馬星如，　陳穎詩(shī)，　林穎彤，　張　旭，　羅海華，　劉　超，　潘　婷

(中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院人類(lèi)病毒學(xué)研究所，廣東 廣州 510080)

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·實(shí)驗(yàn)技術(shù)·

GDF11在體外擴(kuò)增CD8+記憶干性T細(xì)胞的作用*

馬星如，陳穎詩(shī)，林穎彤，張旭，羅海華，劉超，潘婷△

(中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院人類(lèi)病毒學(xué)研究所，廣東 廣州 510080)

目的： 探討生長(zhǎng)分化因子11(GDF11)在體外誘導(dǎo)擴(kuò)增具有干細(xì)胞特性的記憶性T細(xì)胞(memory stem T cells，Tscm)中的作用，從而進(jìn)一步提高免疫過(guò)繼治療的療效。方法: 通過(guò)密度梯度離心的方法分離健康人的外周血單個(gè)核細(xì)胞，然后用磁珠分選獲得CD8+T細(xì)胞；隨后將所得的細(xì)胞分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組中加入等體積、不同濃度的GDF11，對(duì)照組中加入等體積的PBS緩沖液，最后分別在不同時(shí)點(diǎn)通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)2組細(xì)胞中Tscm的擴(kuò)增情況。結(jié)果: 在CD8+T細(xì)胞的體外擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)中，GDF11可以顯著擴(kuò)增CD8+T細(xì)胞；在CD8+T細(xì)胞的體外培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，GDF11可以顯著提高Tscm在CD8+T細(xì)胞中的比例。結(jié)論: GDF11可以有效地在體外擴(kuò)增CD8+Tscm，為提高免疫過(guò)繼治療的效率提供了新的方法。

生長(zhǎng)分化因子11； CD8+記憶干性T細(xì)胞； 過(guò)繼免疫治療

過(guò)繼性細(xì)胞治療是一種新興的、具有顯著療效的自身免疫細(xì)胞治療方法[1-2]。 它是運(yùn)用生物技術(shù)或者生物制劑對(duì)病人體內(nèi)采集的免疫細(xì)胞進(jìn)行體外擴(kuò)增培養(yǎng)后回輸?shù)讲∪梭w內(nèi)，使其能夠激發(fā)和增強(qiáng)機(jī)體自身免疫功能，從而達(dá)到細(xì)胞治療的目的。隨著近年來(lái)對(duì)免疫系統(tǒng)認(rèn)識(shí)的逐步加深，研究人員已經(jīng)逐步將免疫細(xì)胞的過(guò)繼治療應(yīng)用于多種腫瘤以及慢性病毒感染性疾病如艾滋病等領(lǐng)域[3-4]。

記憶干性T細(xì)胞(memory stem T cells,Tscm)是美國(guó)賓夕法尼亞大學(xué)醫(yī)學(xué)院Emerson教授的課題組在2005年首次在小鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)并報(bào)道的[5]。這群細(xì)胞作為一種具有自我更新能力和多能性潛力的T細(xì)胞亞群，在諸多的免疫性疾病中都發(fā)揮著重要的作用。直到2011年，Nicholas教授的課題組在人的外周血細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)了這么一群干細(xì)胞樣的Tscm細(xì)胞[6]。人Tscm細(xì)胞表面主要為CD45RA+CD62LhighCCR7highCD122highCD95high，在遇到抗原的時(shí)候可以迅速地產(chǎn)生免疫應(yīng)答[7]。Tscm細(xì)胞一方面可分泌具有殺傷能力的細(xì)胞因子，如IFN-γ、TNF-α、granzyme B等；另一方面，在遇到抗原刺激時(shí)還可迅速分化成為效應(yīng)T細(xì)胞，中央記憶性T細(xì)胞以及效應(yīng)記憶性T細(xì)胞，發(fā)揮其快速免疫應(yīng)答的功能[6]。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，感染猿猴免疫缺陷病毒(simian immunodeficiency virus，SIV)的恒河猴體內(nèi)以及HIV-1患者體內(nèi)都存在一定比例的CD8+Tscm細(xì)胞，這一研究成果為HIV-1的免疫細(xì)胞治療提供了新的思路[8-9]。因此，除了探索中央記憶性T細(xì)胞 (central memory T cells，Tcm) 和效應(yīng)記憶性T細(xì)胞 (effective memory T cells，Tem)的體外擴(kuò)增之外，人們還可以進(jìn)一步探索如何利用體外擴(kuò)增Tscm細(xì)胞來(lái)作為新的過(guò)繼免疫治療策略。

