潘　斌,　鄧志海，　吳友科，　梁蔚波，　曾傳蓉，　劉海平△

(1暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院泌尿外科，廣東 廣州 510632； 2連平縣第二人民醫(yī)院外科，廣東 河源 517139)

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沉默URG11基因?qū)η傲邢侔㎜NCaP細(xì)胞增殖、遷移與侵襲的影響*

潘斌1,鄧志海1，吳友科2，梁蔚波1，曾傳蓉2，劉海平2△

(1暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院泌尿外科，廣東 廣州 510632；2連平縣第二人民醫(yī)院外科，廣東 河源 517139)

目的： 觀察上調(diào)基因11(up-regulated gene 11,URG11)在前列腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)及降低URG11表達(dá)對人前列腺癌LNCaP細(xì)胞增殖和侵襲能力的影響。方法：用real-time PCR和Western blot檢測前列腺癌細(xì)胞系和正常前列腺上皮細(xì)胞系中URG11 mRNA和蛋白水平；設(shè)計(jì)針對URG11基因的siRNA靶序列，轉(zhuǎn)染LNCaP細(xì)胞，采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期和凋亡，MTS測定LNCaP細(xì)胞增殖能力，劃痕和侵襲實(shí)驗(yàn)評價LNCaP細(xì)胞遷移及侵襲能力。結(jié)果：在LNCaP、DU145、PC3前列腺癌細(xì)胞系和RWPE-1正常前列腺上皮細(xì)胞系中URG11 mRNA和蛋白表達(dá)水平存在顯著差異，在前列腺癌細(xì)胞中URG11 mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)。 與對照組相比，轉(zhuǎn)染URG11 siRNA的LNCaP細(xì)胞增殖停滯在G1/S期并誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞凋亡，轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞凋亡率為8.79%±0.12%，而且LNCaP腫瘤細(xì)胞的遷移及侵襲能力明顯下降(P<0.05)。結(jié)論： URG11在前列腺癌系中高表達(dá)。通過RNAi沉默URG11基因能明顯抑制LNCaP細(xì)胞增殖和侵襲能力，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

上凋基因11； 前列腺癌； RNA干擾； 腫瘤侵襲

上調(diào)基因11(up-regulated gene 11,URG11)基因位于人類11號染色體長臂，編碼一種70 kD的蛋白，含有5個VWFC結(jié)構(gòu)域和1個C型植物凝集素結(jié)構(gòu)域，這些結(jié)構(gòu)域主要的功能是調(diào)節(jié)細(xì)胞的黏附、遷移、相互作用以及與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)密切相關(guān)[1- 2]。有研究證實(shí)URG11在肝癌、胃癌和腸癌等多種腫瘤細(xì)胞和組織中過表達(dá)，并可促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展，被認(rèn)為是細(xì)胞生長的一個調(diào)節(jié)因子。我們前期實(shí)驗(yàn)通過免疫組化方法證實(shí)URG11在前列腺癌組織中過表達(dá)，且與前列腺癌的Gleason評分及臨床分期正相關(guān)，與前列腺癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[3]。但URG11基因在前列腺癌細(xì)胞中的功能尚缺乏深入研究。本研究分析URG11在前列腺癌癌細(xì)胞系及其正常前列腺細(xì)胞中的表達(dá)情況，并進(jìn)一步通過RNAi技術(shù)觀察降低URG11基因表達(dá)對LNCaP前列腺癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的影響。

材　料　和　方　法

1材料和試劑

人前列腺癌細(xì)胞系LNCaP和DU145由暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室保存，人前列腺癌細(xì)胞系PC3由南方醫(yī)科大學(xué)附屬南方醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室惠贈及人永生化前列腺上皮細(xì)胞系RWPE-1由廣州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)室惠贈。RPMI-1640培養(yǎng)液和胎牛血清購自HyClone；Transwell細(xì)胞培養(yǎng)板(BD)；TRIzol試劑和Lipofectamine 2000(Invitrogen)；URG11多克隆抗體購自GengTex；Matrigel基質(zhì)膠和流式細(xì)胞儀(BD)；SYBR Green PCR Master Mix (Toyobo)；ABI 7500 全自動熒光定量PCR儀(ABI)。

2細(xì)胞培養(yǎng)

所有細(xì)胞置于RPMI-1640培養(yǎng)液中，5% CO2、37 ℃，飽和濕度條件下恒溫培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行檢測。

