喬　圓，　廖　雁，　南　方，　梁月琴，　范彥英

(山西醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院藥理教研室， 山西 太原 030001)

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組胺對星形膠質細胞Egr-1表達的調節(jié)作用*

喬圓，廖雁，南方，梁月琴，范彥英△

(山西醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院藥理教研室， 山西 太原 030001)

目的： 探討組胺對星形膠質細胞早期反應生長因子-1(Egr-1)表達是否具有調節(jié)作用。方法: 將野生型(WT)和組氨酸脫羧酶敲除(HDC-KO)小鼠及組胺處理的HDC-KO小鼠取腦，并提取皮層組織總RNA。將原代培養(yǎng)的大鼠皮層星形膠質細胞分別給予不同濃度的組胺(10-8、10-7、10-6、10-5或10-4mol/L)處理15、30、60、120或240 min。組胺H1、H2受體拮抗劑分別于組胺給藥前15 min加入。組胺處理完畢后，提取細胞總RNA或蛋白。利用real-time PCR和Western blot 測定Egr-1的表達。結果: 與WT小鼠相比，HDC-KO小鼠大腦皮層Egr-1 的mRNA表達量顯著降低，而外源性給予組胺則能促進其Egr-1的mRNA表達。在培養(yǎng)的星形膠質細胞上，組胺可促進Egr-1的mRNA表達，其中10-5mol/L的組胺作用最強，而組胺(10-5mol/L)處理30 min時Egr-1 的mRNA表達量達到峰值，相應的Egr-1蛋白表達于60 min時顯著增高，該作用可被組胺H1受體拮抗劑而非H2受體拮抗劑顯著抑制。結論: 組胺對大腦皮層組織及培養(yǎng)的星形膠質細胞Egr-1表達具有上調作用，該作用與激動組胺H1受體有關。

組胺； 早期反應生長因子-1； 星形膠質細胞

早期反應生長因子-1(early growth response factor-1，Egr-1)，也稱為NGFI-A、zif268、krox24或Tis8，是一種重要的核轉錄因子[1]，其在皮層、海馬、紋狀體、丘腦等不同腦區(qū)均有較高水平的表達[2-3]。很多刺激因素，如腦缺血[4]、缺氧[5]、輻射[6]等均可誘導Egr-1在腦內迅速而短暫地高表達。Egr-1參與了中樞神經系統(tǒng)的許多生理病理調節(jié)過程，如突觸可塑性[7]、神經干細胞的增殖分化[8]、神經炎癥[9]等。大量研究發(fā)現(xiàn)，在星形膠質細胞中，Egr-1可調控多種細胞因子的表達，如膠質細胞源性神經營養(yǎng)因子(glial cell-derived neurotrophic factor，GDNF)、堿性成纖維細胞生長因子 (basic fibroblast growth factor，bFGF)、表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)、血小板衍生生長因子(platelet derived growth factor，PDGF)[10-12]等，進而促進細胞的增殖。另外，Beck等[13]還發(fā)現(xiàn)，Egr-1通過調節(jié)硫酸軟骨素蛋白多糖基因的轉錄，參與了腦缺血后膠質瘢痕的形成。

中樞組胺是腦內一種重要的神經遞質或調質，其可由組氨酸經由組氨酸脫羧酶脫羧而成[14]。腦內組胺主要分布于組胺能神經元和肥大細胞中，組胺能神經元的胞體位于下丘腦乳頭結節(jié)核，該神經元在腦內有著廣泛而彌散的投射[14]。組胺在腦內通過H1、H2和H3受體發(fā)揮多種神經調節(jié)作用，如參與覺醒、攝食、學習記憶、癲癇、疼痛及腦缺血等生理病理過程[15-21]。在星形膠質細胞上，也有組胺的相關受體表達[22]。但目前對于星形膠質細胞上組胺受體被激活的生理病理意義及其下游信號通路作用靶點的研究仍較少。最近Hao等[23]研究發(fā)現(xiàn)，組胺可促進人源性大動脈內皮細胞的Egr-1表達，但其能否調節(jié)腦內特別是星形膠質細胞內Egr-1的表達尚不清楚。由于Egr-1可調節(jié)星形膠質細胞中多種細胞因子GDNF、bFGF、EGF、PDGF等的表達[10-13]，如果組胺可調節(jié)星形膠質細胞內Egr-1的表達，這將有助于發(fā)現(xiàn)星形膠質細胞上組胺受體下游的新作用靶點。

