黃　林，　楊　晨，　梁　婕，　羅海華，　姜　勇，　劉愛華△

(南方醫(yī)科大學(xué) 1南方醫(yī)院呼吸內(nèi)科， 2病理生理學(xué)教研室和廣東省蛋白質(zhì)組學(xué)重點實驗室，廣東 廣州 510515)

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NF-κB介導(dǎo)MRP8/14誘導(dǎo)的人肺泡上皮A549細(xì)胞凋亡*

黃林1，楊晨1，梁婕1，羅海華2，姜勇2，劉愛華1△

(南方醫(yī)科大學(xué)1南方醫(yī)院呼吸內(nèi)科，2病理生理學(xué)教研室和廣東省蛋白質(zhì)組學(xué)重點實驗室，廣東 廣州 510515)

目的： 探討髓樣相關(guān)蛋白8/14(MRP8/14)對人肺泡上皮A549細(xì)胞存活及凋亡的影響，并研究核因子κB(NF-κB)在其中的作用。方法：MRP8/14以不同劑量或刺激時間處理A549細(xì)胞，CCK-8法檢測其對細(xì)胞活力的影響；流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率；Western blot法及間接免疫熒光法檢測A549細(xì)胞內(nèi)NF-κB p65蛋白核移位情況；Western blot法檢測NF-κB p65蛋白磷酸化水平；使用NF-κB特異性抑制劑Bay 11-7082探討NF-κB在凋亡過程中的作用。結(jié)果：MRP8/14能以劑量和時間依賴的方式影響A549細(xì)胞的存活(P<0.05)，流式細(xì)胞技術(shù)檢測結(jié)果表明MRP8/14處理后A549細(xì)胞凋亡率明顯增加(P<0.01)。此外，MRP8/14能夠誘導(dǎo)NF-κB p65蛋白發(fā)生顯著磷酸化，并移位至細(xì)胞核中，NF-κB信號通路明顯激活，而NF-κB特異性抑制劑Bay 11-7082能夠明顯抑制MRP8/14誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡(P<0.01)。結(jié)論：NF-κB 在MRP8/14所導(dǎo)致的肺泡上皮細(xì)胞凋亡過程發(fā)揮了重要作用。

急性肺損傷； 細(xì)胞凋亡； 髓樣相關(guān)蛋白8/14； 肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞； 核因子κB

急性肺損傷(acute lung injury，ALI)是由多種病因引起的肺上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)功能異常，通過炎癥介質(zhì)導(dǎo)致的肺表面活性物質(zhì)降低、肺水腫、肺膨脹不全。ALI是常見的呼吸系統(tǒng)疾病，主要臨床表現(xiàn)為嚴(yán)重的呼吸困難，其發(fā)生率和病死率均較高[1]。ALI最常見的原因是由細(xì)菌感染引起的膿毒血癥[2-3]。

研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞凋亡在ALI的發(fā)生發(fā)展中扮演了重要的角色，ALI病人的肺組織及血清中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)量明顯升高，并與臨床預(yù)后密切相關(guān)[4- 5]。此外，核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)與細(xì)胞凋亡密切相關(guān),抑制NF-κB的活化可以明顯阻止ALI及其它疾病中細(xì)胞凋亡的發(fā)生[6-7]。髓樣相關(guān)蛋白8/14(myeloid-related protein 8/14，MRP8/14)為S100蛋白家族成員，能夠激活NF-κB信號通路，廣泛參與了炎癥相關(guān)疾病[8]，肺部感染病人的肺泡灌洗液及血清中MRP8/14都有明顯升高[9]。然而，MRP8/14在ALI發(fā)生發(fā)展過程中的作用及其機(jī)制尚不清楚。本文旨在探討MRP8/14對肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞(alveolar type Ⅱ epithelial cells，AT-Ⅱ)系A(chǔ)549細(xì)胞存活及凋亡的影響，并分析NF-κB在該過程中的生物學(xué)作用。

材　料　和　方　法

1細(xì)胞培養(yǎng)

人肺泡上皮細(xì)胞系A(chǔ)549由本實驗室保存，采用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，待細(xì)胞生長至80%融合度時進(jìn)行傳代。