3Real-time PCR檢測LNCaP、DU145、PC3前列腺癌細(xì)胞和永生化前列腺上皮細(xì)胞系RWPE-1中URG11的mRNA表達(dá)

組織RNA按照TRIzol試劑說明書提取，并用紫外分光光度計(jì)檢測RNA濃度及純度。引物由上海生工公司合成。URG11的上游引物為 5’- TGAATCAAGGAGTCGCTGGAC-3’，下游引物為 5’-GCATCTCACTGGAACACAAG-3’； GAPHD為內(nèi)參照, 上游引物為 5’-CAACGGATTTGGTCGTATTGGG-3’，下游引物為 5’-CCTGGAAGATGGTGATGGGATT-3’。取總RNA 1 μg，采用Toyobo的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。反應(yīng)條件如下：95 ℃ 5 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s，共40個循環(huán)。每個樣品實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。以2-ΔΔCt法計(jì)算mRNA的表達(dá)量。

4細(xì)胞轉(zhuǎn)染

待細(xì)胞融合至50%，采用Lipofectamine 2000方法轉(zhuǎn)染。URG11 siRNA由Sigma提供。siRNA干擾效率篩選實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示3條序列中以URG11 siRNA 50 nmol/L的抑制效率最高。本實(shí)驗(yàn)共分3個組。轉(zhuǎn)染組：以抑制作用最強(qiáng)的URG11 siRNA轉(zhuǎn)染LNCaP細(xì)胞；陰性對照組:以陰性對照siRNA轉(zhuǎn)染LNCaP細(xì)胞；空白對照組：既不加入Lipofectamine 2000也不加入siRNA，同步進(jìn)行實(shí)驗(yàn)[4]。

5實(shí)時熒光定量PCR測定轉(zhuǎn)染后各組LNCaP細(xì)胞URG11 mRNA表達(dá)水平

方法同前。URG11上游引物為5’-CTTCAGCACTTTCCATGATG-3’，下游引物為5’-AGGGCTGTGGAGAGTCTAGA-3’； 18S rRNA上游引物為5’-CCTGGATACCGCAGCTAGGA-3’，下游引物為5’-GCGGCGCAATACGAATGCCCC-3’。

6Western blot檢測LNCaP、DU145、PC3前列腺癌細(xì)胞和永生化前列腺上皮細(xì)胞RWPE-1的URG11蛋白表達(dá)及轉(zhuǎn)染后各組LNCaP細(xì)胞URG11 蛋白表達(dá)水平

提取總蛋白并測其濃度。進(jìn)行SDS-PAGE，PVDF膜5%的脫脂奶粉封閉，TBST液洗滌，加Ⅰ抗(URG11兔抗人多克隆抗體和內(nèi)參照GAPHD單克隆抗體)4℃孵育過夜，加Ⅱ抗室溫避光孵育，洗膜后加底物化學(xué)發(fā)光顯影。用Quantity One圖像分析軟件進(jìn)行條帶灰度掃描，分析結(jié)果。

7MTS法檢測轉(zhuǎn)染后LNCaP細(xì)胞增殖

取對數(shù)生長轉(zhuǎn)染后細(xì)胞，收集各組各時點(diǎn)的細(xì)胞(0、24、48、72 h)加入CellTiter 96 AQueous單溶液細(xì)胞增殖檢測試劑(Promega)，比例為1∶10。孵育4 h后，酶標(biāo)儀讀板，MTS檢測讀取A490數(shù)據(jù)。

8流式細(xì)胞術(shù)檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞凋亡

細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后每樣收集1×106細(xì)胞，加入1.25 μL Annexin V-FITC，室溫1 000×g離心5 min，去上清，將細(xì)胞用0.5 mL的1×結(jié)合緩沖液輕輕重懸，加入10 μL PI，用流式細(xì)胞儀檢測分析。

9流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期

細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后收集1×106細(xì)胞，PBS洗2次， 70%乙醇，4 ℃固定過夜，加入500 μL PBS含50 mg/L PI，100 mg/L RNase A，0.2% Triton X-100，4 ℃避光孵育30 min。以標(biāo)準(zhǔn)程序用流式細(xì)胞儀檢測，一般計(jì)數(shù)(2～3)×104個細(xì)胞，結(jié)果用細(xì)胞周期擬和軟件ModFit分析。