為此，本研究利用組氨酸脫羧酶敲除(histidine decarboxylase knockout，HDC-KO)小鼠觀察長期缺乏內源性組胺是否會影響腦內Egr-1 mRNA的表達水平。同時，利用原代培養(yǎng)的大鼠皮層星形膠質細胞探討組胺對星形膠質細胞Egr-1 mRNA及蛋白表達的調節(jié)作用及受體機制。

材　料　和　方　法

1動物

雄性C57BL/6 野生型(wild type，WT)小鼠(北京維通利華公司提供)和組氨酸脫羧酶敲除小鼠(來自浙江大學陳忠教授研究組)[20]，體重22～25 g，周齡為8～10周。所有的動物實驗均遵照國家實驗動物飼養(yǎng)和使用指南，動物飼養(yǎng)在溫度控制的環(huán)境(22±1 ℃)下，12 h明暗循環(huán)，自由飲食和飲水。取WT和HDC-KO小鼠各4只用于檢測其大腦皮層Egr-1的mRNA表達量。另取HDC-KO小鼠6只隨機分為實驗組和對照組。實驗組側腦室注射組胺5 μg(2 μL)，對照組則給予人工腦脊液2 μL，60 min后，取其大腦皮層用于檢測Egr-1的mRNA表達量。

2原代大鼠皮層星形膠質細胞培養(yǎng)及藥物處理

參照文獻報道[24]，將新生24 h內的SD大鼠(SPF級)用75%乙醇消毒斷頭，取出大腦并迅速置于冰冷的解剖液中，剝去軟腦膜和血管，分離出大腦皮層組織，剪碎后用0.25%胰酶在37 ℃下消化15 min。然后加入適量含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液，洗滌1～2次，用吸管吹打成細胞懸液，接種到經0.1%多聚賴氨酸包被的細胞培養(yǎng)瓶內，在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，每3～4 d半量換液1次。培養(yǎng)10～12 d后，待培養(yǎng)瓶中細胞鋪滿瓶底時, 將培養(yǎng)瓶置于37 ℃恒溫搖床上，以260 r/min的速度振搖過夜，以去除混雜的神經元細胞和小膠質細胞。隨后進行傳代培養(yǎng)，按1×108cells/L密度將細胞接種至培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板中，2～3 d后待細胞鋪滿瓶底時，換液為無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)16 h。加入不同濃度的組胺(10-8、10-7、10-6、10-5或10-4mol/L)分別處理15、30、60、120或240 min。H1受體拮抗劑吡拉明(Pyrilamine,Pyri)和苯海拉明(diphenhydramine,Diphen)及H2受體拮抗劑西咪替丁(cimetidine,Cime)和左拉替丁(zolatidine,Zola)在組胺給藥前15 min加入(所有拮抗劑濃度均為10-5mol/L)。

3小鼠腦微血管內皮細胞株bEnd.3的培養(yǎng)及藥物處理

bEnd.3 細胞株購自于ATCC，在37 ℃、5% CO2條件下，用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液將細胞培養(yǎng)至鋪滿瓶底后用含0.25%胰蛋白酶、0.03% EDTA的消化液消化細胞并按5×107cells/L接種至培養(yǎng)瓶中，2～3 d后待細胞鋪滿瓶底時，換液為無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)16 h，隨后加入組胺(10-5mol/L)分別處理15、30、60 min。

4實驗方法

4.1Real-time PCR檢測Egr-1的mRNA表達量利用TRIzol法提取WT和HDC-KO小鼠大腦皮層組織以及細胞總RNA，取2 μL 利用NanoDrop ND-1000 spectrophotometer測定RNA濃度，及260/280吸光度(A)比值，校正各管樣本總RNA終濃度為200 mg/L。以Oligo dT為引物，按照TaKaRa逆轉錄試劑盒說明書要求先將mRNA逆轉錄為cDNA。反應條件為37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。以2 μL cDNA為模板，在20 μL real-time PCR體系下，選用 ABI 7500 real-time PCR 儀進行DNA擴增。反應條件為:95 ℃ 1 min;95 ℃ 15 s,63 ℃ 45 s，共40個循環(huán)。以GAPDH作為內參照。Egr-1的上游引物為5’-CGAACAACCCTACGAGCACCTG-3’，下游引物為5’-CAGAGGAAGACGATGAAGCAGC-3’；GAPDH的上游引物為5’-GTCGGTGTGAACGGATT-TGG-3’，下游引物為5’-GCTCCTGGAAGATGGTGATGG-3’。

