs作為布病新型生物診斷標(biāo)志的可行性。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1臨床資料2015年5月～2015年6月期間在布病門(mén)診收集的布病患者全血和血清樣本。血清樣本收集后采用試管凝集試驗(yàn)(SAT)進(jìn)行抗體檢測(cè)，抗體滴度高于1∶50者診斷為布病患者。全血樣本(2 ml)于-20℃保存。健康志愿者與布病患者來(lái)自同一地區(qū)(性別和年齡均符合要求)，經(jīng)SAT檢測(cè)確認(rèn)為非布病患者。

1.1.2主要試劑RNA提取試劑盒(南京命碼生科科技有限公司產(chǎn)品)；TaqMan miRNA PCR Kit(ABI公司產(chǎn)品)；rTaq DNA Polymerase[寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品]；人工合成的人miRNAs模擬物購(gòu)自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；PCR擴(kuò)增所需引物購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司。14種與固有免疫相關(guān)的miRNAs見(jiàn)表1。

1.2方法

1.2.1樣本分組混合樣本分別由20名布病患者和20名健康志愿者樣本組成，用于篩選表達(dá)水平有差異的miRNAs。訓(xùn)練樣本包括24例布病患者樣本(陽(yáng)性樣本)和8例健康志愿者樣本(陰性樣本)。

1.2.2血漿制備及RNA提取全血樣本經(jīng)2 500 r/min離心10 min獲得血漿上清。利用RNA提取試劑盒從100 μl血漿樣本中提取總RNA。100 μl血漿樣本與300 μl無(wú)RNase水、200 μl苯酚和200 μl氯仿混勻，渦旋混勻后于室溫條件下放置15 min。混合物于12 000 r/min離心10 min后收集位于上層的水相層。加入1/10體積的3 mol/L醋酸鈉溶液和2倍體積的異戊醇。置于-20℃中1 h以沉淀總RNA。14 000 r/min離心20 min收集RNA，75%乙醇洗滌1次，室溫干燥10 min后重溶于20 μl無(wú)RNase水。

1.2.3定量RT-PCR(qRT-PCR)采用探針?lè)?，操作方法按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。為了計(jì)算目標(biāo)miRNAs的表達(dá)水平，合成了一系列已知濃度的miRNAs寡核苷酸用水稀釋后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增。目標(biāo)miRNAs的表達(dá)水平參比標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行計(jì)算。

1.2.4miRNAs的篩選與檢測(cè)首先，利用混合樣本篩選在布病患者和健康志愿者之間具有差異表達(dá)的miRNAs。然后將差異表達(dá)的miRNAs放到訓(xùn)練樣本中進(jìn)行檢測(cè)。

表114種與固有免疫相關(guān)的miRNAs

Tab.1Fourteen selected innate immunity related miRNAs

NameRelationshipwithinfectionRelationshipwithinnateimmunitySequence(5'-3')miR-122YesYesUGGAGUGUGACAAUGGUGUUUGmiR-132YesYesAACCGUGGCUUUCGAUUGUUACmiR-145aYesYesGUCCAGUUUUCCCAGGAAUCCCUmiR-146bYesYesUGAGAACUGAAUUCCAUAGGCUmiR-155YesYesUUAAUGCUAAUUGUGAUAGGGGUmiR-223YesYesCGUGUAUUUGACAAGCUGAGUUGmiR-181aNoYesAACAUUCAACGCUGUCGGUGAGUmiR-181cYesYesAACAUUCAACCUGUCGGUGAGUmiR-181dYesYesAACAUUCAUUGUUGUCGGUGGGUmiR-301aNoYesGCUCUGACUUUAUUGCACUACUmiR-27aYesYesAGGGCUUAGCUGCUUGUGAGCAmiR-29aYesYesACUGAUUUCUUUUGGUGUUCAGmiR-29b-1YesYesGCUGGUUUCAUAUGGUGGUUUAmiR-146aYesYesUGAGAACUGAAUUCCAUGGGUU

