盧根林，　吳愛兵，　王宏賓

(1義烏市中心醫(yī)院普通外一科，浙江 義烏 322000； 2廣東醫(yī)學院附屬醫(yī)院腫瘤中心，廣東 湛江 523808；3青海大學附屬醫(yī)院肝膽胰外科, 青海 西寧 810001)

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H2S通過MAPK信號通路影響缺血再灌注損傷大鼠回腸上皮細胞凋亡*

盧根林1△，吳愛兵2，王宏賓3

(1義烏市中心醫(yī)院普通外一科，浙江 義烏 322000；2廣東醫(yī)學院附屬醫(yī)院腫瘤中心，廣東 湛江 523808；3青海大學附屬醫(yī)院肝膽胰外科, 青海 西寧 810001)

目的： 建立大鼠腸缺血再灌注(I/R)損傷模型，研究H2S對I/R損傷大鼠回腸上皮細胞凋亡、MAPK信號通路表達的影響。方法: 30只雄性Wistar大鼠隨機分為假手術(shù)(sham)組、I/R組、I/R+NaHS組。建立大鼠腸I/R損傷模型。再灌注前10 min時經(jīng)大鼠尾靜脈注入100 μmol/kg NaHS,隨后按1 mg·kg-1·h-1輸注直到再灌注2 h。RT-PCR檢測回腸組織ERK、JNK和p38MAPK的mRNA表達， Western blot檢測回腸組織p-ERK、p-JNK、p-p38MAPK、p-NF-κB P65的蛋白水平。TUNEL染色檢測回腸上皮細胞凋亡。敏感硫電極法測定血、回腸組織勻漿中的H2S濃度。結(jié)果: I/R組的H2S濃度、ERK、mRNA、p-ERK均低于sham組和I/R+NaHS組，JNK mRNA、p38MAPK mRNA、p-JNK、p-p38MAPK、p-NF-κB P65和凋亡指數(shù)高于sham組和I/R+NaHS組。結(jié)論: H2S通過下調(diào)ERK的mRNA表達及磷酸化，上調(diào)JNK、p38MAPK mRNA的表達，促進JNK、p38MAPK、NF-κB磷酸化，從而減輕I/R 損傷大鼠的回腸上皮細胞凋亡。

缺血再灌注損傷； 硫化氫； MAPK信號通路； 細胞凋亡

絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)是一組絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶，包括細胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)、c-Jun蛋白氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)、p38促分裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase，p38 MAPK)，調(diào)節(jié)細胞的生長、分化、對環(huán)境的應激適應、炎癥反應、凋亡等細胞生理、病理過程[1-3]。H2S由小腸胱硫醚 γ-裂解酶(cystathionine γ-lyase，CSE)催化L-半胱氨酸生成，對腸缺血再灌注(ischemia-reperfusion，I/R)損傷起保護作用[4-5]，但機制未明確。本文建立大鼠腸缺血再灌注損傷模型，研究H2S對I/R損傷大鼠回腸上皮細胞凋亡、MAPKs表達的影響，結(jié)果報告如下。

材　料　和　方　法

1動物、試劑、儀器

健康雄性Wistar大鼠，SPF級，6周齡，體質(zhì)量200～250 g，由浙江大學醫(yī)學院動物中心提供，動物合格證號為201001018。

硫氫化鈉(sodium hydrosulfide，NaHS)購自Sigma；羊抗大鼠p-ERK、p-JNK、p-NF-κB P65和p38MAPK的單克隆I抗、TUNEL檢測試劑盒購自Santa Cruz；羊抗大鼠GAPDH單克隆抗體、辣根過氧化物酶標記兔抗羊IgG、DAB顯示劑、SDS凝膠、ECL發(fā)光液、轉(zhuǎn)膜液、硝酸纖維膜和Bradford蛋白試劑盒均購自北京中山生物技術(shù)有限公司；ERK的上游引物序列為 5’-TCCTTGGGAGGGAAGATACC-3’，下游引物序列為 5’-ATGACAATCCCGTAGCTCCA-3’，擴增片段為100 bp；JNK的上游引物序列為5’-AGCCTTGTCCTTCGTGTC-3’，下游引物序列為5’-AAAGTGGTCAACAGAGCC-3’，擴增片段為330 bp；p38MAPK的上游引物序列為5’-AAGATGCTGGTTTTGGACTCG-3’，下游引物序列為5’-GTCAGGCTCTTCCATTCGTCT-3’，擴增片段為300 bp；β-actin的上游引物序列為5’-GAGGCCCAGAGCAAGAGAGG-3’，下游引物序列為5’-TCACCGGAGTCCATCACGAT-3’，擴增片段為600 bp。各基因引物由Invitrogen合成；TRIzol、RT-PCR試劑盒購自TaKaRa。