由于Tscm細(xì)胞在人體中的比例非常低，同時(shí)又具有極為重要的免疫調(diào)控作用，因此，探索如何能夠誘導(dǎo)這種細(xì)胞快速擴(kuò)增的方法就變得尤為重要和迫切。作為細(xì)胞生長(zhǎng)分化因子的一種，生長(zhǎng)分化因子11(growth differentiation factor 11，GDF11)在早前的研究中被發(fā)現(xiàn)能夠使神經(jīng)干細(xì)胞加速生長(zhǎng)分化，并且能夠顯著改善衰老小鼠的心臟功能[10-11]。 基于GDF11在神經(jīng)干細(xì)胞以及其它干細(xì)胞生長(zhǎng)分化方面的重要作用，本研究試圖探索GDF11在體外是否可誘導(dǎo)人CD8+Tscm細(xì)胞的擴(kuò)增，并檢測(cè)其在Tscm細(xì)胞誘導(dǎo)分化中的作用。

材　料　和　方　法

1材料

健康人的外周成分血由廣州市血液中心提供。

2主要試劑和儀器

人外周血淋巴細(xì)胞分離液 (天津市灝洋生物制品科技有限公司);Human CD8 T Lympohocyte Enrichment Set - DM (BD Biosciences);RPMI-1640 (Gibco);流式細(xì)胞術(shù)用抗體包括 human CD3-FITC、human CD8-APC、human CD8-Pacific blue、human CD45RA-PE-Texas red、human CD45-RO-PerCP-Cy5.5、human CD62L-PE-Cy7、human CCR7-Alexa Fluor 700、human CD95-APC和human CD122-PE均購(gòu)自BD Pharmingen。

生物安全柜、細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo)；離心機(jī)(Eppendorf)；光學(xué)倒置生物顯微鏡(Leica)；分析型流式細(xì)胞儀(BD)；細(xì)胞磁珠分選磁力架(BD Biosciences)；血球計(jì)數(shù)板 (上海市求精生化試劑儀器有限公 司)； 20 mL注射器 (北京頗賽科技發(fā)展有公司)。

3主要方法

3.1人外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)的分離在50 mL離心管中加入約10 mL抗凝人外周成分血，再加入約40 mL PBS (含2% BSA和0.5% EDTA) 稀釋血液?；靹蚝蟀严♂尯蟮难N壁緩緩加入已裝有25 mL人外周淋巴細(xì)胞分離液的50 mL離心管中，加滿50 mL離心管為止。注意加入血液時(shí)必須保證血液浮于分離液之上。1 500 r/min離心45 min。 離心后，小心用滴管吸出懸于液體中間部位的單個(gè)核細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至15 mL離心管中，加入5倍體積的PBS緩沖液。300×g離心10 min ，并重復(fù)上一步驟1次。

