袁偉燕，　張　麗，　石紅琴，　龔小衛(wèi)，　姜　勇

(南方醫(yī)科大學病理生理學教研室，廣東省蛋白質(zhì)組學重點實驗室，廣東 廣州 510515)

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Prdx4蛋白表達改變對HeLa細胞遷移和侵襲的影響*

袁偉燕，張麗，石紅琴，龔小衛(wèi)△，姜勇△

(南方醫(yī)科大學病理生理學教研室，廣東省蛋白質(zhì)組學重點實驗室，廣東 廣州 510515)

目的： 觀察過氧化物還原酶4(peroxiredoxin 4，Prdx4)蛋白表達的改變對人宮頸癌HeLa細胞遷移和侵襲的影響。方法: 采用脂質(zhì)體瞬時轉(zhuǎn)染法將表達質(zhì)粒pcDNA3.0-HA-Prdx4轉(zhuǎn)染HeLa細胞；LV-Prdx4 RNAi重組病毒感染HeLa細胞，構(gòu)建Prdx4 shRNA HeLa細胞系沉默Prdx4的表達；用蛋白質(zhì)印跡法證實Prdx4蛋白表達水平的變化；應用劃痕愈合實驗和Transwell遷移及侵襲實驗分別檢測細胞遷移及侵襲能力的變化。結(jié)果: pcDNA3.0-HA-Prdx4質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組HeLa細胞的Prdx4蛋白表達水平明顯上調(diào)(P<0.05)，而Prdx4 shRNA HeLa穩(wěn)定干擾細胞系Prdx4表達水平明顯下調(diào)(P<0.05)。Prdx4過表達組HeLa細胞的遷移和侵襲能力明顯增強，與空白對照組及空載體轉(zhuǎn)染組比較，差異顯著(P<0.01)。Prdx4表達干擾組HeLa細胞的遷移和侵襲能力明顯受到抑制，與空白對照組及陰性對照組比較，差異顯著(P<0.01)。結(jié)論: 上調(diào)Prdx4蛋白表達水平可促進HeLa細胞的遷移和侵襲，在宮頸癌的發(fā)生和發(fā)展過程中可能起重要作用；下調(diào)Prdx4蛋白表達水平可以明顯抑制HeLa細胞的遷移和侵襲能力，Prdx4有可能成為臨床治療宮頸癌的一個潛在靶點。

宮頸癌； 過氧化物還原酶4； 細胞遷移； 細胞侵襲

宮頸癌是最常見的婦科惡性腫瘤之一，在發(fā)展中國家其發(fā)病率位居首位[1]，是全球女性癌癥相關(guān)死亡的第2大原因[2]。隨著人們對宮頸癌認識程度的不斷加深、防癌普查的廣泛開展以及治療方法的不斷改進，發(fā)病率和死亡率有所下降，但腫瘤復發(fā)和轉(zhuǎn)移仍是死亡的主要原因[3]。癌癥治療失敗和腫瘤發(fā)生侵襲的重要原因是腫瘤細胞通過破壞基底膜的完整性，穿過細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)發(fā)生轉(zhuǎn)移[4]。有文獻報道，過氧化物還原酶4(peroxiredoxin 4，Prdx4)的表達水平與腫瘤密切相關(guān)，Prdx1和Prdx4在膀胱癌和肺癌組織中出現(xiàn)表達量增高[5]，Prdx3和Prdx4在前列腺癌組織中的表達量也增高[6-7]。同時有研究證實當下調(diào)或敲除Prdx4的表達時，會導致胃癌組織的生長受限和凋亡增多且會導致精原細胞的凋亡[8]。

目前，對于已發(fā)生轉(zhuǎn)移的宮頸癌，其治療方案主要是減輕患者痛苦。因此，非常有必要進一步研究宮頸癌的發(fā)生發(fā)展機制，以發(fā)現(xiàn)新的靶點和治療方法。本研究采用脂質(zhì)體瞬時轉(zhuǎn)染法使Prdx4過表達及RNA干擾(RNA interference，RNAi)技術(shù)抑制Prdx4的表達，觀察其對人宮頸癌HeLa細胞遷移和侵襲的影響，進一步探討Prdx4在細胞遷移和侵襲中的作用及其作為分子靶點用于腫瘤治療的潛在價值。

