袁偉燕，　張　麗，　石紅琴，　龔小衛(wèi)，　姜　勇

(南方醫(yī)科大學(xué)病理生理學(xué)教研室，廣東省蛋白質(zhì)組學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510515)

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Prdx4蛋白表達(dá)改變對(duì)HeLa細(xì)胞遷移和侵襲的影響*

袁偉燕，張麗，石紅琴，龔小衛(wèi)△，姜勇△

(南方醫(yī)科大學(xué)病理生理學(xué)教研室，廣東省蛋白質(zhì)組學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510515)

目的： 觀察過(guò)氧化物還原酶4(peroxiredoxin 4，Prdx4)蛋白表達(dá)的改變對(duì)人宮頸癌HeLa細(xì)胞遷移和侵襲的影響。方法: 采用脂質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染法將表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.0-HA-Prdx4轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞；LV-Prdx4 RNAi重組病毒感染HeLa細(xì)胞，構(gòu)建Prdx4 shRNA HeLa細(xì)胞系沉默Prdx4的表達(dá)；用蛋白質(zhì)印跡法證實(shí)Prdx4蛋白表達(dá)水平的變化；應(yīng)用劃痕愈合實(shí)驗(yàn)和Transwell遷移及侵襲實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)細(xì)胞遷移及侵襲能力的變化。結(jié)果: pcDNA3.0-HA-Prdx4質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組HeLa細(xì)胞的Prdx4蛋白表達(dá)水平明顯上調(diào)(P<0.05)，而Prdx4 shRNA HeLa穩(wěn)定干擾細(xì)胞系Prdx4表達(dá)水平明顯下調(diào)(P<0.05)。Prdx4過(guò)表達(dá)組HeLa細(xì)胞的遷移和侵襲能力明顯增強(qiáng)，與空白對(duì)照組及空載體轉(zhuǎn)染組比較，差異顯著(P<0.01)。Prdx4表達(dá)干擾組HeLa細(xì)胞的遷移和侵襲能力明顯受到抑制，與空白對(duì)照組及陰性對(duì)照組比較，差異顯著(P<0.01)。結(jié)論: 上調(diào)Prdx4蛋白表達(dá)水平可促進(jìn)HeLa細(xì)胞的遷移和侵襲，在宮頸癌的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中可能起重要作用；下調(diào)Prdx4蛋白表達(dá)水平可以明顯抑制HeLa細(xì)胞的遷移和侵襲能力，Prdx4有可能成為臨床治療宮頸癌的一個(gè)潛在靶點(diǎn)。

宮頸癌； 過(guò)氧化物還原酶4； 細(xì)胞遷移； 細(xì)胞侵襲

宮頸癌是最常見(jiàn)的婦科惡性腫瘤之一，在發(fā)展中國(guó)家其發(fā)病率位居首位[1]，是全球女性癌癥相關(guān)死亡的第2大原因[2]。隨著人們對(duì)宮頸癌認(rèn)識(shí)程度的不斷加深、防癌普查的廣泛開(kāi)展以及治療方法的不斷改進(jìn)，發(fā)病率和死亡率有所下降，但腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移仍是死亡的主要原因[3]。癌癥治療失敗和腫瘤發(fā)生侵襲的重要原因是腫瘤細(xì)胞通過(guò)破壞基底膜的完整性，穿過(guò)細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)發(fā)生轉(zhuǎn)移[4]。有文獻(xiàn)報(bào)道，過(guò)氧化物還原酶4(peroxiredoxin 4，Prdx4)的表達(dá)水平與腫瘤密切相關(guān)，Prdx1和Prdx4在膀胱癌和肺癌組織中出現(xiàn)表達(dá)量增高[5]，Prdx3和Prdx4在前列腺癌組織中的表達(dá)量也增高[6-7]。同時(shí)有研究證實(shí)當(dāng)下調(diào)或敲除Prdx4的表達(dá)時(shí)，會(huì)導(dǎo)致胃癌組織的生長(zhǎng)受限和凋亡增多且會(huì)導(dǎo)致精原細(xì)胞的凋亡[8]。