3.2CD8+T細(xì)胞的分離向得到的PBMCs中加入CD8+T細(xì)胞陰選試劑盒中的 I 抗[為biotin連接的多種單抗混合物，包括：Anti-human CD4, clone L200；Anti-human CD11b/Mac-1 (CR3), clone ICRF44；Anti-human CD16, clone 3G8；Anti-human CD19, clone HIB19；Anti-human CD36, clone CB38 (NL07)；Anti-human CD41a, clone HIP8；Anti-human CD56, clone B159；Anti-human CD123 (IL-3 Receptor α chain), clone 9F5；Anti-human CD235a (Glycophorin A), clone GA-R2 (HIR2)；Anti-human γδ TCR, clone B1]，靜置孵育15 min讓細(xì)胞與抗體充分結(jié)合。300×g離心10 min。加入CD8+T細(xì)胞陰選試劑盒中的磁珠 II 抗(BD IMag Streptavidin Particles Plus - DM)孵育30 min；隨后進(jìn)行過(guò)柱細(xì)胞分選，得到純化的CD8+T細(xì)胞。

3.3CD8+T細(xì)胞的培養(yǎng)將純化的CD8+T細(xì)胞重新懸浮于含10%胎牛血清的RPMI-1640中，細(xì)胞計(jì)數(shù)后，按照每孔1×106的細(xì)胞數(shù)培養(yǎng)在預(yù)處理的48孔板中。將48孔板置于5% CO2、飽和濕度的37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

3.4CD8+T細(xì)胞的激活用人anti-CD3(0.5 mg/L)的抗體提前處理48孔細(xì)胞培養(yǎng)板4 ℃靜置過(guò)夜，第2天吸去anti-CD3抗體并用PBS清洗細(xì)胞培養(yǎng)板。隨后將CD8+T細(xì)胞鋪于孔板中。每孔加入anti-CD3(1 mg/L)、anti-CD28(1 mg/L)和IL-2(10 μg/L)培養(yǎng)48 h，激活CD8+T細(xì)胞。

3.5GDF11因子的添加將已激活的CD8+T細(xì)胞分成實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組分別加入相同體積不同濃度的GDF11(100、200、400 μg/L)，對(duì)照組加入等體積的PBS。每隔2 d需要換1次液，同時(shí)補(bǔ)充加入anti-CD3(1 mg/L)、anti-CD28(1 mg/L)、IL-2(10 μg/L)和GDF11。

3.6細(xì)胞亞群的檢測(cè)和分析在細(xì)胞培養(yǎng)的第0、1、2、3、4周，分別收取細(xì)胞標(biāo)記抗體(human CD8-Pacific blue、human CD45RA-PE-Texas red、human CD45-RO-percp-cy5.5、human CD62L-PE-Cy7、human CCR7-Alexa Fluor 700、 human CD95-APC和human CD122-PE)檢測(cè)Tscm的比例。

4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料所有結(jié)果統(tǒng)一用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。各個(gè)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組之間采用單因素方差分析進(jìn)行比較，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)　　果

1流式分析檢測(cè)Tscm細(xì)胞方法的構(gòu)建

本研究首先采用密度梯度離心的方法分選出人的PBMCs，再用磁珠法將PBMCs中的CD8陽(yáng)性T細(xì)胞分選出來(lái)。為了保證后續(xù)實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性，將磁珠分選所得的細(xì)胞用抗人CD3和CD8抗原的流式抗體通過(guò)分析型流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD8陽(yáng)性T細(xì)胞的純度，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1。磁珠法分離出來(lái)的CD8陽(yáng)性T細(xì)胞的比例為95.5%，可滿足本研究后續(xù)實(shí)驗(yàn)的需求。

Figure 1.The purity of human CD8+T cells. Human PBMCs were isolated by density gradient centrifugation. Among the isolated PBMCs, CD8+T cells were further purified with MACS microbeads. The human CD8+T cells were labeled with anti-human CD3-FITC and anti-human CD8-APC antibodies and the purity was examined by flow cytometry.