材　料　和　方　法

1細胞及試劑

人宮頸癌細胞株HeLa和pcDNA3.0-HA質(zhì)粒載體(含有HA標簽，可與重組目的基因共表達為融合蛋白)由本實驗室保存。LV-Prdx4 RNAi和LV-control陰性對照重組病毒及嘌呤霉素由上海吉凱基因有限公司制備；脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Polyfect購自Roche；兔抗鼠β-actin單克隆抗體和辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG購自CST；鼠抗人Prdx4多克隆抗體購自Abcam；Transwell小室購自BD；Matrigel invasion chamber購自Corning；引物合成和DNA測序由深圳華大基因研究院完成。

2方法

2.1細胞培養(yǎng)人宮頸癌細胞株HeLa用含10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)液，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)[9]。待細胞融合率達到70%～80%時，用0.25%胰蛋白酶消化并傳代，收集處于對數(shù)生長期的細胞用于實驗。

2.2pcDNA3.0-HA-Prdx4過表達載體的構(gòu)建和測序結(jié)果及轉(zhuǎn)染方法pcDNA3.0-HA-Prdx4過表達載體的構(gòu)建和測序結(jié)果及轉(zhuǎn)染方法在前期工作中已描述[10]。

2.3慢病毒感染HeLa細胞并構(gòu)建Prdx4 shRNA HeLa穩(wěn)定表達系針對Prdx4基因的siRNA設(shè)計與篩選參照文獻[10]，其中hPrdx4 siRNA2的抑制效率最高，將此siRNA用于后續(xù)研究。HeLa細胞以3×103接種于96孔板，待細胞的融合率約為20%～30%進行病毒感染，將LV-Prdx4 RNAi和LV-control陰性對照重組病毒(帶有嘌呤霉素抗性和綠色熒光報告基因)分別以復感染指數(shù)(MOI值)為10 的量感染細胞，加入polybrene(終濃度5 mg/L)，37 ℃培養(yǎng)2 d后加嘌呤霉素(500 mg/L)篩選陽性克隆，待孔板中細胞長至細胞克隆時，挑取單克隆擴大培養(yǎng)，直至獲得需要的穩(wěn)定感染細胞株的細胞量后，裂解細胞并收集細胞上清液，檢測目的蛋白的表達情況。

2.4蛋白質(zhì)印跡法檢測Prdx4蛋白的表達水平收集并裂解各組處理后的細胞，取總蛋白樣品各30 μg進行SDS-PAGE。將在SDS-PAGE上分離的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上(恒壓100 V，90 min)，用5%脫脂奶粉封閉1 h，加入 I 抗鼠抗人Prdx4多克隆抗體(1∶2 000)，4 ℃過夜。TBST洗膜3次，再加入II抗HRP標記的羊抗鼠IgG(1∶5 000)1 h。TBST洗膜3次，采用化學發(fā)光法檢測目的蛋白條帶的灰度值，以目的蛋白與內(nèi)參照β-actin條帶的灰度值之比表示目的蛋白的相對表達量。

2.5細胞劃痕實驗檢測細胞橫向遷移能力將處于對數(shù)生長期HeLa細胞按每孔3×105個的密度接種于6孔板內(nèi)，次日待細胞生長至融合度約50%～60%時，將pcDNA3.0-HA-Prdx4重組質(zhì)粒和pcDNA3.0-HA空載體質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染HeLa細胞，另外將處于對數(shù)生長期的Prdx4 shRNA HeLa細胞和control shRNA HeLa細胞按每孔4×105個的密度接種于6孔板內(nèi), 以未轉(zhuǎn)染的HeLa細胞作為空白對照組。次日，收集消化以上各組細胞，取每孔3×105個的密度接種于12孔板內(nèi)，待24 h后細胞融合度達到80%～90%，用200 μL槍頭垂直在細胞間橫豎2個方向各劃一道橫穿細胞的劃痕，更換培養(yǎng)基，24 h后，PBS清洗2次，顯微鏡下拍照，用Image-Pro Plus 軟件測定劃痕寬度，計算平均劃痕愈合率，以此反映細胞的橫向遷移能力。