目前，對(duì)于已發(fā)生轉(zhuǎn)移的宮頸癌，其治療方案主要是減輕患者痛苦。因此，非常有必要進(jìn)一步研究宮頸癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制，以發(fā)現(xiàn)新的靶點(diǎn)和治療方法。本研究采用脂質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染法使Prdx4過(guò)表達(dá)及RNA干擾(RNA interference，RNAi)技術(shù)抑制Prdx4的表達(dá)，觀察其對(duì)人宮頸癌HeLa細(xì)胞遷移和侵襲的影響，進(jìn)一步探討Prdx4在細(xì)胞遷移和侵襲中的作用及其作為分子靶點(diǎn)用于腫瘤治療的潛在價(jià)值。

材　料　和　方　法

1細(xì)胞及試劑

人宮頸癌細(xì)胞株HeLa和pcDNA3.0-HA質(zhì)粒載體(含有HA標(biāo)簽，可與重組目的基因共表達(dá)為融合蛋白)由本實(shí)驗(yàn)室保存。LV-Prdx4 RNAi和LV-control陰性對(duì)照重組病毒及嘌呤霉素由上海吉?jiǎng)P基因有限公司制備；脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Polyfect購(gòu)自Roche；兔抗鼠β-actin單克隆抗體和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG購(gòu)自CST；鼠抗人Prdx4多克隆抗體購(gòu)自Abcam；Transwell小室購(gòu)自BD；Matrigel invasion chamber購(gòu)自Corning；引物合成和DNA測(cè)序由深圳華大基因研究院完成。

2方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng)人宮頸癌細(xì)胞株HeLa用含10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)液，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)[9]。待細(xì)胞融合率達(dá)到70%～80%時(shí)，用0.25%胰蛋白酶消化并傳代，收集處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

2.2pcDNA3.0-HA-Prdx4過(guò)表達(dá)載體的構(gòu)建和測(cè)序結(jié)果及轉(zhuǎn)染方法pcDNA3.0-HA-Prdx4過(guò)表達(dá)載體的構(gòu)建和測(cè)序結(jié)果及轉(zhuǎn)染方法在前期工作中已描述[10]。

2.3慢病毒感染HeLa細(xì)胞并構(gòu)建Prdx4 shRNA HeLa穩(wěn)定表達(dá)系針對(duì)Prdx4基因的siRNA設(shè)計(jì)與篩選參照文獻(xiàn)[10]，其中hPrdx4 siRNA2的抑制效率最高，將此siRNA用于后續(xù)研究。HeLa細(xì)胞以3×103接種于96孔板，待細(xì)胞的融合率約為20%～30%進(jìn)行病毒感染，將LV-Prdx4 RNAi和LV-control陰性對(duì)照重組病毒(帶有嘌呤霉素抗性和綠色熒光報(bào)告基因)分別以復(fù)感染指數(shù)(MOI值)為10 的量感染細(xì)胞，加入polybrene(終濃度5 mg/L)，37 ℃培養(yǎng)2 d后加嘌呤霉素(500 mg/L)篩選陽(yáng)性克隆，待孔板中細(xì)胞長(zhǎng)至細(xì)胞克隆時(shí)，挑取單克隆擴(kuò)大培養(yǎng)，直至獲得需要的穩(wěn)定感染細(xì)胞株的細(xì)胞量后，裂解細(xì)胞并收集細(xì)胞上清液，檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)情況。

2.4蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)Prdx4蛋白的表達(dá)水平收集并裂解各組處理后的細(xì)胞，取總蛋白樣品各30 μg進(jìn)行SDS-PAGE。將在SDS-PAGE上分離的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上(恒壓100 V，90 min)，用5%脫脂奶粉封閉1 h，加入 I 抗鼠抗人Prdx4多克隆抗體(1∶2 000)，4 ℃過(guò)夜。TBST洗膜3次，再加入II抗HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG(1∶5 000)1 h。TBST洗膜3次，采用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)目的蛋白條帶的灰度值，以目的蛋白與內(nèi)參照β-actin條帶的灰度值之比表示目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