電泳儀(Bio-Rad)、敏感硫電極和PXS-270離子計購于上海雷磁儀器廠；圖像分析軟件(VILBER LOURMAT)。

2方法

2.1實驗動物分組及腸缺血-再灌注損傷模型的建立按隨機數(shù)字表法將30只雄性Wistar大鼠分為假手術(shù)(sham)組、I/R組、I/R+NaHS組，每組10只。腹腔注射20%烏拉坦(5 mL/kg體重)麻醉，經(jīng)腹正中切口剖腹及游離腸系膜上動脈(superior mesenteric artery，SMA)，鉗夾I/R組和 I/R+NaHS組大鼠的SMA缺血 60 min，松開再灌注120 min，建立大鼠腸I/R損傷模型[4-5]。I/R+NaHS組大鼠于灌注前10 min經(jīng)尾靜脈注入100 μmol/kg NaHS后按1 mg·kg-1·h-1輸注直到再灌注2 h，向sham組和I/R組大鼠的尾靜脈注入相同體積的生理鹽水，作用時間和持續(xù)時間均同I/R+NaHS組[4-5]。實驗結(jié)束后處死大鼠，取回腸末端標本在液氮中保存或甲醛中固定，取血離心分離血漿，-20 ℃保存。

2.2血漿及回腸勻漿中H2S濃度的測定末端回腸用DEPC清洗后行組織勻漿，采用敏感硫電極法完成H2S濃度測定，具體方法和步驟參照文獻[4-6]。

2.3RT-PCR檢測回腸組織ERK、JNK、p38MAPK的mRNA表達TRIzol一步法提取回腸黏膜總RNA，電泳見28 S、18 S條帶，以2.5 μg總RNA為模板按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。再按PCR試劑盒說明書進行cDNA擴增。PCR條件為94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s，ERK(53 ℃)/ JNK、p38MAPK(55℃)/β-actin(57 ℃) 30 s，72 ℃ 30 s，35個循環(huán);72 ℃ 7 min。各取7 μL PCR產(chǎn)物和3.5 μL DNA marker上樣，各目的基因擴增產(chǎn)物和內(nèi)參照β-actin擴增產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，采用UVPGD800圖像分析處理系統(tǒng)進行目的基因電泳條帶密度分析，以ERK、JNK、p38MAPK mRNA與β-actin mRNA的比值表示ERK、JNK、p38MAPK mRNA的相對表達。

2.4Western blot 檢測p-ERK、p-JNK、p-NF-κB P65、p-p38MAPK蛋白的水平取回腸組織冰凍標本0.5 g于RIPA裂解液中碾磨，以Bardford法測定蛋白濃度。取50 μg蛋白行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)膜(0.65 mA/cm2)；室溫封閉3 h，加入I 抗[按p-ERK抗體(1∶1 000)、p-JNK(1∶750)、p-p38MAPK(1∶500)、p-NF-κB P65(1∶300)、GAPDH抗體(1∶800)比例稀釋]，4 ℃過夜。漂洗后加入辣根過氧化物酶標記的IgG II抗室溫反應1.5 h，0.1% TBST洗膜，ECL發(fā)光、壓片、顯影。使用BandScan分析膠片灰度值，以p-ERK、p-JNK、p-NF-κB P65、p-p38MAPK與GAPDH灰度值比值表示p-ERK、p-JNK、p-NF-κB P65、p-p38MAPK的相對蛋白含量。