2.6Transwell法檢測細胞縱向遷移能力及侵襲實驗檢測細胞侵襲能力另取以上在6孔板中收集消化的各組HeLa細胞各5×104個(用200 μL DMEM重懸成單細胞懸液)，分別接種于24孔板Transwell小室中，下室加入600 μL 含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，每組設(shè)3個復孔，12 h后，用棉簽擦去上室中的細胞，4%多聚甲醛溶液固定細胞30 min，1%的結(jié)晶紫37 ℃染色30 min，雙蒸水洗至水清，將小室晾干后，在正置光學顯微鏡下隨機選取5個視野，計數(shù)穿膜細胞數(shù)目。各組侵入小室膜下層的細胞數(shù)表示細胞的遷移能力。同時取以上各組HeLa細胞各1×105個，用200 μL DMEM重懸成單細胞懸液，分別鋪入加有基質(zhì)凝膠的小室中，其余步驟同Transwell遷移實驗，計數(shù)穿膜細胞數(shù)目，取均值。

3統(tǒng)計學處理

所有實驗均獨立重復3次以上，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示。采用SPSS 13.0和GraphPad Prism 5統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析。多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié)　　果

1LV-Prdx4-RNAi及LV-control重組病毒感染HeLa細胞，構(gòu)建Prdx4 shRNA HeLa穩(wěn)定表達系

將構(gòu)建好的LV-Prdx4-RNAi及LV-control重組病毒轉(zhuǎn)染至HeLa細胞，于倒置顯微鏡下觀察可以看到帶綠色熒光的人宮頸癌HeLa細胞克隆，挑單克隆繼續(xù)傳代培養(yǎng)，經(jīng)過嘌呤霉素篩選10 d后，得到了帶綠色熒光穩(wěn)定干擾的Prdx4 shRNA HeLa及control shRNA HeLa細胞,見圖1A。

2HeLa細胞轉(zhuǎn)染pcDNA3.0-HA-Prdx4后Prdx4表達水平顯著增高

蛋白質(zhì)印跡法檢測結(jié)果顯示，pcDNA3.0-HA-Prdx4轉(zhuǎn)染組、pcDNA3.0-HA陰性對照組和空白對照組HeLa細胞中Prdx4蛋白表達水平之間差異有統(tǒng)計學顯著性(P<0.05)；與空白對照組和陰性對照組相比，pcDNA3.0-HA-Prdx4組HeLa細胞中的Prdx4蛋白表達水平顯著增高(P<0.05),見圖1B。

3Prdx4 shRNA HeLa穩(wěn)定干擾細胞可顯著下調(diào)Prdx4的表達

蛋白質(zhì)印跡法檢測結(jié)果顯示，Prdx4 shRNA HeLa、control shRNA HeLa和空白對照組之間Prdx4蛋白的表達水平差異有統(tǒng)計學顯著性(P<0.05)；與空白對照及陰性對照組相比，Prdx4 shRNA HeLa組Prdx4的表達水平顯著降低(P<0.05),見圖1C。

Figure 1.The changes of Prdx4 protein expression in HeLa cells. A: establishment of a stablePrdx4 shRNA HeLa cell line (×100); B, C: Prdx4 protein expression in HeLa cells transfected with pcDNA3.0-HA-Prdx4 andPrdx4 shRNA HeLa cells was validated by western blotting.Mean±SD.n=3.*P<0.05vspcDNA3.0-HA-Prdx4;#P<0.05vsPrdx4 shRNA.

圖1HeLa細胞中Prdx4蛋白表達水平的變化

4過表達或下調(diào)Prdx4對HeLa細胞橫向遷移能力的影響

細胞劃痕實驗結(jié)果顯示，Prdx4過表達組之間的細胞劃痕愈合率差異有統(tǒng)計學顯著性(P<0.01)；與空白對照組和陰性對照組相比，Prdx4過表達組細胞的愈合明顯高于對照組(P<0.01)。另一方面，沉默Prdx4表達組之間的細胞劃痕愈合率差異有統(tǒng)計學顯著性(P<0.01)；與空白對照組及陰性對照組相比，Prdx4 shRNA組的愈合率明顯低于對照組，差異具有統(tǒng)計學顯著性(P<0.01),見圖2。

Figure 2.The effects of the Prdx4 overexpression (A) and down-regulation (B) on the migration of HeLa cells detected by wound-healing assay (×100). Mean±SD.n=3.**P<0.01vspcDNA3.0-HA-Prdx4;##P<0.01vsPrdx4 shRNA.

