陳雁，張勝來，姜婧，張海莉，譚敩，楊大千，張志剛*

（1.東北農業(yè)大學動物醫(yī)學學院，黑龍江哈爾濱150030；2.大慶市肇源縣畜牧獸醫(yī)局，黑龍江大慶166599）

?

葡萄籽原花青素對食源性鉛誘導的大鼠腎氧化應激的保護作用及機制

陳雁1，張勝來2，姜婧1，張海莉1，譚敩1，楊大千1，張志剛1*

（1.東北農業(yè)大學動物醫(yī)學學院，黑龍江哈爾濱150030；2.大慶市肇源縣畜牧獸醫(yī)局，黑龍江大慶166599）

為研究轉錄因子NF-E2相關因子2（Nrf2）對鉛（Pb）所致腎臟氧化應激的作用及葡萄籽原花青素（GSPE）對其的影響，40只Wistar大鼠隨機分成4組，分別為對照組、醋酸鉛組、GSPE干預組、GSPE組，處理30 d后，檢測腎臟中超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽（GSH）和谷胱甘肽s轉移酶（GST）含量，并測定大鼠腎組織的Pb含量、腎臟病理變化。Nrf2的表達等。結果表明，與醋酸鉛組相比，GSPE干預組腎臟中Nrf2的表達明顯升高，腎組織中SOD含量升高37%，GSH和GST含量分別升高34%和40%，MDA的含量降低35%。綜上所述，GSPE可以通過提高Nrf2蛋白的表達，減緩食源性Pb中毒引起的大鼠腎臟氧化損傷。

葡萄籽原花青素；醋酸鉛；大鼠；腎臟；氧化損傷；Nrf2

鉛（Pb）是飼料中主要的重金屬污染物之一，飼料是畜禽體內Pb的主要來源，常以有機和無機形式存在于飼料中，對神經系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)和泌尿系統(tǒng)等多種臟器造成損傷（Pilsner等，2009；袁建敏等，2003）。Pb主要蓄積在腎臟中，進入畜禽體內的Pb大部分經腎臟代謝（Osterloh等，1989）。Pb的腎毒性作用主要是腎小管的損傷及萎縮、腎小球的濾過障礙，以及引起腎臟的炎癥損傷（李麗和劉琳，2013；Liu等，2012）。Wang等（2009）研究認為Pb導致腎損傷的機制與自由基的產生高度相關。

轉錄因子NF-E2相關因子2（Nrf2）是一種內源性的抗氧化應激調節(jié)因子，Nrf2的活化可以促進抗氧化基因的表達，誘導Ⅱ相解毒酶的生成（Zhang等，2015；Zhu等，2015）。Rothe等（2015）認為Nrf2在機體對抗氧化、親電子以及外源性毒物損傷過程中起到決定性作用。Nrf2可以由許多方式激活，如化學物質以及食品多酚（Niture等，2014；Scapagnini等，2011）。賀淼等（2015）研究指出黃酮類物質可以抑制活性氧的產生，清除自由基。葡萄籽原花青素（GSPE）是從葡萄籽中提取的類黃酮化合物，具有清除自由基、抗氧化和抗炎等功能，能夠降低氧化應激帶來的損傷（Li等，2015；Chen等，2015）。GSPE的半數致死量高達4000 mg/kg，過量服用不會出現不良反應（國植和徐莉，1996）。GSPE對食源性Pb引起的腎臟氧化應激的保護作用及作用機制鮮見報道。

本試驗旨在研究GSPE對醋酸鉛誘導的大鼠慢性腎損傷的保護作用，及其抗氧化應激的作用機制，為將GSPE應用到動物飼料添加劑中以降低食源性Pb引起的腎損傷提供理論依據和實踐基礎。

1　材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1主要試劑GSPE，購自長沙紐藍生物制品有限公司；醋酸鉛，購自天津基準化學試劑有限公司；總蛋白（馬斯亮藍法）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽（GSH）和谷胱甘肽s轉移酶（GST）測定試劑盒，購自南京建成生物工程研究所；Nrf2抗體，購自Abcam。

1.1.2主要儀器全自動生化分析儀（CX4 Pro貝克曼庫爾特）、低溫離心機（Sigmal）、連續(xù)波長酶標儀（Bio-Tek Epoch）、恒溫水槽（上海精宏實驗設備有限公司）、熒光顯微鏡（Nikon Elipose Ti-s）、T6新世紀分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）、原子吸收分光光度計（日本島津AA-6300）。