4.2Western blot 檢測Egr-1蛋白的表達量RIPA裂解液加入蛋白酶抑制劑后提取細胞蛋白，以牛血清白蛋白為標準，采用BCA法對蛋白進行定量，用10% SDS-PAGE分離蛋白，并轉印至NC膜，用5% BSA室溫封閉90 min，加入Egr-1抗體(1∶300，Abcam)或GAPDH抗體(1∶10 000，Bioworld)4 ℃孵育過夜，次日，反復洗膜后加入IgG-HRP抗體室溫輕搖孵育(1∶3 000，博士德)1 h，并用ECL化學發(fā)光法檢測，結果用AlphaView SA軟件分析。

4.3細胞免疫熒光染色取出長有星形膠質細胞的玻片，用 PBS漂洗，4oC甲醇固定，空氣干燥。PBS漂洗后加入5%小牛血清白蛋白室溫孵育2 h；加入兔抗膠質纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)抗體(1∶200，博士德)，4oC孵育過夜，用PBS漂洗3次后，加入羊抗兔IgG-Alexa 488 (1∶300，Invitrogen)室溫反應2 h；用PBS清洗3次；抗熒光淬滅、含DAPI的封片劑封片，在熒光顯微鏡下觀察、拍照，分析GFAP陽性細胞率。陰性對照操作完全平行，僅用5%小牛血清白蛋白代替I抗。

5統(tǒng)計學處理

采用SPSS 13.0軟件分析。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準誤(mean±SEM)表示。用單因素方差分析(one-way ANOVA)結合Bonferroni 法進行3組以上數(shù)據(jù)間差異的分析，用Student’st檢驗進行2組間數(shù)據(jù)差異分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結　　果

1組胺對小鼠大腦皮層 Egr-1 mRNA表達的影響

利用HDC-KO小鼠，觀察在長期缺乏內源性組胺的條件下是否會影響小鼠腦內Egr-1 mRNA表達。Real-time PCR檢測結果發(fā)現(xiàn)，HDC-KO小鼠大腦皮層Egr-1 的mRNA表達量比WT小鼠降低了28.5%±0.05%(P<0.05)。而在HDC-KO小鼠側腦室注射組胺，則能顯著促進Egr-1 mRNA的表達(P<0.01)，見圖1。

Figure 1.The effect of histamine on the mRNA expression of Egr-1 in the cerebral cortex in mice. Mean±SEM.n=3～4.#P<0.05vsWT;**P<0.01vsHDC-KO.

圖1組胺對小鼠大腦皮層Egr-1 mRNA表達的影響

2不同濃度組胺對星形膠質細胞Egr-1mRNA表達的影響

經免疫熒光染色鑒定，培養(yǎng)的膠質細胞GFAP陽性率達95%以上。10-7和10-6mol/L的組胺處理30 min后，星形膠質細胞Egr-1的mRNA表達即開始有增高的趨勢，但差異無統(tǒng)計學顯著性；而組胺在10-5和10-4mol/L濃度下Egr-1的mRNA表達進一步升高，與對照組相比差異有統(tǒng)計學顯著性(P<0.01)。由于組胺在10-5mol/L濃度下，Egr-1 mRNA的表達即達到了最大值，因此選用該濃度進行后續(xù)實驗，見圖2。

3組胺作用不同時間對星形膠質細胞Egr-1 mRNA表達的影響

組胺在10-5mol/L濃度下，分別處理星形膠質細胞15、30、60 min，結果發(fā)現(xiàn)，組胺處理15 min時，Egr-1的mRNA表達即有上調趨勢，但差異無統(tǒng)計學顯著性；組胺處理30 min時，Egr-1的mRNA表達量達到峰值，為對照組的(3.10±0.42)倍(P<0.01)，而在組胺處理60 min后即迅速下降至基礎表達量，見圖3。用組胺(10-5mol/L)處理bEnd.3細胞60 min后，其Egr-1的mRNA表達量仍顯著高于對照組(P<0.01)，見圖4。

Figure 2.Identification of the cultured astrocytes (A), and different concentration of histamine-stimulated mRNA expression of Egr-1 (B). Mean±SEM.n=3.**P<0.01vscontrol group.