10Transwell檢測細(xì)胞侵襲能力

收集各處理組細(xì)胞，計(jì)數(shù)1×105細(xì)胞，Matrigel在Transwell小室成膠后，用100 μL無血清培養(yǎng)基重懸，加入Transwell細(xì)胞培養(yǎng)板的小室上室。在37 ℃、5%CO2孵育24 h后，取出小室，4%多聚甲醛固定20 min，PBS洗滌1次，結(jié)晶紫染色10 min，PBS洗滌1次，顯微鏡下觀察細(xì)胞是否穿過小孔，如有穿過終止其它實(shí)驗(yàn)組，并拍照統(tǒng)計(jì)使用正置顯微鏡進(jìn)行觀察,200倍光鏡5個視野計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞個數(shù),并計(jì)算平均每個視野的穿膜細(xì)胞數(shù),每組重復(fù)3次。

11細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)

將處于對數(shù)生長期的濃度約為1×109/L細(xì)胞，制成懸液均勻接種于6孔培養(yǎng)板中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。 對照組用無血清RMPI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)組分別用含藥的無血清RMPI-1640培養(yǎng)基進(jìn)行干預(yù)。分別于劃痕后0、6、24、48 h取樣，拍照。在倒置顯微鏡下觀察劃痕愈合情況。Image-Pro Plus 6.0軟件測量各組細(xì)胞相同時點(diǎn)任意8個部位劃痕寬度，計(jì)算細(xì)胞遷移率以反映各組細(xì)胞運(yùn)動遷移能力。

12統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，兩樣本比較采用t檢驗(yàn)，多樣本均數(shù)的比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)　　果

1Real-time PCR檢測URG11基因在前列腺癌細(xì)胞系和正常前列腺上皮細(xì)胞系的mRNA表達(dá)水平

URG11在LNCaP、DU145、PC3前列腺癌細(xì)胞系和RWPE-1細(xì)胞系的real-time PCR相對定量分別為19.94±0.76、8.96±0.31、7.73±0.36和1.00±0.00，各前列腺癌細(xì)胞系中URG11的mRNA均較RWPE-1細(xì)胞系高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖1。這說明URG11基因水平在前列腺癌細(xì)胞中高度表達(dá)。

Figure 1.Expression of URG11 mRNA in prostate cancer cell lines and normal prostate epithelial cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsRWPE-1 group.

圖1URG11 mRNA在前列腺癌細(xì)胞和前列腺上皮細(xì)胞中的相對表達(dá)量

2Western blot檢測URG11在前列腺癌細(xì)胞系和正常前列腺上皮細(xì)胞系的表達(dá)水平

前列腺癌細(xì)胞系LNCaP、DU145、PC3和永生化前列腺上皮細(xì)胞系RWPE-1中URG11蛋白表達(dá)強(qiáng)弱有差異，其中LNCaP表達(dá)最高，DU145和PC3表達(dá)次之，RWPE-1表達(dá)最弱，見圖2。

Figure 2.Expression of URG11 protein in prostate cancer cell lines and normal prostate epithelial cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsRWPE-1 group.

圖2URG11蛋白在前列腺癌細(xì)胞系和正常前列腺上皮細(xì)胞系中的表達(dá)差異

3Western blot檢測URG11干擾后LNCaP前列腺癌細(xì)胞的表達(dá)水平

干擾后，LNCaP前列腺癌細(xì)胞中URG11蛋白表達(dá)被抑制，見圖3。

4觀察URG11干擾后對LNCaP腫瘤細(xì)胞增殖的影響

干擾URG11之后，LNCaP細(xì)胞生長受到抑制。進(jìn)一步計(jì)算各時點(diǎn)、各處理組的增殖率，組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。進(jìn)一步，通過毒性分析也可以看出干擾URG11之后，細(xì)胞毒性增強(qiáng)，死亡細(xì)胞增加，見圖3。

5觀察URG11干擾后對LNCaP腫瘤細(xì)胞細(xì)胞周期及凋亡率的影響

抑制URG11基因后，腫瘤細(xì)胞停留在G1期的比例明顯增加，抑制細(xì)胞分化增殖。進(jìn)一步，通過Annexin V/PI染色檢測細(xì)胞凋亡，可明顯看到凋亡細(xì)胞增加，見圖4、5。

Figure 3.The growth of LNCaP cells transfected withURG11 siRNA. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsNC siRNA group.

圖3抑制URG11基因?qū)NCaP細(xì)胞增殖的影響

Figure 4.The cell cycle of LNCaP cells transfected withURG11 siRNA detected by flow cytometry.