圖1人的CD8陽(yáng)性T細(xì)胞的純度檢測(cè)

為了后續(xù)的流式檢測(cè)方便，本研究首先構(gòu)建了一個(gè)分析檢測(cè)Tscm細(xì)胞的模板，見(jiàn)圖2。將分選出來(lái)的CD8+T細(xì)胞進(jìn)行7色的抗體標(biāo)記，抗體分別為human CD8-Pacific blue、human CD45RA-PE-Texas red、human CD45-RO-PerCP-Cy5.5、human CD62L-PE-Cy7、human CCR7-Alexa Fluor 700、human CD95-APC和human CD122-PE。在分析的過(guò)程中，采取4步法來(lái)鑒定和分析Tscm細(xì)胞。首先選定CD8+T細(xì)胞，然后在CD8+T細(xì)胞中選定CD45RO-CD45RA+的細(xì)胞亞群；進(jìn)一步再選定出CD62L+CCR7+的細(xì)胞亞群，隨后在這個(gè)亞群細(xì)胞的基礎(chǔ)上，選定CD95+CD122+雙陽(yáng)性的細(xì)胞。該群細(xì)胞就是本研究所要關(guān)注的Tscm細(xì)胞。

2檢測(cè)GDF11對(duì)CD8+Tscm細(xì)胞比例上擴(kuò)增的影響

在GDF11處理后的第 1周檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)在CD8+T細(xì)胞中，Tscm細(xì)胞的比例會(huì)隨著GDF11濃度的增加而遞增，具有一定的濃度梯度依賴(lài)性。對(duì)照組中Tscm細(xì)胞的比例為0.102%，100、200和400 μg/L GDF11處理后，Tscm細(xì)胞的比例分別為0.496%、1.02%和1.41%。

與此同時(shí)，為了進(jìn)一步優(yōu)化GDF11對(duì)Tscm細(xì)胞的體外擴(kuò)增條件，本研究選取濃度為400 μg/L的 GDF11處理CD8+T細(xì)胞，并在體外持續(xù)觀察4周。然后，分別在第0、1、2、3、4周的5個(gè)時(shí)點(diǎn)檢測(cè)Tscm細(xì)胞的比例。處理前Tscm細(xì)胞的比例為0.167%,處理第1、2、3和4周時(shí)Tscm的細(xì)胞比例分別為1.23%、3.06%、4.29%和2.52%，見(jiàn)圖3。

Figure 2.The analytic strategy of Tscm. Firstly, the CD8+T cells were gated， and then the CD45RO-CD45RA+subset of all CD8+T cells were gated. After that, the CD62L+CCR7+cells were gated. Finally, the CD95+CD122+cells were gated and referred as Tscm.

圖2Tscm細(xì)胞的分析策略

這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，GDF11可以在體外誘導(dǎo)CD8+Tscm細(xì)胞比例增加，并且具有一定的濃度梯度依賴(lài)性。同時(shí)，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，GDF11可以誘導(dǎo)出更多的Tscm細(xì)胞，最佳處理時(shí)間為3周。

3檢測(cè)GDF11對(duì)CD8+Tscm細(xì)胞數(shù)量上的擴(kuò)增影響

采用400 μg/L GDF11處理CD8+T細(xì)胞，分別在第0、1、2、3、4周檢測(cè)Tscm細(xì)胞比例的同時(shí)，對(duì)CD8+T細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，并計(jì)算出Tscm細(xì)胞的數(shù)量。對(duì)照組的細(xì)胞數(shù)量為實(shí)驗(yàn)起始細(xì)胞量，CD8+T細(xì)胞的數(shù)量為(1.00±0.13)×106，Tscm細(xì)胞的數(shù)量為 126±26；GDF11處理1周后，CD8+T細(xì)胞的數(shù)量為(4.63±0.83)×106，Tscm細(xì)胞的數(shù)量為2 521±338；GDF11處理2周后，CD8+T細(xì)胞的數(shù)量為(8.27±1.06)×106，Tscm細(xì)胞的數(shù)量為12 937±2 256；GDF11處理3周后，CD8+T細(xì)胞的數(shù)量為(13.83±1.72)×106，Tscm細(xì)胞的數(shù)量為47 259±9 835；GDF11處理4周后，CD8+T細(xì)胞的數(shù)量為(5.3±0.917)×106，Tscm細(xì)胞的數(shù)量為7 445±545，見(jiàn)圖4。