圖2細胞劃痕實驗分別檢測過表達或下調(diào)Prdx4對HeLa細胞遷移能力的影響

5過表達或下調(diào)Prdx4對HeLa細胞縱向遷移能力的影響

Transwell遷移實驗結(jié)果顯示，Prdx4過表達組之間的穿膜細胞數(shù)差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；與空白對照組和陰性對照組相比，Prdx4過表達組的穿膜細胞數(shù)明顯增多，差異具有統(tǒng)計學顯著性(P<0.01)。另一方面，沉默Prdx4表達組之間的穿膜細胞數(shù)差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；與空白對照組和陰性對照組相比，Prdx4表達沉默組的穿膜細胞數(shù)明顯減少，差異具有統(tǒng)計學顯著性(P<0.01)，見圖3。

6過表達或下調(diào)Prdx4對HeLa細胞侵襲能力的影響

Transwell基質(zhì)膠侵襲實驗結(jié)果顯示，Prdx4過表達組之間的穿膜細胞數(shù)差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；與空白對照組和陰性對照組相比，Prdx4過表達組的細胞數(shù)明顯增多(P<0.01)。另一方面，沉默Prdx4表達之間的穿膜細胞數(shù)差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；與空白對照組及陰性對照組相比，Prdx4表達沉默組的穿膜細胞數(shù)明顯減少，其差異有統(tǒng)計學顯著性(P<0.01)，見圖4。

討　　論

雖然引起宮頸癌的原因很多，但目前認為人乳頭瘤病毒(human papilloma virus，HPV)感染是宮頸癌的根本致病因素[11]。在引入了發(fā)達國家的全民普查項目后，盡管宮頸癌的發(fā)病率和死亡率有所下降，但其治療方法幾十年來都沒有改變[12]。宮頸癌由于對大多數(shù)抗癌藥物不敏感, 所以首選治療為手術(shù)及放射治療, 但晚期或復發(fā)轉(zhuǎn)移患者效果欠佳，而化療具有全身作用特點, 所以尋求新的靶位基因治療晚期宮頸癌成為研究的重點[13]。

Figure 3.The effects of Prdx4 overexpression (A) and down-regulation (B) on the migration of the HeLa cells detected by Transwell assay (crystal violet staining, ×200). Mean±SD.n=3.**P<0.01vspcDNA3.0-HA-Prdx4;##P<0.01vsPrdx4 shRNA.

圖3Transwell法分別檢測過表達或下調(diào)Prdx4對HeLa細胞遷移能力的影響

過氧化物酶蛋白(peroxiredoxins，PRDXs)家族的酶促反應機制是過氧化氫酶底物氧化其家族成員的一個過氧化氫特定的半胱氨酸殘基(-Cys-SPH)的過程[14]。根據(jù)Prdx4參與氧化還原反應的半胱氨酸殘基數(shù)目，將其家族分為典型(typical)2-Cys-PRDX(PRDX1-4)、非典型(atypical)2-Cys-PRDX (PRDX5)和1-Cys-PRDX (PRDX6)3類[15]。

PRDXs家族不同的成員在參與各種生物過程:如氧化劑的解毒，細胞增殖、分化和基因表達中發(fā)揮了不同功能。Prdx1與酪氨酸激酶c-Abl相互作用，抑制其酪氨酸激酶活性，通過保持人第10號染色體缺失的磷酸酶(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten，PTEN)活性調(diào)控激活AKT信號通路[16]。在前列腺癌細胞中，Prdx1與雄激素受體相互作用，增加其反式激活活性，以及促進癌癥表型的發(fā)展。Prdx2是血小板源生長因子(platelet derived growth factor，PDGF)受體介導細胞信號的負調(diào)節(jié)蛋白，并在小鼠成纖維細胞中負調(diào)控核轉(zhuǎn)因子κB (nuclear factor-κB，NF-κB)的激活[17]。在人類細胞中，發(fā)現(xiàn)Prdx4在細胞質(zhì)中通過調(diào)節(jié)NF-κB 抑制蛋白α(NF-κB inhibitor α, IκBα)磷酸化以調(diào)節(jié)NF-κB信號通路的活性。Prdx4 除了在HeLa細胞中作為NF-κB激活的負調(diào)控因子外，其它在細胞信號轉(zhuǎn)導的功能仍知之甚少[18]。