2　結(jié)果

2.1布病患者中差異表達(dá)的miRNAs篩選結(jié)果利用混合樣本進(jìn)行qRT-PCR 檢測(cè)，結(jié)果表明：Ct值差異>1的miRNAs一共有9種：miR-122、miR-145a、miR-146b、miR-155、miR-223、miR-181d、miR-301a、miR-29a和miR-146a(圖1A)。除了miR-132以外，其他13種miRNAs在陽(yáng)性樣本的Ct值均高于陰性樣品相應(yīng)的Ct值。上述13種miRNAs的Ct值變化范圍為0.5～3.6，Ct值差異>1的9種miRNAs倍數(shù)變化范圍從3.5(miR-145a)至15.3(miR-181d)(圖1B)。

2.2miR-122、miR-145a、miR-155、miR-301a和miR-146a在布病患者中表達(dá)量明顯降低為了驗(yàn)證所篩選的Ct值差異>1的9種miRNAs在布病患者中的表達(dá)是否受到抑制，采用由24個(gè)布病患者樣本和8個(gè)年齡、性別和臨床表現(xiàn)均符合要求的健康志愿者樣本組成的訓(xùn)練樣本(表2)，分別檢測(cè)這9種miRNAs的表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：miR-122、miR-155、miR-181d、miR-301a、miR-145a和miR-146a共6種miRNAs在布病患者和健康志愿者之間的表達(dá)水平差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，并且除miR-181d以外的其他5種miRNAs在兩組樣本中的表達(dá)差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，圖2)。5種miRNAs的標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖3)。

圖1　利用混合樣本篩選差異表達(dá)的miRNAsFig.1　miRNAs screening with pooled samples of patients and healthy volunteersNote: Ct value comparison (A) and fold change (B) of miRNA candidates between brucellosis patients and healthy control are shown;*.P<0.05.

表2訓(xùn)練樣本相關(guān)信息

Tab.2Demography of training panel

IndexPatients(n=24)Healthyvolunteers(n=8)PvalueSex(n,%)Female6(25%)2(25%)1AgeMean47.1740.380.116395%CI43.31-51.0229.17-51.58SATtiter(n,%)1∶508(33.33%)1∶10010(41.67%)1∶2006(25%)Symptom(n,%)Fever17(70.83%)4(50%)Fatigue10(41.67%)4(50%)Jointpain14(58.33%)3(37.5%)χ2=1.174,P=0.8824Legpain9(37.5%)4(50%)Sweat11(45.83%)3(37.5%)

圖2　9種miRNAs在布病患者和健康志愿者的表達(dá)情況比較Fig.2　Comparisons of miRNAs between brucellosis patients and healthy volunteersNote: NS.Indicates a lack of statistical significance；*.P<0.05；**.P<0.01.

圖3　5種miRNAs的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3　Standard curve of five miRNAs

3　討論

布魯氏菌病(簡(jiǎn)稱(chēng)布病)是由布氏菌感染所致的一種人畜共患傳染病，不具有典型的臨床癥狀并易形成慢性感染性疾病。目前，布病患者的精確臨床診斷面臨著許多挑戰(zhàn)。由于具有良好的穩(wěn)定性，血清或血漿中的miRNAs作為診斷的生物標(biāo)志已成為疾病診斷和預(yù)后判斷等領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[8,9]。血清miRNAs的表達(dá)水平往往與機(jī)體狀態(tài)存在密切關(guān)系，也使miRNAs有望成為精確診斷的良好標(biāo)志物。布氏菌能夠通過(guò)多種機(jī)制抑制宿主免疫應(yīng)答，使其能夠在宿主體內(nèi)長(zhǎng)期存活并形成慢性感染?；谶@些情況，我們提出了假設(shè)：與機(jī)體固有免疫功能調(diào)節(jié)相關(guān)的miRNAs在布病患者和健康人之間的表達(dá)水平可能存在差異。