1.1.3試驗動物健康雄性wistar大鼠40只，6～8周齡，體重（110.0±20.0）g。分籠飼養(yǎng)于標準化試驗舍內，室內溫度（23±2）℃，相對濕度45%～55%，大鼠自由飲水和采食，動物在試驗前適應性飼養(yǎng)7 d。

1.2試驗方法

1.2.1試驗分組與處理將40只wistar大鼠隨機分為4組（每組10只），分別為對照組、醋酸鉛組、GSPE干預組和GSPE組。其中對照組和GSPE組自由飲水，醋酸鉛組與GSPE干預組0.25%醋酸鉛溶液自由飲用；GSPE干預組和GSPE組每日GSPE溶液（200 mg/kg體重）灌胃，對照組和醋酸鉛組每日相同劑量蒸餾水灌胃。試驗持續(xù)30 d后，稱重，麻醉處死。剖開腹腔，腹主動脈采血，取出兩側腎臟稱重，部分腎臟置入10%中性甲醛中固定，用于組織切片的制作和免疫組化的測定；部分腎臟，稱重，剪碎，勻漿，用于抗氧化指標的測定。

1.2.2臟器指數的測定臟器指數計算公式如下：

1.2.3腎功能的檢測血清肌酐（SCr）的檢測方法：堿性苦味酸法；尿素氮（BUN）的檢測方法：尿素酶法。

1.2.4Pb含量的測定稱取適量樣品，炭化后，置于馬弗爐中，灰化數小時，冷卻后加適量鹽酸，直至干燥，冷卻，加2%硝酸煮沸，定容，混勻，測定Pb含量。測定前采用Pb單元素標準溶液制作標準曲線。

1.2.5組織病理學檢測常規(guī)制備石蠟切片（5μm），HE染色，應用光鏡觀察腎臟組織結構形態(tài)。

1.2.6抗氧化指標的檢測SOD活性測定：黃嘌呤氧化酶法；GSH活性測定：改良DTNB直接法；MDA含量：硫代巴比妥法；GST活性測定：GSH與1-氯-2，4-二硝基苯結合產物間接測定；總蛋白含量的測定：考馬斯亮藍法；操作嚴格按照試劑盒說明書操作。

1.2.7免疫組化試驗10%甲醛固定組織，制成切片。切片常規(guī)脫蠟，經0.01 mol/L枸櫞酸鹽緩沖液（pH 6.0）處理，5%BSA，37℃孵育20 min。加Nrf2一抗（1∶400），4℃過夜。漂洗后滴加二抗（1∶1000）。漂洗，DAB顯色，蘇木素復染。DAB染色呈棕褐色，根據染色的范圍和強度進行半定量評分。

1.2.8統(tǒng)計學分析采用“平均數±標準差”方法對結果進行表述，利用SPSS 17.0中的方差分析法比較組間差異。

2　結果與分析

2.1GSPE拮抗Pb引起的臟器指數升高由圖1可知，醋酸鉛組與對照組相比，臟器指數升高約1倍（P＜0.05）；和醋酸鉛組比較，GSPE干預組腎臟的臟器指數降低21%（P＜0.05）。

圖1　大鼠腎臟指數比較

2.2GSPE可修復腎臟功能并降低Pb在腎臟中的蓄積由表1可知，與對照組相比，醋酸鉛組SCr和BUN水平分別提高18.15%和140.85%（P＜0.05）；與醋酸鉛組比較，GSPE干預組SCr和BUN水平分別降低9.07%和31.36%（P＜0.05）；醋酸鉛組腎臟Pb含量較對照組提高314.64%（P＜0.05），GSPE干預組腎臟中Pb蓄積量與醋酸鉛組相比降低32.92%（P＜0.05）。

表1　大鼠SCr和BUN水平及腎臟中Pb含量的比較（n=10）

2.3GSPE改善Pb誘導的病理損傷對照組和GSPE組小鼠腎臟組織結構清晰，腎小球及腎小管結構無異常；醋酸鉛組與對照組相比，腎臟充血，部分腎小球出現萎縮，近曲小管濁腫、管腔狹窄，空泡變性，腎小管管形崩解，可見炎性細胞浸潤嚴重；GSPE干預組部分腎小管上皮細胞排列較紊亂，腎小球萎縮，間質充血不明顯，但與醋酸鉛組比較，病變明顯減輕。

