羅　綦，　陳建斌

(重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院血液科，重慶 400016)

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阿霉素誘導下多發(fā)性骨髓瘤細胞中自噬和氧化應激的相互作用*

羅綦，陳建斌△

(重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院血液科，重慶 400016)

目的： 探討阿霉素(doxorubicin，DOX)誘導對多發(fā)性骨髓瘤細胞系RPMI-8226細胞內(nèi)自噬和活性氧簇(reactive oxidative species，ROS)生成的影響及其相互作用關(guān)系。方法: 不同濃度阿霉素誘導RPMI-8226細胞24 h, 采用Western blot技術(shù)檢測細胞內(nèi)beclin 1、LC3等自噬相關(guān)蛋白的表達水平。采用DCFH-DA 熒光染色法檢測RPMI-8226細胞內(nèi)ROS的水平，熒光顯微鏡采集圖像。采用氧自由基清除劑N-乙酰半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine，NAC)及tempol處理RPMI-8226細胞后，通過Western blot技術(shù)檢測阿霉素誘導下細胞內(nèi)beclin 1、LC3等蛋白的表達水平。采用自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine，3-MA)處理PRMI-8226細胞后，檢測阿霉素誘導下細胞內(nèi)ROS和凋亡的表達水平。結(jié)果: RPMI-8226細胞內(nèi)beclin 1和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表達水平呈阿霉素劑量依賴性增加，當阿霉素誘導濃度達2 mg/L時，與對照組比較顯著增加(P<0.05)。采用2 mg/L阿霉素處理RPMI-8226細胞，通過熒光顯微鏡觀察，ROS水平較對照組明顯增加。氧自由基清除劑NAC和tempol處理RPMI-8226細胞后，beclin 1和LC3Ⅱ/Ⅰ的表達水平較阿霉素處理組下降。采用自噬抑制劑3-MA處理細胞后，RPMI-8226細胞內(nèi)ROS和凋亡的水平較阿霉素處理組及對照組增加。結(jié)論: 阿霉素能增加RPMI-8226細胞內(nèi)自噬和ROS的生成，抑制自噬能增加阿霉素誘導下ROS和凋亡的水平，抑制ROS后能減少阿霉素誘導下多發(fā)性骨髓瘤細胞中的自噬。

多發(fā)性骨髓瘤； 阿霉素； 自噬； 活性氧簇

多發(fā)性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)是一種漿細胞惡性腫瘤，臨床表現(xiàn)為骨痛、貧血、腎功能不全和免疫力低下等[1-3]。近年來，雖新型藥物的應用和造血干細胞移植使MM患者生存期較前延長，但聯(lián)合化療仍是治療MM的主要手段[4-5]。阿霉素(doxorubicin，DOX)為蒽環(huán)素類抗生素，是目前用于治療MM聯(lián)合化療的常用藥物。自噬(autophagy)是一種溶酶體依賴的降解路徑。在正常生理狀態(tài)下，有利于細胞保持自身穩(wěn)態(tài)。在腫瘤形成后，自噬為腫瘤細胞提供更豐富的營養(yǎng)，促進腫瘤生長[6]。3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine，3-MA)作為磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)抑制劑，對自噬能明顯起到抑制作用。細胞內(nèi)的活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)作為新陳代謝產(chǎn)物在各類細胞中不斷產(chǎn)生和清除，而且在不同的細胞中ROS生成的水平是不相同的，更為重要的是相對于腫瘤細胞，相應的正常細胞中本底的ROS水平更低[7-8]。線粒體在正常氧化呼吸時會產(chǎn)生少量的ROS，但研究顯示，中、高度的ROS產(chǎn)生導致ROS胞內(nèi)蓄積引起氧化應激反應。研究顯示ROS產(chǎn)生通過增加線粒體膜通透性直接啟動凋亡[9-10]。N-乙酰-L-半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine，NAC)是一類含巰基的化合物，具有抑制自由基的生成、清除已產(chǎn)生的自由基、調(diào)節(jié)細胞活性、防止DNA損傷等功能。Tempol是一種超氧化物清除劑，具有神經(jīng)保護、抗炎癥和鎮(zhèn)痛效果[11]。本研究顯示阿霉素誘導下多發(fā)性骨髓瘤細胞自噬相關(guān)蛋白表達增加，ROS水平增高。但自噬和ROS在阿霉素誘導的多發(fā)性骨髓瘤細胞中的相互作用尚不清楚。本文通過采用自噬抑制劑3-MA和氧自由基清除劑NAC、tempol闡明阿霉素誘導下多發(fā)性骨髓瘤細胞中自噬和ROS的相互作用。