在本研究中，我們采用了混合樣本篩選和訓(xùn)練樣品檢測(cè)的研究策略。首先我們選擇了14種已知且功能比較明確的，與免疫調(diào)節(jié)或者感染有關(guān)的miRNAs作為研究對(duì)象，利用混合樣本分別檢測(cè)了這些miRNAs在布病患者和健康志愿者血漿中的表達(dá)水平。有意思的是，其中13種miRNAs在布病患者樣本中表達(dá)下降。這一發(fā)現(xiàn)說(shuō)明，雖然可能存在一定的偏好，但布病患者存在許多種miRNAs的表達(dá)受到抑制。這些差異表達(dá)的miRNAs可能在布氏菌抵御宿主免疫應(yīng)答中發(fā)揮作用。利用由24名布病患者和8名健康志愿者血漿組成的訓(xùn)練樣本對(duì)篩選到的9種顯著差異表達(dá)的miRNAs進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-122、miR-145a、miR-155、miR-301a和miR-146a在布病患者中表達(dá)量明顯降低，兩組樣本之間表達(dá)差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。綜合本研究結(jié)果，布病患者血漿或血清中多種miRNAs表達(dá)受到明顯抑制，其中miR-122、miR-145a、miR-155、miR-301a和miR-146a這5種miRNAs在布病患者和健康志愿者之間的表達(dá)差異尤為明顯。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果為進(jìn)一步了解布病患者miRNAs表達(dá)水平與布氏菌感染狀況、臨床治療措施之間的關(guān)系奠定了良好的基礎(chǔ)。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外研究學(xué)者已發(fā)表了許多有關(guān)miRNAs作為生物標(biāo)志的研究報(bào)道。這些研究結(jié)果提示，miRNAs可作為疾病的分期、分級(jí)、疾病預(yù)測(cè)以及臨床干預(yù)措施監(jiān)測(cè)等生物標(biāo)志[10，11]。通過(guò)實(shí)驗(yàn)，我們初步篩選并證實(shí)了5種miRNAs在布病患者與健康對(duì)照組中表達(dá)存在顯著性差異，但這些miRNAs能否成為布病診斷和預(yù)后判斷的生物標(biāo)志尚待進(jìn)一步研究。

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[收稿2016-04-26]

(編輯倪鵬)

Expression pattern of innate immunity related microRNAs in human brucellosis

ZHENG Yuan-Qiang,YU Jiu-Xuan,HAN Xin-Rong,SHI Yan-Chun.

Inner Mongolia Key Laboratory of Molecular Biology,Inner Mongolia Medical University,Hohhot 010058,China

Objective:To investigate the expression pattern of 14 innate immunity related microRNAs (miRNAs) in brucellosis patients.Methods: By using Real time PCR assay,expression levels of 14 miRNAs in serum samples from brucellosis patients and healthy volunteers were analyzed.Results: Of the 14 miRNAs tested,13 showed decreased expression in brucellosis patients.And significant Ct differences over one were observed for nine of the miRNAs.In them,five miRNAs,including miR-122,miR-145a,miR-155,miR-301a and miR-146a levels significantly decreased in brucellosis patients (P<0.01).Conclusion: Decreased serum levels of miR-122,miR-145a,miR-155,miR-301a and miR-146a are confirmed and may serve as novel biomarkers for human brucellosis diagnosis.

Innate immunity;microRNAs;Brucellosis;Biomarker

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.09.002

鄭源強(qiáng)(1980年-)，男，在讀博士，副教授，主要從事抗感染免疫研究，E-mail: zhengyq688@163.com。

及指導(dǎo)教師：韓新榮(1957年-)，男，碩士，教授，主要從事中醫(yī)藥免疫研究。

石艷春(1958年-)，女，醫(yī)學(xué)博士，教授，主要從事抗感染免疫與疫苗研究，E-mail: ycshi5388@163.com。

R392.7

A

1000-484X(2016)09-1253-04

①本文受?chē)?guó)家“十二五”科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2014BAI13B03)、國(guó)家自然科學(xué)基金(81460248、81260457)、內(nèi)蒙古自治區(qū)科技重大專(zhuān)項(xiàng)、內(nèi)蒙古自治區(qū)自然科學(xué)基金(2013MS1138、2012MS1121、2015MS0820)、內(nèi)蒙古自治區(qū)科技計(jì)劃項(xiàng)目(20120101、20120402、20110501)、內(nèi)蒙古自治區(qū)衛(wèi)計(jì)委醫(yī)療衛(wèi)生科研計(jì)劃項(xiàng)目(201301035、2010018)、內(nèi)蒙古自治區(qū)高等學(xué)?？茖W(xué)研究項(xiàng)目(NJZY109)資助。

②內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)護(hù)理學(xué)院，呼和浩特010058。