這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，GDF11可以在體外誘導(dǎo)CD8+Tscm細(xì)胞數(shù)量增加，并且隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，GDF11可以誘導(dǎo)出更多的Tscm細(xì)胞。但是，如果處理時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，即處理時(shí)間為4周的時(shí)候，細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)一定程度的死亡。因此，GDF11處理CD8+T細(xì)胞誘導(dǎo)Tscm的最佳時(shí)間為3周。

討　　論

隨著人們對(duì)T細(xì)胞認(rèn)識(shí)的加深以及T細(xì)胞在免疫系統(tǒng)中的重要作用，越來(lái)越多的研究小組嘗試運(yùn)用T細(xì)胞免疫過(guò)繼的方式來(lái)進(jìn)行腫瘤治療[12-13]。體外長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)T細(xì)胞會(huì)使其失去活力，從而導(dǎo)致直接回輸體內(nèi)的T細(xì)胞存活時(shí)間較短，無(wú)法持續(xù)發(fā)揮細(xì)胞的殺傷功能。因此，人們開(kāi)始嘗試?yán)酶鞣N方式在體外擴(kuò)增具有記憶功能的T細(xì)胞亞群。已有研究發(fā)現(xiàn)，這些具有記憶功能的T細(xì)胞亞群，如Tcm和Tem，回輸后具有明顯的治療效果并且持續(xù)時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)[14]。人的Tscm是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的新的一類(lèi)CD8+T細(xì)胞亞群，是類(lèi)似干細(xì)胞的一類(lèi)記憶細(xì)胞。這類(lèi)細(xì)胞具有快速免疫應(yīng)答的能力，在遇到抗原刺激的時(shí)候可以迅速分化成為效應(yīng)T細(xì)胞、Tcm和Tem，從而發(fā)揮其快速地免疫應(yīng)答功能，這也為研究T細(xì)胞的免疫過(guò)繼治療提供了一個(gè)新的方向和思路[15]。但是，Tscm細(xì)胞在人體中的比例極低，如何在體外快速大量地?cái)U(kuò)增這類(lèi)細(xì)胞用于過(guò)繼免疫治療，目前仍在尋找更好的解決方案。

Figure 3.The effect of GDF11 on the proportion of Tscm in CD8+T cells. Mean±SD.n=6.*P<0.05,**P<0.01vscontrol.

圖3GDF11對(duì)CD8+Tscm細(xì)胞比例的影響

Figure 4.The effect of GDF11 on the absolute number of Tscm in the CD8+T cells. The isolated CD8+T cells were treated with 400 μg/L GDF11. The absolute number of CD8+T cells (A) and Tscm (B) was calculated by cell counter at weeks 0， 1， 2， 3 and 4. Mean±SD.n=6.*P<0.05,**P<0.01vscontrol.