材　料　和　方　法

1主要試劑和儀器

RPMI-8226細胞系由上海第二軍醫(yī)大學長征醫(yī)院血液科侯健教授惠贈。RPMI-1640和胎牛血清(Gibco)；二甲基亞砜、阿霉素、3-MA、NAC、tempol、抗β-actin抗體及HRP標記的羊抗兔IgG II抗(Sigma)；抗beclin 1抗體和抗LC3抗體(CST)。

2方法

2.1細胞培養(yǎng)RPMI-8226細胞于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，在37 ℃ 、5 % CO2及飽和濕度條件下傳代培養(yǎng)，每2～3 d換液1次。選取對數(shù)生長期細胞進行實驗。以未加任何處理的細胞作為正常對照組。

2.2Western blot檢測beclin 1和LC3蛋白表達按上述分組處理細胞后，收集各組細胞，PBS清洗細胞2次后，1 000×g離心 3 min，去上清，加入RIPA裂解液，裂解20 min，4 ℃、12 000×g離心20 min，收集上清，BCA法測定蛋白濃度。取50 μg總蛋白經(jīng)SDS-PAGE分離，將蛋白電轉(zhuǎn)至PVDF膜上。封閉液(5%脫脂牛奶)室溫封閉2 h，加入 I 抗(beclin 1 1∶1 000，LC3 1∶1 000，β-actin 1∶5 000)，4 ℃ 搖床孵育過夜。次日TBST洗膜3次，室溫孵育II抗(1∶5 000) 1 h，ECL化學發(fā)光試劑盒(Pierce)顯色，曝光，保存圖片。

2.3DCFH-DA熒光探針檢測細胞內(nèi)總ROS的變化處理細胞后，加入DCFH-DA熒光染料，37 ℃培養(yǎng)30 min 后，收集細胞，PBS清洗3次，加入新鮮培養(yǎng)基，熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。

2.4流式細胞術(shù)Annexin V/PI雙標法檢測細胞凋亡細胞處理結(jié)束后，PBS 清洗 2 次，將細胞重懸于 300 μL 70%乙醇中，送重慶醫(yī)科大學生命科學院按Annexin V/PI試劑盒說明檢測細胞凋亡。

3統(tǒng)計學處理

所有實驗均重復3次，計量資料采用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示。采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行分析。多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間兩兩比較采用Bonferroni檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié)　　果

1阿霉素處理下 RPMI-8226細胞LC3和Beclin 1的表達水平

與對照組相比，阿霉素處理組中2 mg/L及以上組beclin 1的表達明顯增加(P<0.05)。阿霉素處理組LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表達水平較對照組表達增加，阿霉素處理濃度達2 mg/L時，差異有統(tǒng)計學顯著性(P<0.05),見圖1。

2阿霉素處理下RPMI-8226細胞ROS的表達水平

與對照組相比，阿霉素處理組RPMI-8226細胞的ROS生成水平較對照組明顯增加,見圖2。

3抗氧化劑NAC和tempol處理下beclin 1及LC3的表達

單純阿霉素(2 mg/L)處理組較對照組beclin 1和LC3 II/I表達水平增加，差異有統(tǒng)計學顯著性(P<0.05)。加入抗氧化劑NAC (5 mmol/L)或tempol(2 mmol/L)預處理 RPMI-8226細胞2 h后，beclin 1及LC3 II/I表達較阿霉素組明顯降低(P<0.05),見圖3。

Figure 1.The protein levels of beclin 1 and LC3 in RPMI-8226 cells after stimulated with doxorubicin (DOX) detected by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 mg/L;#P<0.05vs2 mg/L.