2主要試劑

含His標(biāo)簽的人MRP8及MRP14原核表達(dá)載體pET-14b/MRP8和pET-14b/MRP14由本實驗室構(gòu)建并保存；RPMI-1640培養(yǎng)基和胎牛血清購自Gibco；CCK-8試劑盒購自上海碧云天公司；Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡雙染試劑盒購自凱基公司；anti-phospho-NF-κB p65 及HRP標(biāo)記的抗鼠IgG購自CST；anti-NF-κB p65購自Abcam；anti-lamin B1單克隆抗體及HPR標(biāo)記的羊抗兔IgG購自Proteintech；Alexa Fluor 594標(biāo)記的驢抗兔IgG購自Molecular Probes；其它試劑均為進(jìn)口分裝或國產(chǎn)分析純。

3主要方法

3.1MRP8/14蛋白制備使用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)含His標(biāo)簽的MRP8及MRP14蛋白，經(jīng)鎳離子親和層析柱純化，用10%的聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)鑒定蛋白，使用BCA法進(jìn)行蛋白定量后，MRP8及MRP14蛋白按等摩爾數(shù)混合于制備液中[10 mmol/L Tris-HCl(pH 7.4)，0.1%膽酸鈉，1 mmol/L 乙二胺四乙酸，1 mmol/L β-巰基乙醇]，加入CaCl2使其在儲備液中終濃度為2 mmol/L，室溫孵育10 min。制備得到的蛋白在實驗前與多黏菌素B(polymyxin B，PMB)10 mg/L孵育30 min，以阻斷蛋白中脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)的生物學(xué)活性，具體參見文獻(xiàn)[10]。

3.2CCK8法檢測細(xì)胞活性將A549細(xì)胞以每孔1×104個接種于96孔板中，每孔200 μL培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h后給予不同濃度MRP8/14(0、1、10、20、30 mg/L)刺激24 h或20 mg/L MRP8/14刺激不同時間(0、12、24、48 h)，空白組為不含細(xì)胞的培養(yǎng)基，每組設(shè)3個復(fù)孔。37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)到達(dá)相應(yīng)時點后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2 h，酶標(biāo)儀下測定450 nm波長處的吸光度值(A450值)。

3.3Annexin-V/PI流式細(xì)胞技術(shù)檢測A549細(xì)胞凋亡A549細(xì)胞以每孔5×105個接種于6孔板，37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h后更換培養(yǎng)基，對照組與實驗組分別給予0 mg/L和20 mg/L MRP8/14刺激。為探討NF-κB的生物學(xué)效應(yīng)，抑制劑組使用10 μmol/L的NF-κB特異性抑制劑Bay 11-7082預(yù)處理1 h，然后給予20 mg/L MRP8/14刺激。各組刺激24 h后，收集細(xì)胞及上清，根據(jù)試劑盒操作說明進(jìn)行流式細(xì)胞定量分析。

3.4細(xì)胞核內(nèi)NF-κB p65蛋白水平檢測取對數(shù)生長期細(xì)胞，以2×106接種于10 cm皿，待細(xì)胞生長至融合度達(dá)80%加入20 mg/L的MRP8/14蛋白二聚體，刺激不同時間(0、30、60、120、240 min)后收取細(xì)胞進(jìn)行核質(zhì)分離，方法如下：每10 cm皿加入2 mL勻漿緩沖液，收集細(xì)胞，冰上孵育15 min，期間不斷輕柔顛倒混勻，加入10 μL 10% NP40，混勻后，4 ℃離心(800×g，5 min)，棄上清，再使用勻漿緩沖液重懸洗滌沉淀3次，最后向沉淀中加入60 μL核提取緩沖液，冰上孵育1 h，期間渦旋混勻數(shù)次使核膜充分溶解，然后4 ℃離心(18 000×g，25 min)，上清即為核蛋白[11]。將各組細(xì)胞核蛋白進(jìn)行Western blot實驗， I 抗為anti-NF-κB p65(1∶1 000)和anti-lamin B1(1∶1 000)，室溫孵育4 h， II 抗分別為HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG(1∶5 000)和HRP標(biāo)記的抗鼠IgG(1∶8 000)，室溫孵育1 h，經(jīng)SuperSignal West Pico化學(xué)發(fā)光底物顯色，利用Kodak IS4 000R圖像工作站進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測。圖片掃描后使用Gelpro軟件測量蛋白條帶的灰度值，以p65/lamin B1比值行半定量分析。