2.4GSPE緩解腎臟氧化應激由表2可知，醋酸鉛組MDA含量明顯高于其他三組（P＜0.05），與醋酸鉛組相比，GSPE干預組MDA水平降低35%（P＜0.05）。醋酸鉛組SOD水平低于其他三組，GSPE干預組SOD水平與醋酸鉛組相比升高37%（P＜0.05）。醋酸鉛組GSH和GST水平略高于對照組（P＞0.05），但與醋酸鉛組相比，GSPE組GSH和GST水平分別升高34%和40%（P＜0.05）。

表2　各組大鼠腎臟抗氧化指標的比較（n=10）

2.5GSPE上調Nrf2的表達通過腎臟組織Nrf2免疫組化結果可知，GSPE組腎臟Nrf2的表達量比對照組高，GSPE干預組腎臟中Nrf2的表達量明顯比醋酸鉛組高。

3　討論

腎臟是Pb毒性的主要靶器官。腎臟損傷時，其排泄功能降低，SCr和BUN則在體內蓄積，從而引起SCr和BUN水平升高（Beier等，2011）。本研究結果顯示，與醋酸鉛組相比，GSPE干預組SCr和BUN水平明顯降低，此外，組織病理學結果顯示，較之醋酸鉛組，GSPE干預組的腎小球和腎小管的損傷程度明顯降低，表明GSPE可降低醋酸鉛誘導的腎臟損傷。Ahmed等（2011）的研究中發(fā)現，Pb可以在腎臟中蓄積，并使腎臟臟器指數升高。在本試驗中，GSPE干預組腎臟臟器指數和腎臟中Pb的含量明顯低于醋酸鉛組，表明GSPE可以降低腎臟中Pb的蓄積。

Pb進入組織后可誘導自由基產生，進而引起脂質過氧化的發(fā)生（Ruas等，2008）。SOD和MDA是抗氧化的重要指標，其中SOD的產生標志著機體抵御自由基損害和保護細胞氧化損傷，MDA含量可體現脂質過氧化損傷的程度（Wang和Wang，2011）。Wahab等（2015）研究認為Pb暴露可造成組織器官中SOD水平的降低和MDA水平的升高。Adonaylo和Oteiza（1999）試驗指出，與對照組動物相比較，慢性Pb中毒的試驗動物，GSH和GST活性略有升高。在本研究結果中，大鼠經口染Pb后與對照組相比，腎臟中GSH和GST的活性略有升高，這可能與機體受到低劑量Pb刺激后，抗氧化能力表現為暫時性的代償性增強有關系，也可能是Pb抑制了GSH向蛋白質轉化（Patra等，2001）。但Pb中毒大鼠腎組織SOD活性顯著降低，并且MDA的含量顯著升高，說明食源性Pb已經引起機體的氧化應激。

本試驗結果表明，與醋酸鉛組相比，GSPE干預組腎臟中Nrf2的表達量明顯提高。Nrf2是重要的抗氧化轉錄因子，其活化后可進入細胞核，激活SOD、GSH和GST等Ⅱ相解毒酶的表達，參與調節(jié)組織細胞抗氧化反應和氧化還原的調節(jié)，促進抗氧化基因的表達（Kobayashi和Yamamoto，2014）。Thomas等（2007）提出Keap1-Nrf2-ARE通路在細胞生存中起到重要作用。Nrf2的激活可以通過多種方式，Niture等（2014）發(fā)現，口服GSPE可以激活Nrf2-ARE通路。綜上所述，GSPE改善Pb中毒導致的腎氧化損傷的機理包括：（1）GSPE可以修復腎功能和組織損傷，促進腎臟的排泄功能的修復。（2）GSPE能促進Pb在體內的代謝。（3）GSPE是很強的生物抗氧化劑，具有清除氧自由基的能力，促進腎臟中Nrf2蛋白的表達，提高腎組織中GSH、GST和SOD的含量，降低MDA的含量，達到抵抗Pb誘導的氧化損傷的目的。

4　結論

本研究結果表明，口服GSPE對大鼠食源性Pb中毒具有拮抗作用，可以降低Pb對腎臟的損傷。因此，在畜禽飼料中添加適當劑量的GSPE可降低食源性Pb的腎毒性作用，以保障動物源性食品安全。

［1］國植，徐莉.原花青素：具有廣闊發(fā)展前景的植物藥［J］.國外醫(yī)藥：植物藥分冊，1996，11（5）：196.