2.5細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞橫向遷移能力將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HeLa細(xì)胞按每孔3×105個(gè)的密度接種于6孔板內(nèi)，次日待細(xì)胞生長(zhǎng)至融合度約50%～60%時(shí)，將pcDNA3.0-HA-Prdx4重組質(zhì)粒和pcDNA3.0-HA空載體質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，另外將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Prdx4 shRNA HeLa細(xì)胞和control shRNA HeLa細(xì)胞按每孔4×105個(gè)的密度接種于6孔板內(nèi), 以未轉(zhuǎn)染的HeLa細(xì)胞作為空白對(duì)照組。次日，收集消化以上各組細(xì)胞，取每孔3×105個(gè)的密度接種于12孔板內(nèi)，待24 h后細(xì)胞融合度達(dá)到80%～90%，用200 μL槍頭垂直在細(xì)胞間橫豎2個(gè)方向各劃一道橫穿細(xì)胞的劃痕，更換培養(yǎng)基，24 h后，PBS清洗2次，顯微鏡下拍照，用Image-Pro Plus 軟件測(cè)定劃痕寬度，計(jì)算平均劃痕愈合率，以此反映細(xì)胞的橫向遷移能力。

2.6Transwell法檢測(cè)細(xì)胞縱向遷移能力及侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力另取以上在6孔板中收集消化的各組HeLa細(xì)胞各5×104個(gè)(用200 μL DMEM重懸成單細(xì)胞懸液)，分別接種于24孔板Transwell小室中，下室加入600 μL 含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，12 h后，用棉簽擦去上室中的細(xì)胞，4%多聚甲醛溶液固定細(xì)胞30 min，1%的結(jié)晶紫37 ℃染色30 min，雙蒸水洗至水清，將小室晾干后，在正置光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)目。各組侵入小室膜下層的細(xì)胞數(shù)表示細(xì)胞的遷移能力。同時(shí)取以上各組HeLa細(xì)胞各1×105個(gè)，用200 μL DMEM重懸成單細(xì)胞懸液，分別鋪入加有基質(zhì)凝膠的小室中，其余步驟同Transwell遷移實(shí)驗(yàn)，計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)目，取均值。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)3次以上，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。采用SPSS 13.0和GraphPad Prism 5統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)　　果

1LV-Prdx4-RNAi及LV-control重組病毒感染HeLa細(xì)胞，構(gòu)建Prdx4 shRNA HeLa穩(wěn)定表達(dá)系

將構(gòu)建好的LV-Prdx4-RNAi及LV-control重組病毒轉(zhuǎn)染至HeLa細(xì)胞，于倒置顯微鏡下觀察可以看到帶綠色熒光的人宮頸癌HeLa細(xì)胞克隆，挑單克隆繼續(xù)傳代培養(yǎng)，經(jīng)過(guò)嘌呤霉素篩選10 d后，得到了帶綠色熒光穩(wěn)定干擾的Prdx4 shRNA HeLa及control shRNA HeLa細(xì)胞,見(jiàn)圖1A。

2HeLa細(xì)胞轉(zhuǎn)染pcDNA3.0-HA-Prdx4后Prdx4表達(dá)水平顯著增高

蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)結(jié)果顯示，pcDNA3.0-HA-Prdx4轉(zhuǎn)染組、pcDNA3.0-HA陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組HeLa細(xì)胞中Prdx4蛋白表達(dá)水平之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05)；與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，pcDNA3.0-HA-Prdx4組HeLa細(xì)胞中的Prdx4蛋白表達(dá)水平顯著增高(P<0.05),見(jiàn)圖1B。

3Prdx4 shRNA HeLa穩(wěn)定干擾細(xì)胞可顯著下調(diào)Prdx4的表達(dá)

蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)結(jié)果顯示，Prdx4 shRNA HeLa、control shRNA HeLa和空白對(duì)照組之間Prdx4蛋白的表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05)；與空白對(duì)照及陰性對(duì)照組相比，Prdx4 shRNA HeLa組Prdx4的表達(dá)水平顯著降低(P<0.05),見(jiàn)圖1C。

Figure 1.The changes of Prdx4 protein expression in HeLa cells. A: establishment of a stablePrdx4 shRNA HeLa cell line (×100); B, C: Prdx4 protein expression in HeLa cells transfected with pcDNA3.0-HA-Prdx4 andPrdx4 shRNA HeLa cells was validated by western blotting.Mean±SD.n=3.*P<0.05vspcDNA3.0-HA-Prdx4;#P<0.05vsPrdx4 shRNA.