圖2培養(yǎng)的星形膠質細胞的鑒定及不同濃度組胺對星形膠質細胞Egr-1 mRNA表達的影響

Figure 3.Time course of histamine (10-5mol/L) induction of Egr-1 mRNA expression in cultured astrocytes. Mean±SEM.n=3～4.**P<0.01vscontrol group.

圖3組胺作用不同時間對星形膠質細胞Egr-1 mRNA表達的影響

4H1和H2受體在組胺調節(jié)星形膠質細胞Egr-1 mRNA表達中的作用

為了進一步探明組胺調節(jié)星形膠質細胞Egr-1 mRNA表達的受體機制，在組胺處理前15 min，分別加入H1受體拮抗劑吡拉明和苯海拉明及H2受體拮抗劑西咪替丁和左拉替丁，結果發(fā)現(xiàn)，2種H1受體拮抗劑均能顯著抑制組胺對Egr-1 mRNA表達的上調作用(P<0.01)，而H2受體拮抗劑組與組胺處理組相比，Egr-1的mRNA表達差異無統(tǒng)計學顯著性，見圖5。

Figure 4.Histamine induction of Egr-1 mRNA expression in the bEnd.3 cells. Mean±SEM.n=3～4.**P<0.01vscontrol group.

圖4組胺對bEnd.3細胞Egr-1 mRNA表達的促進作用

Figure 5.The role of histamine receptors in histamine-stimulated Egr-1 mRNA expression in cultured astrocytes. Mean±SEM.n=5～8.**P<0.01vscontrol group；##P<0.01vshistamine group.

圖5組胺受體在組胺誘導的星形膠質細胞Egr-1 mRNA表達中的作用

5組胺及H1/H2受體對星形膠質細胞Egr-1蛋白表達的調節(jié)作用

在組胺處理星形膠質細胞60 min時，Egr-1蛋白表達顯著上調，為對照組的(2.57±0.33)倍(P<0.01)，而在240 min時，Egr-1蛋白表達已降至基礎水平。進一步，在組胺處理60 min的時點，觀察組胺H1受體拮抗劑吡拉明或H2受體拮抗劑西咪替丁對組胺誘導的Egr-1蛋白表達的影響。結果發(fā)現(xiàn)H1受體拮抗劑吡拉明能顯著抑制組胺誘導的Egr-1蛋白表達(P<0.01)，而H2受體拮抗劑并無明顯作用，見圖6。

Figure 6.The role of histamine and histamine receptors in Egr-1 protein expression in cultured astrocytes. Mean±SEM.n=3.**P<0.01vscontrol group；##P<0.01vshistamine group.

圖6組胺及H1/H2受體對星形膠質細胞Egr-1蛋白表達的調節(jié)作用

討　　論

2008年，Hao等[23]首次發(fā)現(xiàn)組胺通過H1受體對人源性大動脈內皮細胞的Egr-1表達具有上調作用，隨后Beermann等[25]也報道了組胺可促進轉染了H1或H4受體基因質粒的HEK293細胞Egr-1的表達。然而，組胺對腦內Egr-1的表達是否具有調節(jié)作用目前尚不清楚。我們的研究首次發(fā)現(xiàn)，長期缺乏組胺的HDC-KO小鼠，其腦內的Egr-1的mRNA表達明顯下調，而外源性補充組胺可顯著上調HDC-KO小鼠腦內Egr-1的mRNA表達。因此，組胺可能是腦內Egr-1 mRNA表達的重要調節(jié)因素之一。