［2］賀淼，黃鑫，李彪，等.自由基清除物質的研究進展［J］.中國飼料，2015，1：41～44.

［3］李麗，劉琳.慢性鉛中毒致間質性腎炎1例報告［J］.吉林醫(yī)學，2013，34（17）：3515～3518.

［4］袁建敏，咼于明，聶偉，等.飼料中鉛的測定改進［J］.中國飼料，2003，19：29～32.

［5］Adonaylo V N，Oteiza P I.Lead intoxication：antioxidant defenses and oxidative damage in rat brain［J］.Toxicology，1999，135：77～85.

［6］Ahmed E，Abdel M，Mohamed A，et al.The protective effect of flaxseed oil on lead acetate-induced renal toxicity in rats［J］.J Hazard Mater，2011，194，250～255.

［7］Beier K，Eppanapally S，Bazick H S，et al.Elevation of blood urea nitrogen is predictive of long-term mortality in critically ill patients independent of“normal”creatinine［J］.Crit Care Med，2011，39（2）：305～313.

［8］Chen S Z，Zhu Y F，Liu Z F，et al.Grape seed proanthocyanidin extract ameliorates diabetic bladder dysfunction via the activation of the Nrf2 pathway［J］.Plos One，2015，10（5）：1～16.

［9］Kobayashi M，Yamamoto M.Molecular mechanisms activating the Nrf2-Keap1 pathway of antioxidant gene regulation［J］.Antioxid Redox Signal，2005，7：385～394.

［10］Li S G，Ding Y S，Niu Q，et al.Grape seed proanthocyanidin extract alleviates arsenic-induced oxidative reproductive toxicity in male mice［J］.Biomed Environ Sci，2015，28（4）：272～280.

［11］Liu C M，Ma J Q，Sun Y Z.Puerarin protects rat kidney from lead-induced apoptosis by modulating the PI3K/Akt/eNOS pathway［J］.Toxicol Appl Pharmacol，2012，258（3）：330～342.

［12］Niture S K，Khatri R，Jaiswal A K.Regulation of Nrf2-an update［J］.Free Radic Biol Med，2014，66：36～44.

［13］Niture S K，Khatri R，Jaiswal A K.Regulation of Nrf2-an update［J］.Free Radic Biol Med，2014，66：36～44.

［14］Osterloh J D，Selby J V，Bernard B P，et al.Body burdens of lead in hypertensive nephropathy［J］.Arch Environ Health，1989，44（5）：304～310.

［15］Patra R C，Swarup D，Dwivedi S K.Antioxidant effects of α tocopherol，ascorbic acid and l-methionine on lead induced oxidative stress to the liver，kidney and brain in rats［J］.Toxicology，2001，162（2）：81～88.

［16］Pilsner J R，Hu H，Ettinger A，et al.Influence of prenatal lead exposure on genomic methylation of cord blood DNA［J］.Environmental Health Perspectives，2009，117（9）：1466～1471.

［17］Rothe T，Gruber F，Uderhardt S，et al.12/15-lipoxygenase-mediated enzymatic lipid oxidation regulates DC maturation and function［J］.Journal of Clinical Investigation，2015，125（5）：1944～1954.［18］Ruas C B，Carvalho C D，De Araujo H S，et al.Oxidative stress biomarkers of exposure in the blood of cichlid species from a metal-contaminated river［J］.Ecotoxicology and Environmental Safety，2008，71（1）：86～93.

［19］Scapagnini G，Vasto S，Abraham N G，et al.Modulation of Nrf2/ARE pathway by food polyphenols：a nutritional neuroprotective strategy for cognitive and neurodegenerative disorders［J］.Neurobiol，2011，44：192～201.

［20］Thomas W，Kensler N W，Shyam B.Cell survival responses to environmental stresses via the Keap1-Nrf2-ARE pathway［J］.Cell，2007，47：89～116.