圖1阿霉素誘導RPMI-8226細胞后beclin 1和LC3蛋白表達的變化

Figure 2.ROS levels in RPMI-8226 cells after stimulated with doxorubicin (DOX) (DCFH-DA staining,×100). Ctr: control.

圖2阿霉素誘導RPMI-8226細胞后ROS生成的變化

43-MA處理下 RPMI-8226細胞ROS生成的變化

阿霉素處理組的ROS生成較對照組明顯增加，阿霉素+NAC組的ROS生成較阿霉素處理組明顯減少。阿霉素+3-MA(5 mmol/L)處理組的ROS生成與阿霉素處理組比較明顯增加,見圖4。

53-MA處理下RPMI-8226 細胞凋亡的變化

阿霉素處理組的凋亡水平較對照組明顯增加，阿霉素+3-MA(5 mmol/L)處理組的凋亡水平較阿霉素處理組明顯增加，差異均有統(tǒng)計學顯著性(P<0.05),見圖5。

討　　論

研究顯示，多發(fā)性骨髓瘤是最常見的漿細胞克隆性血液系統(tǒng)腫瘤，在血液系統(tǒng)腫瘤中發(fā)病率為10%～15%，近年來發(fā)現(xiàn)其發(fā)病年齡呈現(xiàn)年輕化趨勢[1, 12]。隨著經(jīng)濟的發(fā)展，現(xiàn)已出現(xiàn)許多治療多發(fā)性骨髓瘤疾病的新藥，但在化療藥物聯(lián)合用藥中，阿霉素仍起著非常重要的作用[7]。本實驗以阿霉素誘導多發(fā)性骨髓瘤RPMI-8226細胞作為體外模型，研究阿霉素誘導下ROS與自噬在RPMI-8226細胞中的相互作用。

細胞受到應激性的死亡威脅時，自噬通過將細胞內(nèi)受損、變性或衰老的蛋白質(zhì)以及細胞器運輸?shù)饺苊阁w進行消化降解從而保持細胞的存活，是真核細胞維持穩(wěn)態(tài)、實現(xiàn)更新的一種重要的進化保守機制[6, 13]。研究表明在惡性血液病化療中，腫瘤細胞激活自噬是腫瘤細胞逃避化療藥物殺傷的可能機制[14, 20-22]。Eretmer 等[23]報道在慢性粒細胞白血病中，可能通過抑制PI3K-AKT-mTORC1通路激活自噬，導致伊馬替尼對白血病細胞的殺傷作用減弱。本研究顯示阿霉素誘導下RPMI-8226細胞中自噬相關(guān)蛋白表達增加，采用3-MA抑制自噬后阿霉素誘導下RPMI-8226細胞凋亡較單用阿霉素增加，說明自噬能減少阿霉素對RPMI-8226細胞的殺傷作用。

Figure 3.The protein levels of beclin 1 and LC3 after stimulated with doxorubicin (DOX) and pretreated with tempol orN-acetyl-L-cysteine (NAC) determined by Western blot. Ctr: control. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsCtr;#P<0.05vsDOX.

圖3RPMI-8226在抗氧化劑Tempol及NAC處理下beclin1及LC3的表達

Figure 4.ROS levels in RPMI-8226 cells (DCFH-DA staiing,×100). Ctr: control; DOX: doxorubicin; 3-MA: 3-methyladenine; NAC:N-acetyl-L-cysteine.

圖4RPMI-8226細胞ROS的水平

ROS是生物體有氧代謝產(chǎn)生的一類活性含氧化合物的總稱，細胞內(nèi)ROS介導很多細胞生理和病理反應，ROS可作為一種細胞內(nèi)信號分子參與細胞自噬的激活[24]。近年臨床及基礎(chǔ)研究都顯示高水平的ROS可導致細胞的凋亡[17-20]。在骨髓間充質(zhì)干細胞中，過氧化氫(H2O2)可使骨髓間充質(zhì)干細胞凋亡增加[25]。本研究發(fā)現(xiàn)阿霉素能誘導多發(fā)性骨髓瘤細胞內(nèi)ROS產(chǎn)生增加。阿霉素可能通過增加多發(fā)性骨瘤RPMI-8226細胞內(nèi)ROS的生成，從而促進RPMI-8226細胞的凋亡。自噬能有效緩解細胞內(nèi)ROS產(chǎn)生從而發(fā)揮其促生存的作用[15-16]。為闡明阿霉素誘導下RPMI-8226細胞內(nèi)ROS和自噬的相互影響，我們采用NAC及Tempol抑制細胞內(nèi)ROS，發(fā)現(xiàn)阿霉素+NAC組及阿霉素+Tempol組細胞內(nèi)自噬相關(guān)蛋白beclin1和LC3 II/I較阿霉素組表達下降。采用自噬特異性抑制劑3-MA預處理RPMI-8226細胞，阿霉素誘導下RPMI-8226細胞內(nèi)ROS和凋亡增加。這說明減輕多發(fā)性骨髓瘤RPMI-8226細胞內(nèi)的ROS水平，細胞內(nèi)自噬水平相應地減少。