組胺處理星形膠質細胞后，Egr-1的mRNA表達在15 min內已有上調趨勢，30 min時，Egr-1的mRNA表達即可達峰值。這種作用雖起效迅速但維持時間較短，組胺處理60 min時，其mRNA表達已恢復至基礎水平；Egr-1的蛋白表達則有相應的延遲，在組胺處理60 min時顯著增高，240 min時已降至基礎水平。而在bEnd.3細胞株上，組胺處理60 min時，Egr-1的mRNA表達仍顯著上調，這與Hao等[23]的研究結果是一致的。以上結果提示，組胺對不同來源細胞的Egr-1表達的調節(jié)作用在時程變化特點上有所不同。與星形膠質細胞相比，組胺促進bEnd.3細胞株Egr-1的mRNA表達的持續(xù)時間更長。

為了探明組胺調節(jié)星形膠質細胞Egr-1表達的受體機制，我們利用藥理學手段分別阻斷組胺H1和H2受體，結果發(fā)現(xiàn)組胺H1受體拮抗劑能顯著抑制組胺對Egr-1的mRNA及蛋白表達的上調作用，而組胺H2受體拮抗劑則無明顯作用，提示組胺促進Egr-1表達與激動星形膠質細胞上的H1受體有關。這與Hao等[23]發(fā)現(xiàn)的組胺促進人源性大動脈內皮細胞的Egr-1表達的受體機制是一致的。Beermann等[25]在轉染了H4受體基因質粒的HEK293細胞上發(fā)現(xiàn)，組胺可微弱地上調Egr-1 的mRNA表達，提示組胺H4受體也可能介導組胺對Egr-1表達的調節(jié)作用。然而，目前尚無研究證實星形膠質細胞是否表達H4受體，因此，相關受體機制仍有待進一步研究。

綜上所述，本研究利用HDC-KO小鼠證明了組胺對腦內Egr-1表達具有上調作用，并且組胺作用與H1受體有關。由于Egr-1可調節(jié)下游眾多蛋白的表達，該研究將有助于發(fā)現(xiàn)星形膠質細胞上組胺受體下游新的作用靶點。

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(責任編輯： 林白霜， 余小慧)

Effects of histamine on mRNA expression of Egr-1 in astrocytes

QIAO Yuan, LIAO Yan, NAN Fang, LIANG Yue-qin, FAN Yan-ying

(DepartmentofPharmacology,ShanxiMedicalUniversity,Taiyuan030001,China.E-mail:fyanying6@hotmail.com)

AIM: To explore whether histamine can regulate the expression of early growth response factor-1 (Egr-1) in the cerebral cortex astrocytes.METHODS: Normal wild-type (WT) mice, histidine decarboxylase knockout (HDC-KO) mice and histamine treated HDC-KO mice were sacrificed for extracting the total RNA of the cerebral cortex. Primary cultured rat cortical astrocytes were treated with histamine at concentrations of 10-8, 10-7, 10-6, 10-5or 10-4mol/L for 15, 30, 60, 120 or 240 min. H1or H2receptor antagonists were pretreated for 15 min before histamine treatment. After histamine treatment, the cell total RNA or protein was extracted. The expression of Egr-1 at mRNA and protein levels was determined by real-time PCR and Western blot.RESULTS: The mRNA level of Egr-1 in cerebral cortex of HDC-KO mice was significantly lower than that in WT mice, while exogenous histamine induced the mRNA expression of Egr-1 in HDC-KO mice. In cultured astrocytes, histamine induced the mRNA expression of Egr-1. The maximum increase in the mRNA level of Egr-1 was produced by histamine at concentration of 10-5mol/L. In addition, histamine-induced Egr-1 mRNA accumulation peaked at 30 min after commencing stimulation, while histamine significantly increased Egr-1 protein expression at 60 min. Furthermore, histamine-induced Egr-1 expression was inhibited by H1receptor antagonist but not H2receptor antagonist.CONCLUSION: Histamine up-regulates the Egr-1 expression in cerebral cortex and cultured astrocytes, which may attribute to H1receptor activation.

Histamine; Early growth response factor-1; Astrocytes

1000- 4718(2016)04- 0680- 06

2015- 09- 30

2016- 03- 10

國家自然科學基金資助項目(No. 81202520)；高等學校博士學科點專項科研基金(No. 20121417120002)；山西省青年科技研究基金(No. 2014021038-1)；山西醫(yī)科大學博士啟動基金(No. 03201104)；山西醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院331基礎醫(yī)學科技培植基金(No. 201230)

Tel: 0351-4135079； E-mail: fyanying6@hotmail.com

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