圖1HeLa細(xì)胞中Prdx4蛋白表達(dá)水平的變化

4過(guò)表達(dá)或下調(diào)Prdx4對(duì)HeLa細(xì)胞橫向遷移能力的影響

細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Prdx4過(guò)表達(dá)組之間的細(xì)胞劃痕愈合率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.01)；與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，Prdx4過(guò)表達(dá)組細(xì)胞的愈合明顯高于對(duì)照組(P<0.01)。另一方面，沉默Prdx4表達(dá)組之間的細(xì)胞劃痕愈合率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.01)；與空白對(duì)照組及陰性對(duì)照組相比，Prdx4 shRNA組的愈合率明顯低于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.01),見(jiàn)圖2。

Figure 2.The effects of the Prdx4 overexpression (A) and down-regulation (B) on the migration of HeLa cells detected by wound-healing assay (×100). Mean±SD.n=3.**P<0.01vspcDNA3.0-HA-Prdx4;##P<0.01vsPrdx4 shRNA.

圖2細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)過(guò)表達(dá)或下調(diào)Prdx4對(duì)HeLa細(xì)胞遷移能力的影響

5過(guò)表達(dá)或下調(diào)Prdx4對(duì)HeLa細(xì)胞縱向遷移能力的影響

Transwell遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Prdx4過(guò)表達(dá)組之間的穿膜細(xì)胞數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，Prdx4過(guò)表達(dá)組的穿膜細(xì)胞數(shù)明顯增多，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.01)。另一方面，沉默Prdx4表達(dá)組之間的穿膜細(xì)胞數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，Prdx4表達(dá)沉默組的穿膜細(xì)胞數(shù)明顯減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.01)，見(jiàn)圖3。

6過(guò)表達(dá)或下調(diào)Prdx4對(duì)HeLa細(xì)胞侵襲能力的影響

Transwell基質(zhì)膠侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Prdx4過(guò)表達(dá)組之間的穿膜細(xì)胞數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，Prdx4過(guò)表達(dá)組的細(xì)胞數(shù)明顯增多(P<0.01)。另一方面，沉默Prdx4表達(dá)之間的穿膜細(xì)胞數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與空白對(duì)照組及陰性對(duì)照組相比，Prdx4表達(dá)沉默組的穿膜細(xì)胞數(shù)明顯減少，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.01)，見(jiàn)圖4。

討　　論

雖然引起宮頸癌的原因很多，但目前認(rèn)為人乳頭瘤病毒(human papilloma virus，HPV)感染是宮頸癌的根本致病因素[11]。在引入了發(fā)達(dá)國(guó)家的全民普查項(xiàng)目后，盡管宮頸癌的發(fā)病率和死亡率有所下降，但其治療方法幾十年來(lái)都沒(méi)有改變[12]。宮頸癌由于對(duì)大多數(shù)抗癌藥物不敏感, 所以首選治療為手術(shù)及放射治療, 但晚期或復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移患者效果欠佳，而化療具有全身作用特點(diǎn), 所以尋求新的靶位基因治療晚期宮頸癌成為研究的重點(diǎn)[13]。

Figure 3.The effects of Prdx4 overexpression (A) and down-regulation (B) on the migration of the HeLa cells detected by Transwell assay (crystal violet staining, ×200). Mean±SD.n=3.**P<0.01vspcDNA3.0-HA-Prdx4;##P<0.01vsPrdx4 shRNA.