［21］Wahab I A，Habeeb B S，Maymunah O Z.Honey prevents neurobehavioural deficit and oxidative stress induced by lead acetate exposure in male wistar rats-a preliminary study［J］.Metabolic Brain Disease.2015，5：1～8.

［22］Wang L，Wang H，Hu M，et al.Oxidative stress and apoptotic changes in primary cultures of rat proximal tubular cells exposed to lead［J］.Arch Toxicol，2009，83（5）：417～427.

［23］Wang Y，Wang S Q.Effects of lead exposure on histological structure and antioxidant capacity in the cerebellum of 30-day-old mice［J］.Neural regeneration，2011，14（6）：1077～1081.

［24］Zhang X S，Ha S，Wang X L，et al.Tanshinone IIA protects dopaminergic neurons against 6-OHDA induced neurotoxicity through miR-153/Nrf2/ ARE signaling pathway［J］.Neuroscience，2015，303：489～502.

［25］Zhu C，Wang S，Wang B，et al.17β-Estradiol Up-Regulates Nrf2 via Pi3k/Akt and Estrogen Receptor Signaling Pathways to Suppress Light-Induced Degeneration in Rat Retina［J］.Neuroscience，2015，304：328～339.

招聘

坤達包裝始創(chuàng)于2003年，是一家多元化的現代企業(yè)。公司現擁有浙江坤達、江西坤達等四家分公司，員工800多人，年產值創(chuàng)5億元，公司引進國內先進的塑編、印刷高新設備，專注產品質量和技術，提高供應鏈運轉效率，形成了研發(fā)、設計、拉絲、編織、彩印、復合、蓋光、制袋、檢測高標準的生產體系。公司擁有白色、黃色、紅色、綠色、藍色等主導編織產品，廣泛應用于飼料、化工、糧油、食品等農牧行業(yè)。公司實施塑編行業(yè)ERP模式創(chuàng)新，完善產供銷一體化的經營模式，產品直接面向終端客戶。坤達致力于打造一個具有品牌價值的企業(yè)。

片區(qū)總經理

1、有較強的事業(yè)心，富有業(yè)務開拓能力；

2、具有組織、溝通、策劃、整合資源能力，執(zhí)行力強；

3、能夠獨立開發(fā)大客戶、領導所轄團隊

4、組建銷售隊伍，培訓銷售人員

5、制定銷售業(yè)績，建設銷售團隊。

區(qū)域經理

1、具有規(guī)劃意識、分析能力，思維敏捷，有較高協(xié)調能力和語言表達能力；

2、收集市場信息及需求，能夠在上級的協(xié)助下開發(fā)大客戶

3、較強的自我學習能力；

4、對工作有激情，辦事講原則，為人勤快，有上進心

浙江事業(yè)部

電話：0577-58107986傳真：0577-63572951

郵箱：196328979@qq.com聯(lián)系人：林麗力

江西事業(yè)部

電話：0796-8400258傳真：0796-8400658

郵箱：1962364732@qq.com聯(lián)系人：王靈卿

To study the effects of NF-E2-related factor 2（Nrf2）on the oxidative injury of kidney in rats exposed to lead and to observe the effects of grape seed proanthocyanidin extract（GSPE）on nephrotoxicity of lead，forty Wistar rats were divided randomly into four groups：control group，lead acetate group，GSPE intervention group and GSPE group.After 30 days，GSPE effects on superoxide dismutase（SOD），methane dicarboxylic aldehyde（MDA），glutathione（GSH）and glutathione s-transferase（GST）content in the kidney were detected，and lead concentrations，expression of Nrf2，pathologic changes of kidney tissue were determined.The results showed that：compared with lead acetate group，GSPE intervention group showed a significantly expression increase of Nrf2 in kidney，the level of SOD was increased by 37%，the levels of GSH and GST were increased by 34%and 40%respectively，the level of MDA was decreased by 35%.In conclusion，GSPE could alleviate oxidative stress damage in rat kidney by expression increase of Nrf2.

grape seed proanthocyanidin extract；lead acetate；rat；kidney；oxidative injury；Nrf2

S816.7

A

1004-3314（2016）04-0019-04

10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20160405

國家自然科學基金青年項目（31101868）；中國博士后科學基金特別資助（2010T50302）；黑龍江省普通高等學校新世紀優(yōu)秀人才計劃項目（1253-NCET-007）