2.5回腸組織TUNEL染色參照TUNEL檢測試劑盒說明書步驟進行。末端回腸組織石蠟包埋切片經(jīng)脫蠟、梯度乙醇脫水，蛋白酶K消化后，依次加入TUNEL反應混合液、Converter-POD。DAB顯色，蘇木素復染，中性樹脂封片。以不加TdT酶作為陰性對照，細胞核呈棕色著色的為陽性細胞。在高倍鏡(×200)視野下隨機取5個視野，計數(shù)細胞總數(shù)和凋亡細胞數(shù)。凋亡指數(shù)(apoptosis index，AI)=凋亡細胞數(shù)/細胞總數(shù)×100% ，以5個視野的均值代表每只大鼠回腸上皮細胞的凋亡率。

3統(tǒng)計學處理

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，計量資料用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析，多樣本均數(shù)間兩兩比較用SNK-q檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié)　　果

1血漿及回腸組織勻漿中H2S水平變化

I/R組血漿及回腸組織勻漿中H2S均低于sham組和I/R+NaHS組(P<0.01),見圖1。

Figure 1.The content of H2S in the plasma and ileal homogenate.Mean±SD.n=10.**P<0.01vssham group;##P<0.01vsI/R group.

圖1血漿和回腸組織勻漿中H2S濃度的變化

2回腸上皮細胞AI變化

TUNEL染色下sham組未見凋亡的細胞，I/R組和I/R+NaHS組均有棕色凋亡的回腸上皮細胞，I/R組多于I/R+NaHS組；I/R組的AI高于sham組和I/R+NaHS組(P<0.01),見圖2。

Figure 2.The apoptosis of ileum epithelial cells in the rats with different treatments (TUNEL staining, ×200).Mean±SD.n=10.**P<0.01vssham group;##P<0.01vsI/R group.

圖2各組大鼠回腸上皮細胞的 TUNEL染色觀察

3回腸組織ERK、JNK、p-p38MAPK的mRNA水平

I/R組ERK mRNA低于sham組和I/R+NaHS組，JNK和p38MAPK mRNA高于sham組和I/R+NaHS組,見圖3。

4回腸組織p-ERK、p-JNK、p-NF-κB P65、p-p38MAPK的蛋白水平

I/R組的p-ERK低于sham組和I/R+NaHS組，p-JNK、p-NF-κB P65、p-p38MAPK均高于sham組和I/R+NaHS組,見圖4。

討　　論

I/R損傷時氧自由基和炎癥因子等大量釋放、呼吸爆發(fā)、ATP生成障礙、凋亡信號通路基因表達上調(diào)等導致小腸上皮細胞發(fā)生壞死或凋亡，表現(xiàn)為小腸黏膜屏障功能障礙[4, 7]。細胞凋亡是由基因調(diào)控的程序性細胞死亡[4, 7]。本研究發(fā)現(xiàn)TUNEL染色下I/R組回腸上皮細胞凋亡，AI顯著高于sham組。因此腸I/R損傷大鼠回腸上皮細胞發(fā)生凋亡，與文獻結(jié)果一致[4, 7]。本研究結(jié)果顯示I/R組的H2S低于sham組，H2S與AI呈負相關(guān)，表明內(nèi)源性H2S減輕腸I/R損傷大鼠回腸上皮細胞凋亡，與文獻結(jié)果一致[4]。研究表明MAPK信號通路在損傷組織細胞凋亡中發(fā)揮重要作用[8-9]。絲裂原、生長因子、G蛋白偶聯(lián)受體均可使Raf、Mos、Tpl2活化，依次激活MEK、ERK，介導細胞生長、分化、增殖[8]。應激、炎癥介質(zhì)、細胞因子、生長因子可使MLK3、TAK、DLK、MKK3、MKK6活化，激活p38MAPK；也可使MEKK1、MEKK4、MLK3、ASK1、MKK4、MKK7活化，激活SAPK、JNK，NF-κB，上調(diào)TNF-α、IL-1β、IL-2、IL-6、IL-8、IL-12、iNOS、COX-2、黏附分子、集落刺激因子并下調(diào)鋅指蛋白A20、血紅素加氧酶-1表達，促進細胞凋亡并抑制細胞生長、分化[1-2, 9]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)與sham組比較，I/R組的ERK mRNA表達下調(diào)且磷酸化水平降低，與AI呈負相關(guān)；I/R組的JNK及p38MAPK mRNA表達上調(diào),JNK,p38MAPK和NF-κB磷酸化水平升高，提示MAPK信號通路參與缺血再灌注損傷大鼠回腸上皮凋亡。

Figure 3.Hydrogen sulfide up-regulated the mRNA expression of ERK and down-regulated the mRNA expression of p38MAPK and JNK in the ileum epithelial cells of the rats. M：DNA marker. Mean±SD.n=10.**P<0.01vssham group;##P<0.01vsI/R group.