圖3Transwell法分別檢測(cè)過(guò)表達(dá)或下調(diào)Prdx4對(duì)HeLa細(xì)胞遷移能力的影響

過(guò)氧化物酶蛋白(peroxiredoxins，PRDXs)家族的酶促反應(yīng)機(jī)制是過(guò)氧化氫酶底物氧化其家族成員的一個(gè)過(guò)氧化氫特定的半胱氨酸殘基(-Cys-SPH)的過(guò)程[14]。根據(jù)Prdx4參與氧化還原反應(yīng)的半胱氨酸殘基數(shù)目，將其家族分為典型(typical)2-Cys-PRDX(PRDX1-4)、非典型(atypical)2-Cys-PRDX (PRDX5)和1-Cys-PRDX (PRDX6)3類[15]。

PRDXs家族不同的成員在參與各種生物過(guò)程:如氧化劑的解毒，細(xì)胞增殖、分化和基因表達(dá)中發(fā)揮了不同功能。Prdx1與酪氨酸激酶c-Abl相互作用，抑制其酪氨酸激酶活性，通過(guò)保持人第10號(hào)染色體缺失的磷酸酶(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten，PTEN)活性調(diào)控激活A(yù)KT信號(hào)通路[16]。在前列腺癌細(xì)胞中，Prdx1與雄激素受體相互作用，增加其反式激活活性，以及促進(jìn)癌癥表型的發(fā)展。Prdx2是血小板源生長(zhǎng)因子(platelet derived growth factor，PDGF)受體介導(dǎo)細(xì)胞信號(hào)的負(fù)調(diào)節(jié)蛋白，并在小鼠成纖維細(xì)胞中負(fù)調(diào)控核轉(zhuǎn)因子κB (nuclear factor-κB，NF-κB)的激活[17]。在人類細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)Prdx4在細(xì)胞質(zhì)中通過(guò)調(diào)節(jié)NF-κB 抑制蛋白α(NF-κB inhibitor α, IκBα)磷酸化以調(diào)節(jié)NF-κB信號(hào)通路的活性。Prdx4 除了在HeLa細(xì)胞中作為NF-κB激活的負(fù)調(diào)控因子外，其它在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的功能仍知之甚少[18]。

Figure 4.The effects of Prdx4 overexpression (A) and down-regulation (B) on the invasion ability of the HeLa cells detected by Matrigel invasion chamber Transwell test (crystal violet staining, ×200). Mean±SD.n=3.**P<0.01vspcDNA3.0-HA-Prdx4;##P<0.01vsPrdx4 shRNA.

圖4Transwell基質(zhì)膠侵襲實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)過(guò)表達(dá)或下調(diào)Prdx4對(duì)HeLa細(xì)胞侵襲能力的影響

已有研究表明，PRDXs表達(dá)水平與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，PRDX家族在多種腫瘤中高度表達(dá)，特別是在肺癌(Prdx1、Prdx3和Prdx4)、膀胱癌(Prdx1和Prdx4)、甲狀腺癌(Prdx1)和舌癌 (Prdx1) 中高度表達(dá)[19]。另外，Prdx家族成員可以起到促進(jìn)癌癥發(fā)展的作用，其表達(dá)可以促進(jìn)細(xì)胞在氧化應(yīng)激條件下生存。例如，過(guò)表達(dá)Prdx1可以促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖，通過(guò)保護(hù)細(xì)胞免受氧化劑誘導(dǎo)的死亡。在myc基因介導(dǎo)的乳腺癌MCF-7細(xì)胞鼠成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化和增殖中，Prdx3不可或缺[20]。有文獻(xiàn)報(bào)道，MAPK級(jí)聯(lián)反應(yīng)被認(rèn)為是促進(jìn)腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移的主要信號(hào)通路。其中，Srx促進(jìn)腫瘤進(jìn)展的一個(gè)機(jī)制是通過(guò)MAPK/AP-1/MMP9軸的調(diào)節(jié)，Srx-Prdx4軸在腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮了很大的作用。然而, 單方面阻斷Prdx4是否能充分抑制肺癌細(xì)胞裸鼠成瘤或癌癥侵襲和轉(zhuǎn)移仍有待進(jìn)一步研究[21]。