3.5間接免疫熒光檢測NF-κB p65入核1×104個細(xì)胞接種于Petri皿中，37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h后給予20 mg/L MRP8/14刺激1 h，4%多聚甲醛室溫固定10 min，0.2% Triton X-100室溫處理10 min，3% BSA封閉1 h，加入 I 抗(anti NF-κB p65，1∶100稀釋)孵育2 h，洗滌后加入 II 抗(Alexa Fluor 594標(biāo)記的驢抗兔 IgG，1∶100稀釋)避光孵育1 h,洗滌后加入DAPI(1∶400)避光孵育30 min，漂洗后使用Zeiss熒光顯微鏡觀察拍照。

3.6Western blot法檢測NF-κB p65磷酸化水平取對數(shù)生長期細(xì)胞，以每孔5×105個接種于6孔板中，分別給予MRP8/14刺激不同時間(0、30、60、120、240 min)后，收集各組細(xì)胞，Western blot法檢測各組p65磷酸化水平。 I 抗為anti-phospho-NF-κB p65(1∶1 000)和anti-NF-κB p65(1∶1 000)， II 抗為HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG(1∶5 000)，具體步驟同3.4。圖片掃描后用Gelpro軟件測量蛋白條帶的灰度值，以p-p65/p65比值行半定量分析。

4統(tǒng)計學(xué)處理

用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，兩組間比較采用t檢驗，多個樣本均數(shù)的比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，不同處理組間的兩兩比較行 SNK-q檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)　　果

1MRP8及MRP14蛋白純化鑒定

使用鎳離子親和層析柱純化MRP8及MRP14蛋白單體，SDS-PAGE進(jìn)行鑒定分析，結(jié)果顯示純化的蛋白質(zhì)分子大小與預(yù)期相同，純度>90%，見圖1。

Figure 1.Purification of MRP8 and MRP14 fusion proteins. 1: protein marker; 2: purified protein of MRP8; 3: purified protein of MRP14.

圖1MRP8及MRP14蛋白的純化

2MRP8/14對A549細(xì)胞活力的影響

CCK-8法檢測結(jié)果顯示，MRP8/14能夠引起A549細(xì)胞活力下降，并且呈現(xiàn)劑量和時間依賴性，20 mg/L MRP8/14刺激24 h能夠引起A549細(xì)胞活力下降25.9%(P<0.05),見圖2。

Figure 2.The effect of MRP8/14 on A549 cell viability detected by CCK-8 assay. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vs0 mg/L or 0 h.

圖2MRP8/14對A549細(xì)胞活性的影響

3MRP8/14對A549細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MRP8/14刺激組凋亡率為23.61%±4.01%，與對照組(8.79%±1.97%)相比差異有統(tǒng)計學(xué)顯著性(P<0.01)，見圖3。

4MRP8/14對A549細(xì)胞NF-κB p65入核的影響

MRP8/14刺激A549細(xì)胞不同時間，用Western blot法檢測細(xì)胞核內(nèi)NF-κB p65的蛋白水平，發(fā)現(xiàn)MRP8/14刺激60 min細(xì)胞核內(nèi)NF-κB p65蛋白水平達(dá)到高峰，隨后，細(xì)胞核內(nèi)NF-κB p65蛋白水平隨著刺激時間的延長逐漸降低。根據(jù)以上結(jié)果，選取細(xì)胞核內(nèi)NF-κB p65蛋白水平最高的時點，即刺激60 min后，進(jìn)行間接免疫熒光檢測，結(jié)果顯示與對照組相比，MRP8/14刺激能夠明顯誘導(dǎo)NF-κB p65蛋白的細(xì)胞核移位，見圖4。

5MRP8/14對A549細(xì)胞NF-κB p65磷酸化水平的影響

MRP8/14刺激A549細(xì)胞不同時間，用Western blot法檢測NF-κB p65蛋白磷酸化情況，發(fā)現(xiàn)MRP8/14刺激30 min能明顯檢測到NF-κB p65蛋白的磷酸化，刺激60 min時NF-κB p65蛋白的磷酸化達(dá)到高峰，隨后，NF-κB p65蛋白的磷酸化水平隨著刺激時間的延長逐漸降低，見圖5。

Figure 3.The effect of MRP8/14 on the apoptotic rate of A549 cells.Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group.