圖4抑制URG11基因?qū)NCaP細(xì)胞細(xì)胞周期的影響

Figure 5.The apoptosis of LNCaP cells transfected withURG11 siRNA detected by flow cytometry. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsNC siRNA group.

圖5抑制URG11基因?qū)NCaP細(xì)胞凋亡的影響

6劃痕實(shí)驗(yàn)觀察URG11干擾后對LNCaP腫瘤細(xì)胞遷移的影響

劃痕實(shí)驗(yàn)顯示，正常生長的腫瘤細(xì)胞及NC siRNA干擾對照組的腫瘤細(xì)胞在劃痕48 h后逐漸愈合，劃痕變小。而URG11干擾后，劃痕不會愈合，甚至因?yàn)榧?xì)胞凋亡而劃痕間隙變大。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，干擾URG11隨時點(diǎn)影響LNCaP腫瘤細(xì)胞的遷移，見圖6。

7Transwell遷移實(shí)驗(yàn)檢測URG11干擾后對LNCaP腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲的影響

將LNCaP腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)于Transwell系統(tǒng)內(nèi)，于48 h后固定細(xì)胞染色。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，干擾URG11后，細(xì)胞的遷移及侵襲能力明顯下降，見圖7、8。

討　　論

URG11作為乙肝病毒X蛋白的效應(yīng)器而且能夠促進(jìn)肝癌的進(jìn)展，同時亦證實(shí)除了肝癌，在其它腫瘤中表達(dá)上調(diào)，在胃癌、結(jié)腸癌、肺癌、食管癌和乳腺癌URG11蛋白的表達(dá)要比癌旁組織高，URG11在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展起一定的作用[5-6]。但目前URG11 在前列腺癌組織和細(xì)胞中表達(dá)及相關(guān)研究報道甚少。前期實(shí)驗(yàn)證實(shí)URG11在前列腺癌組織中高表達(dá)，陽性表達(dá)率為70.6%，且與前列腺癌的Gleason評分、TNM分期呈正相關(guān)，與前列腺癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[3]。

本研究中，我們進(jìn)一步檢測URG11在前列腺癌系和正常前列腺上皮細(xì)胞中mRNA和蛋白的表達(dá)，顯示前列腺癌系細(xì)胞URG11 mRNA和蛋白水平均較永生化前列腺上皮細(xì)胞明顯上調(diào)。此外，我們還可以注意到前列腺癌細(xì)胞之間URG11 mRNA和蛋白的表達(dá)也是存在差異的，這很可能是由于不同前列腺癌細(xì)胞本身所具有的不同特性所決定的。我們認(rèn)為URG11可能參與了早期前列腺癌的形成發(fā)展，因大多數(shù)前列腺癌早期都是雄激素依賴型，同時這也為在雄激素信號通路以外探尋前列腺癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制提供了一種新的途徑。

URG11作為類似細(xì)胞生長調(diào)節(jié)因子，對前列腺癌細(xì)胞中的生物學(xué)如何影響，仍未明了，我們設(shè)計(jì)了URG11的小分子干擾片段并轉(zhuǎn)染URG11高表達(dá)的 LNCaP細(xì)胞，使前列腺癌細(xì)胞增殖停滯在G1/S期并誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞分化增殖，說明URG11基因在前列腺癌細(xì)胞系中高表達(dá)，可增強(qiáng)前列腺癌細(xì)胞的增殖能力，促進(jìn)腫瘤的發(fā)展。抑制LNCaP前列腺癌細(xì)胞中URG11表達(dá)，細(xì)胞劃痕不會愈合，甚至因?yàn)榧?xì)胞凋亡而劃痕間隙變大，干擾URG11隨時間影響LNCaP腫瘤細(xì)胞的遷移，細(xì)胞的遷移及侵襲能力明顯下降，表明下調(diào)URG11表達(dá)，可抑制前列腺癌細(xì)胞生長，為前列腺癌基因靶向治療提供新的靶點(diǎn)。

Figure 6.The migration ability of LNCaP cells transfected withURG11 siRNA detected by wound-healing assay. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsNC siRNA group.

圖6劃痕實(shí)驗(yàn)觀察抑制URG11基因?qū)NCaP細(xì)胞遷移的影響

Figure 7.The migration ability of LNCaP cells transfected withURG11 siRNA detected by Transwell migration assay. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsNC siRNA group.