本研究對(duì)Prdx4在調(diào)節(jié)宮頸癌細(xì)胞遷移和侵襲中的可能作用進(jìn)行了探索。成功地將pcDNA3.0-HA-Prdx4表達(dá)質(zhì)粒導(dǎo)入人宮頸癌HeLa細(xì)胞，使Prdx4蛋白表達(dá)水平上調(diào)，然后采用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell法及Transwell基質(zhì)膠法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，Prdx4過(guò)表達(dá)組HeLa細(xì)胞的遷移及侵襲能力明顯高于空白對(duì)照組及空載體轉(zhuǎn)染組。同時(shí)，將LV-Prdx4 siRNA重組病毒感染HeLa細(xì)胞，構(gòu)建Prdx4 shRNA HeLa穩(wěn)定干擾表達(dá)系，Prdx4 shRNA HeLa細(xì)胞的遷移及侵襲能力與空白及陰性對(duì)照組比較明顯受到抑制。最后，將劃痕實(shí)驗(yàn)24 h后的各組細(xì)胞收集進(jìn)行Western blot實(shí)驗(yàn)，再次驗(yàn)證其轉(zhuǎn)染效果同前。

綜上所述，Prdx4表達(dá)下調(diào)能抑制宮頸癌HeLa細(xì)胞的侵襲及轉(zhuǎn)移，由此推測(cè)Prdx4有望成為宮頸癌基因治療的一個(gè)潛在的新靶點(diǎn)。其作用機(jī)制可能與炎癥/應(yīng)激信號(hào)通路(MAPK 通路和NF-κB通路)有關(guān)，其更廣泛的作用及深入的作用機(jī)制值得進(jìn)一步的研究和驗(yàn)證。

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(責(zé)任編輯： 盧萍， 羅森)

Effects of Prdx4 protein expression on migration and invasion of HeLa cells

YUAN Wei-yan, ZHANG Li, SHI Hong-qin, GONG Xiao-wei, JIANG Yong

(DepartmentofPathophysiologyandKeyLaboratoryofProteomicsofGuangdongProvince,SouthernMedicalUniversity,Guangzhou510515,China.E-mail:gongxw@smu.edu.cn;jiang48231@163.com)

AIM: To investigate the effects of peroxiredoxin 4 (Prdx4) protein expression levels on the migration and invasion of human cervical cancer HeLa cells. METHODS: The plasmid pcDNA3.0-HA-Prdx4 was transfected into HeLa cells. The HeLa cells were infected with LV-Prdx4 RNAi vector to establish stablePrdx4 shRNA HeLa cells. The change in the expression of Prdx4 protein was validated by Western blotting. The wound-healing assay, and Transwell migration and invasion assays were performed to detect the migration and invasion of HeLa cells, respectively. RESULTS: The expression of Prdx4 protein was up-regulated in the HeLa cells after transfection with pcDNA3.0-HA-Prdx4 plasmid (P<0.05), whereas it was down-regulated in thePrdx4 shRNA HeLa cells (P<0.05). The abilities of migration and invasion were significantly increased in Prdx4-overexpressing HeLa cells compared with non-transfected and mock plasmid transfected control groups (P<0.01). WhenPrdx4 was knocked down by shRNA, the migration and invasion of the HeLa cells were remarkably repressed compared with blank control group and negative control group (P<0.01).CONCLUSION: The up-regulation of Prdx4 expression facilitates the migration and invasion of HeLa cells, and the down-regulation of Prdx4 expression inhibits the migration and invasion of HeLa cells, indicating that Prdx4 may be a potential molecular target for cervical cancer therapy.

Uterine cervical neoplasms; Peroxiredoxins 4; Cell migration; Cell invasion

1000- 4718(2016)04- 0637- 07

2016- 01- 11

2016- 03- 14

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 81171958；No. 81372030)

龔小衛(wèi) Tel: 020-61648172; E-mail: gongxw@smu.edu.cn； 姜勇Tel: 020-61648231; E-mail: jiang48231@163.com

R730.23; R737.33

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.04.010

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