圖4GDF11對(duì)CD8+Tscm細(xì)胞數(shù)量的影響

本研究初步探索了體外擴(kuò)增Tscm的新方法，首次利用GDF11在體外擴(kuò)增CD8+Tscm細(xì)胞。GDF11蛋白大小約為45 kD，屬于BMP蛋白家族和TGF-β蛋白家族，在結(jié)構(gòu)上可以被水解形成一個(gè)含有7個(gè)保守的半胱氨酸殘基的成熟蛋白，主要參與調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化過(guò)程。前期的小鼠和非洲蟾蜍研究表明，GDF11蛋白參與了胚胎發(fā)育期間的中胚層形成和神經(jīng)發(fā)生。在我們的研究中發(fā)現(xiàn)，用不同濃度的GDF11處理CD8+T細(xì)胞均可以明顯地促進(jìn)Tscm細(xì)胞的形成，并且這種促進(jìn)作用具有一定的濃度梯度依賴(lài)性。與此同時(shí)，隨著CD8+T細(xì)胞數(shù)量的增加，相應(yīng)的Tscm細(xì)胞數(shù)量也隨之顯著地增加，并在培養(yǎng)的第3周達(dá)到增殖的高峰期。然而，由于細(xì)胞的長(zhǎng)期培養(yǎng)可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞不同程度的死亡，在體外培養(yǎng)的第4周，CD8+T細(xì)胞以及Tscm細(xì)胞的數(shù)量都呈現(xiàn)出明顯的下降趨勢(shì)。因此，在GDF11處理CD8+T細(xì)胞誘導(dǎo)Tscm細(xì)胞形成的實(shí)驗(yàn)中，400 μg/L的GDF11濃度以及3周的處理?xiàng)l件，將是利用GDF11進(jìn)行體外誘導(dǎo)CD8+Tscm細(xì)胞大量擴(kuò)增的最佳實(shí)驗(yàn)組合。

綜上所述，本研究采用GDF11在體外對(duì)CD8+Tscm細(xì)胞進(jìn)行了有效地?cái)U(kuò)增，并探索建立其促進(jìn)Tscm體外擴(kuò)增的最佳實(shí)驗(yàn)方案，從而顯著提高了CD8+Tscm細(xì)胞的擴(kuò)增效率。該方法安全性較高，擴(kuò)增效率明顯，能為后續(xù)的抗病毒和抗腫瘤的T細(xì)胞過(guò)繼免疫治療的廣泛開(kāi)展提供了新的技術(shù)手段。而我們的研究也拓展了對(duì)GDF11的認(rèn)識(shí)，有必要對(duì)其對(duì)免疫系統(tǒng)的影響做進(jìn)一步的探索。

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(責(zé)任編輯： 林白霜， 羅森)

Effect of GDF11 on expansion of CD8+memory stem T cells

MA Xing-ru, CHEN Ying-shi, LIN Ying-tong, ZHANG Xu, LUO Hai-hua, LIU Chao, PAN Ting

(InstituteofHumanVirology,ZhongshanSchoolofMedicine,SunYat-senUniversity,Guangzhou510080,China.E-mail:pant8@mail.sysu.edu.cn)

AIM: To investigate the effect of growth differentiation factor 11 (GDF11) on the expansion of CD8+memory stem T cells (Tscm) and to further improve the effect of adoptive immunotherapy. METHODS: Healthy human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were isolated by density gradient centrifugation at first. Among the isolated PBMCs, CD8+T cells were further purified with MACS microbeads. The CD8+T cells were then randomly divided into experimental groups and control group. The same volume of different concentrations of GDF11 were added into the experimental groups, and the same volume of PBS solution was added into the control group. Finally, the expansion of Tscm in experimental groups and control group was measured by flow cytometry at several time points. RESULTS: GDF11 significantly increased the number of Tscm in CD8+T cellsinvitroexpansion and also dramatically increased the ratio of Tscm in CD8+T cells. Furthermore, 400 μg/L GDF11 treatment for 3 weeks was the optimal condition to induce CD8+Tscm. CONCLUSION: GDF11 effectively increases the number and ratio of Tscm in the CD8+T cells in cell culture growth, thereby creating a new strategy to further improve the efficiency of adoptive immunotherapy.

Growth differentiation factor 11; CD8+memory stem T cells; Adoptive immunotherapy

1000- 4718(2016)04- 0762- 07

2015- 12- 18

2016- 02- 14

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 31500740)；廣東省引進(jìn)創(chuàng)新科研團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目(No. 2009010058)；“十二五”艾滋病和病毒性肝炎等重大傳染病防治科技重大專(zhuān)項(xiàng)基金資助項(xiàng)目(No. 2013ZX10001004)

Tel: 020-87335703; E-mail: pant8@mail.sysu.edu.cn

R329.21； R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.04.030

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