圖3MRP8/14對A549細(xì)胞凋亡的影響

Figure 4.The effect of MRP8/14 on the location of NF-κB p65 in A549 cells. A: the level of NF-κB p65 in nucleus was observed by Western blot; B: the location of NF-κB p65 in the A549 cells was detected by indirect immunofluorescence. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vs0 min.

圖4MRP8/14對A549細(xì)胞NF-κB p65入核的影響

Figure 5.Serine phosphorylation of NF-κB p65 in A549 cells treated with MRP8/14. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vs0 min.

圖5MRP8/14對A549細(xì)胞NF-κB p65絲氨酸磷酸化水平的影響

6NF-κB抑制劑對MRP8/14所致A549細(xì)胞凋亡的影響

使用NF-κB特異性抑制劑Bay 11-7082預(yù)處理A549細(xì)胞1 h后再給予MRP8/14刺激，細(xì)胞凋亡率為8.49%±3.33%，與單純MRP8/14刺激組(24.01%±4.26%)相比，差異有統(tǒng)計學(xué)顯著性(P<0.01)，見圖6。

Figure 6.The effect of Bay 11-7082 on the apoptotic rate of A549 cells treated with MRP8/14. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsMRP8/14.

圖6NF-κB特異性抑制劑Bay 11-7082對MRP8/14所致A549細(xì)胞凋亡的影響

討　　論

ALI是臨床上常見的危重癥，盡管近年來對其進(jìn)行了大量研究，但由于其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，死亡率仍然居高不下。感染所致的膿毒血癥是急性肺損傷最常見的原因[2-3]。膿毒血癥常伴隨著MRP8/14的大量釋放，MRP8/14能夠加重膿毒血癥病人的炎癥反應(yīng)，并且在膿毒血癥模型中，野生型小鼠比MRP8/14基因敲除小鼠具有更加嚴(yán)重的病理改變[12]。在肺部感染病人的血清及肺泡灌洗液中也能檢測到大量MRP8/14蛋白，相比MRP8/14基因敲除小鼠，感染肺炎鏈球菌的野生型小鼠死亡率更高[9]。然而，MRP8/14在ALI發(fā)生發(fā)展過程中所發(fā)揮的生物學(xué)效應(yīng)還沒有完全闡明，進(jìn)一步研究MRP8/14的生物學(xué)功能對認(rèn)識和治療ALI具有重要意義。

AT-Ⅱ能夠合成和分泌肺泡表面活性物質(zhì)(pulmonary surfactant，PS)，維持肺泡上皮屏障功能，防止肺水腫發(fā)生，其結(jié)構(gòu)功能異常在ALI的發(fā)生過程中起了重要的作用[13]。AT-Ⅱ凋亡在ALI的發(fā)生發(fā)展中扮演了重要角色[14]，研究表明，ALI病人的血清及肺泡灌洗液中，與凋亡相關(guān)的Fas/FasL系統(tǒng)存在明顯活化，并且Fas水平高的患者臨床表現(xiàn)越嚴(yán)重[4]。為了探討MRP8/14對AT-Ⅱ的生物學(xué)效應(yīng)，本課題選擇人肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞，采用CCK-8法檢測了不同濃度及不同處理時間下，MRP8/14對A549細(xì)胞活性的影響。結(jié)果表明，MRP8/14能夠明顯降低A549細(xì)胞活性，并且呈現(xiàn)劑量與時間依賴性。由于相關(guān)研究表明，MRP8/14能夠通過半胱天冬酶依賴和非依賴途徑引起細(xì)胞凋亡[15]，因此我們進(jìn)一步研究了MRP8/14所導(dǎo)致的A549細(xì)胞活性下降是否與細(xì)胞凋亡相關(guān)。流式細(xì)胞技術(shù)分析結(jié)果顯示，MRP8/14能夠顯著地引起A549細(xì)胞發(fā)生凋亡。