Figure 5.The changes of apoptotic rate after blockadge of autophagy. Ctr: control; DOX: doxorubicin; 3-MA: 3-methyladenine. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsCtr;#P<0.05vsDOX.

圖5抑制自噬后細胞凋亡水平的變化

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)阿霉素可同時誘導多發(fā)性骨髓瘤細胞中ROS和自噬的發(fā)生。抑制阿霉素誘導下多發(fā)性骨髓瘤細胞內(nèi)ROS時，細胞內(nèi)自噬相關(guān)蛋白表達下降。運用自噬抑制劑3-MA處理阿霉素誘導下的多發(fā)性骨髓瘤細胞，其ROS的生成增加，同時細胞凋亡增加，說明ROS可誘導細胞內(nèi)自噬產(chǎn)生，自噬通過降解細胞內(nèi)ROS減少細胞凋亡。為深入研究阿霉素治療多發(fā)性骨髓瘤的耐藥機制提供了新的方向。

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(責任編輯： 盧萍， 羅森)

Crosstalk of autophagy and ROS in multiple myeloma cells stimulated with doxorubicin

LUO Qi, CHEN Jian-bin

(DepartmentofHematology,TheFirstAffiliatedHospitalofChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016,China.E-mail:cqchenjianbin2007@126.com.cn)

AIM: To investigate the relationship of autophagy and reactive oxygen species (ROS) in multiple myeloma cell line RPMI-8226 stimulated with doxorubicin. METHODS: The RPMI-8226 cells were stimulated with doxorubicin at different doses, and untreated cells were used as control. The protein expression of beclin 1 and LC3 was detected by Western blot. ROS production was analyzed by DCFH-DA fluorescence staining. After treated with or without 3-methyladenine (3-MA), the ROS production and apoptosis in RPMI-8226 cells were determined by DCFH-DA and flow cytometry, respectively. After treated with or without antioxidants tempol andN-acetyl-L-cysteine (NAC), the expression of beclin 1 and LC3 in RPMI-8226 cells was determined by Western blot. RESULTS: The protein levels of beclin 1 and LC3Ⅱ/LC3Ⅰ were increased in the RPMI-8226 cells stimulated with doxorubicin compared with untreated group. The ROS production was increased in the RPMI-8226 cells stimulated with 2 mg/L doxorubicin compared with untreated group. After treated with 3-MA, the ROS production and apoptosis in the RPMI-8226 cells stimulated with doxorubicin were increased compared with doxorubicin group. After treated with antioxidant NAC or tempol, the expression of beclin 1 and LC3 II/I in the RPMI-8226 cells stimulated with doxorubicin was decreased compared with doxorubicin group.CONCLUSION: The autophagy and ROS levels are increased in RPMI-8226 cells stimulated with doxorubicin. Inhibition of autophagy increases the ROS production and apoptosis of RPMI-8226 cells stimulated with doxorubicin. Inhibition of ROS production reduces doxorubicin-induced autophagy in multiple myeloma cells.

Multiple myeloma; Doxorubicin; Autophagy; Reactive oxygen species

1000- 4718(2016)04- 0665- 06

2015- 11- 20

2016- 03- 17

重慶市衛(wèi)生計生委醫(yī)學科研計劃項目(No. 2011-1-032)

Tel: 023-89011522; E-mail: cqchenjianbin2007@126.com.cn

R730.23

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.04.014

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