圖7Transwell實(shí)驗(yàn)觀察抑制URG11基因?qū)NCaP細(xì)胞遷移的影響

Figure 8.The invasion ability of LNCaP cells transfected withURG11 siRNA by Transwell invasion assay. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsNC siRNA group.

圖8Transwell實(shí)驗(yàn)觀察抑制URG11基因?qū)NCaP細(xì)胞侵襲的影響

Lian 等[5]研究發(fā)現(xiàn)URG11也能促進(jìn)肝癌細(xì)胞系的生長、增殖及分化，亦同樣加速肝癌細(xì)胞由G1期向S期發(fā)展，用siRNA干擾URG11表達(dá)可以明顯抑制細(xì)胞非依賴性生長、集落形成能力。將URG11 siRNA注射到裸鼠的瘤體可以顯著腫瘤抑制的生長。有研究[7-8]利用RNA干擾技術(shù)下調(diào)URG11基因的表達(dá)，可以使胃癌細(xì)胞增殖停滯，明顯抑制腫瘤細(xì)胞的生長。Fan等[2]利用腺病毒介導(dǎo)轉(zhuǎn)染siRNA肝癌細(xì)胞，靶向沉默URG11基因后，結(jié)果顯示可抑制肝癌細(xì)胞G1期向S期進(jìn)展，cyclin D1、CDK4、 pRb 和Bcl-2表達(dá)也都降低，并誘導(dǎo)肝細(xì)胞癌凋亡和抑制增殖，抑制裸鼠的瘤體生長，認(rèn)為沉默URG11基因在體內(nèi)和體外均可抑制肝癌細(xì)胞的生長，其可作為肝癌分子治療新的靶點(diǎn)。

我們研究發(fā)現(xiàn)URG11在前列腺癌細(xì)胞高表達(dá)，通過抑制URG11表達(dá)，可顯著抑制前列腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，這為前列腺癌的基因治療提供新的思路，但對其具體調(diào)控的分子機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

[1]Lian Z, Liu J, Li L, et al. Up regulated expression of a unique gene by hepatitis B x antigen promotes hepatocellular growth and tumorigenesis[J]. Neoplasia, 2003, 5(3): 229-244.

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(責(zé)任編輯： 林白霜， 羅森)

Effect of URG11 gene silencing on proliferation and invasion abilities of human prostate cancer cells

PAN Bin1, DENG Zhi-hai1, WU You-ke2, LIANG Wei-bo1, ZENG Chuan-rong2, LIU Hai-ping2

(1DepartmentofUrology,FirstAffiliatedHospitalofJinanUniversity,Guangzhou510632,China;2DepartmentofSurgery,LianpingSecondPeople′sHospital,Heyuan517139,China.E-mail:urol8518@126.com)

AIM: To investigate the expression of up-regulated gene 11 (URG11) in prostate cancer cell line and the effect ofURG11 siNRA on the proliferation and invasion of human prostate cancer LNCaP cells. METHODS: The mRNA and protein levels of URG11 in prostate cancer cell lines and normal prostate epithelial cell line were evaluated by real-time PCR and Western blot. LNCaP cells were transfected with designed siRNA using the liposome method. The proliferation, apoptosis, migration and invasion abilities of the LNCaP cells were evaluated by MTS assay, flow cytometry,wound-healing assay and Transwell assay. RESULTS: The expression of URG11 at mRNA and protein levels in the DU145, PC3, LNCaP cell lines was significantly higher than that in RWPE-1 cell line. Compared with the control group, the proliferation of LNCaP cells withURG11 siRNA was stagnant in G1/S phase and induced apoptosis. The proliferation of LNCaP cells at 0 h, 24 h, 48 h and 72 h was inhibited afterURG11 expression was down-regulated (P<0.05). Transwell assay showed that migration (P<0.05) and invasion (P<0.05) were also inhibited. CONCLUSION: URG11 is highly expressed in prostate cancer. Silencing ofURG11 significantly inhibits the proliferation and invasion and induces apoptosis of LNCaP cells.

Up-regulated gene 11; Prostate cancer; RNA interference; Neoplasm invasion

1000- 4718(2016)04- 0658- 07

2015- 12- 23

2016- 02- 04

廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)技術(shù)研究基金資助項(xiàng)目(No. A2015557);中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金資助項(xiàng)目(No. 21613317)

Tel： 0762-4552861； E-mail： urol8518@126.com

R730.23

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.04.013

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