圖3各組大鼠回腸組織ERK、p38MAPK、JNK的mRNA表達

Figure 4.Hydrogen sulfide up-regulated p-ERK protein and down-regulated p-JNK, p-NF-κB P65, p-p38MAPK in the ileum of the rats.Mean±SD.n=10.**P<0.01vssham group;##P<0.01vsI/R group.

圖4大鼠回腸組織p-ERK、p-p38MAPK、p-JNK、p-NF-κB P65蛋白水平的變化

H2S是續(xù)一氧化氮(NO)和一氧化碳(CO)之后的第3種氣體信號分子，由CSE等催化L-半胱氨酸合成。H2S具有激活K+ATP 通道擴張血管、抑制白細胞-上皮細胞黏附、抗氧化、介導中性粒細胞凋亡，增加胃黏膜血流、抑制白細胞-上皮細胞黏附從而改善非類固醇抗炎藥(non-steroidal anti-inflammatory drugs， NASIDs)引起的胃黏膜損傷等作用[10-11]。H2S能減輕 I/R損傷大鼠小腸黏膜屏障功能障礙[4-5]。本研究結(jié)果顯示I/R+NaHS組AI低于I/R組，H2S高于I/R組，AI與H2S呈負相關(guān)。因此，H2S可抑制I/R損傷大鼠回腸上皮凋亡，對I/R損傷大鼠。

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(責任編輯： 陳妙玲， 余小慧)

Role of hydrogen sulfide in ileal epithelial cell apoptosis by MAPK signaling pathway in rats with intestinal ischemia-reperfusion injury

LU Gen-lin1, WU Ai-bing2, WANG Hong-bin3

(1TheFirstDepartmentofGeneralSurgery,YiwuCentralHospital,Yiwu322000,China;2OncologyCenter,TheHospitalAffiliatedtoGuangdongMedicalCollege,Zhanjiang523808,China;3DepartmentofHepatopancreatobiliarySurgery,TheHospitalAffiliatedtoQinghaiUniversity,Xining810001,China.E-mail:lugenlin007@163.com)

AIM: To investigate the effect of hydrogen sulfide (H2S) on the expression of MAPKs and ileal epithelial cell apoptosis in the rats with intestinal ischemia-reperfusion (I/R) injury. METHODS: Healthy female Wistar rats were randomly divided into sham operation group, I/R group, I/R+sodium hydrosulfide (NaHS) group . The animal model of intestinal ischemia reperfusion was established. Apoptosis index (AI) of ileal epithelial cell was measured by TUNEL assay. H2S was detected by sensitive sulfide electrode. The mRNA expression of ERK, JNK and p38MAPK was detected by RT-PCR. The protein levels of phosphorylation(p)-ERK, p-JNK, p-NF-κB P65 and p38MAPK were determined by Western blot.RESULTS: H2S, ERK mRNA and p-ERK in I/R group were significantly higher than those in I/R+NaHS group and sham group while JNK mRNA, p38MAPK mRNA, p-JNK, p-p38MAPK, p-NF-κB P65 and AI were predominantly higher than those in I/R+NaHS group and sham group (P<0.01).CONCLUSION: H2S attenuates ileal epithelial cell apoptosis in the rats with intestinal I/R injury by down-regulating ERK mRNA p-ERk and up-regulating JNK mRNA, p38MAPK mRNA and phosphorylation of JNK, p38MAPK and NF-κB P65.

Ischemia-reperfusion injury; Hydrogen sulfide; MAPK signaling pathway; Apoptosis

1000- 4718(2016)04- 0691- 05

2015- 11- 17

2016- 02- 22

國家自然科學基金青年科學基金資助項目(No. 81201672)；義烏市人才引進立項項目(No. 2012-R-04)

Tel: 0570-7368680; E-mail: lugenlin007@163.com

R363; R656.7

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.04.018

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