研究表明，NF-κB的激活與AT-Ⅱ細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，NF-κB的特異性抑制劑能夠明顯抑制ALI過程中凋亡相關(guān)分子的表達(dá)以及細(xì)胞凋亡的發(fā)生[6]，MRP8/14能夠激活單核巨噬細(xì)胞NF-κB，導(dǎo)致p65磷酸化并移位入核，從而引起促炎因子的釋放[10]。然而MRP8/14能否引起A549細(xì)胞NF-κB的激活尚無人報道，因此我們采用Western blot法及間接免疫熒光法檢測了MRP8/14對A549細(xì)胞中NF-κB p65蛋白定位的影響，結(jié)果顯示MRP8/14能引起p65蛋白移位入核。此外，Western blot法檢測發(fā)現(xiàn)，MRP8/14能夠明顯誘導(dǎo)A549細(xì)胞中NF-κB p65蛋白發(fā)生磷酸化，激活NF-κB信號通路。為了進(jìn)一步驗證NF-κB活化與MRP8/14引起的A549細(xì)胞凋亡相關(guān)，使用NF-κB特異性抑制劑Bay 11-0782抑制NF-κB信號通路后再給予MRP8/14刺激，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Bay 11-0782能夠顯著抑制MRP8/14誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，這提示NF-κB的激活在MRP8/14所引起AT-Ⅱ凋亡過程中發(fā)揮了重要作用。

綜上所述，在感染所致急性肺損傷中，MRP8/14可以通過NF-κB依賴的途徑引起AT-Ⅱ發(fā)生凋亡，從而加重急性肺損傷。針對MRP8/14及其生物學(xué)效應(yīng)的藥物可能為治療急性肺損傷提供新的思路。

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(責(zé)任編輯： 林白霜， 羅森)

NF-κB regulates apoptosis of human alveolar epithelial cells induced by MRP8/14

HUANG Lin1, YANG Chen1, LIANG Jie1, LUO Hai-hua2, JIANG Yong2, LIU Ai-hua1

(1DepartmentofRespiratoryDisease,NanfangHospital,2DepartmentofPathophysiology,KeyLaboratoryofProteomicsofGuangdongProvince,SouthernMedicalUniversity,Guangzhou510515,China.E-mail:lah47158@aliyun.com.cn)

AIM: To investigate the effects of myeloid-related protein 8/14 (MRP8/14) on the survival and apoptosis of human alveolar epithelial cell line A549, and to explore the role of nuclear factor-κB (NF-κB) in this process. METHODS: A549 cells were treated with different doses of MRP8/14 or stimulated with MRP8/14 for different time. The effect of MRP8/14 on the viability of A549 cells was determined by CCK-8 assay. The apoptotic rates were tested by flow cytometry. The nuclear translocation of NF-κB p65 was detected by Western blot and indirect immunofluorescence. Besides, the phosphorylation level of NF-κB p65 was determined by Western blot. NF-κB-specific inhibitor Bay 11-7082 was used to further analyze the role of NF-κB in the apoptosis induced by MRP8/14. RESULTS: The viability of the A549 cells was affected by MRP8/14 in a dose- and time-dependent manner. Flow cytometric analysis showed that the apoptotic rates were increased in the cells treated with MRP8/14 (P<0.01). In A549 cells administered with MRP8/14, NF-κB p65 was significantly phosphorylated and translocated into the nuclei, suggesting the activation of NF-κB signaling pathway. However, NF-κB-specific inhibitor Bay 11-7082 significantly attenuated the cell apoptosis induced by MRP8/14 (P<0.01). CONCLUSION: NF-κB plays an important role in regulating the apoptosis of human alveolar epithelial cells induced by MRP8/14.

Acute lung injury; Apoptosis; Myeloid-related protein 8/14; Alveolar type Ⅱ epithelial cells; Nuclerar factor-κB

1000- 4718(2016)04- 0701- 06

2015- 12- 14

2016- 01- 21

廣東省自然科學(xué)基金資助項目(No.S2013010014422)；國家自然科學(xué)基金資助項目(No.81030055)

Tel: 020-61641575; E-mail: lah47158@aliyun.com.cn

R363.21

A

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