Figure 4.The effects of Prdx4 overexpression (A) and down-regulation (B) on the invasion ability of the HeLa cells detected by Matrigel invasion chamber Transwell test (crystal violet staining, ×200). Mean±SD.n=3.**P<0.01vspcDNA3.0-HA-Prdx4;##P<0.01vsPrdx4 shRNA.

圖4Transwell基質(zhì)膠侵襲實驗分別檢測過表達或下調(diào)Prdx4對HeLa細胞侵襲能力的影響

已有研究表明，PRDXs表達水平與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，PRDX家族在多種腫瘤中高度表達，特別是在肺癌(Prdx1、Prdx3和Prdx4)、膀胱癌(Prdx1和Prdx4)、甲狀腺癌(Prdx1)和舌癌 (Prdx1) 中高度表達[19]。另外，Prdx家族成員可以起到促進癌癥發(fā)展的作用，其表達可以促進細胞在氧化應激條件下生存。例如，過表達Prdx1可以促進細胞生長和增殖，通過保護細胞免受氧化劑誘導的死亡。在myc基因介導的乳腺癌MCF-7細胞鼠成纖維細胞轉(zhuǎn)化和增殖中，Prdx3不可或缺[20]。有文獻報道，MAPK級聯(lián)反應被認為是促進腫瘤細胞浸潤和轉(zhuǎn)移的主要信號通路。其中，Srx促進腫瘤進展的一個機制是通過MAPK/AP-1/MMP9軸的調(diào)節(jié)，Srx-Prdx4軸在腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮了很大的作用。然而, 單方面阻斷Prdx4是否能充分抑制肺癌細胞裸鼠成瘤或癌癥侵襲和轉(zhuǎn)移仍有待進一步研究[21]。

本研究對Prdx4在調(diào)節(jié)宮頸癌細胞遷移和侵襲中的可能作用進行了探索。成功地將pcDNA3.0-HA-Prdx4表達質(zhì)粒導入人宮頸癌HeLa細胞，使Prdx4蛋白表達水平上調(diào)，然后采用細胞劃痕實驗和Transwell法及Transwell基質(zhì)膠法檢測發(fā)現(xiàn)，Prdx4過表達組HeLa細胞的遷移及侵襲能力明顯高于空白對照組及空載體轉(zhuǎn)染組。同時，將LV-Prdx4 siRNA重組病毒感染HeLa細胞，構(gòu)建Prdx4 shRNA HeLa穩(wěn)定干擾表達系，Prdx4 shRNA HeLa細胞的遷移及侵襲能力與空白及陰性對照組比較明顯受到抑制。最后，將劃痕實驗24 h后的各組細胞收集進行Western blot實驗，再次驗證其轉(zhuǎn)染效果同前。

綜上所述，Prdx4表達下調(diào)能抑制宮頸癌HeLa細胞的侵襲及轉(zhuǎn)移，由此推測Prdx4有望成為宮頸癌基因治療的一個潛在的新靶點。其作用機制可能與炎癥/應激信號通路(MAPK 通路和NF-κB通路)有關(guān)，其更廣泛的作用及深入的作用機制值得進一步的研究和驗證。

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(責任編輯： 盧萍， 羅森)

Effects of Prdx4 protein expression on migration and invasion of HeLa cells

YUAN Wei-yan, ZHANG Li, SHI Hong-qin, GONG Xiao-wei, JIANG Yong

(DepartmentofPathophysiologyandKeyLaboratoryofProteomicsofGuangdongProvince,SouthernMedicalUniversity,Guangzhou510515,China.E-mail:gongxw@smu.edu.cn;jiang48231@163.com)

AIM: To investigate the effects of peroxiredoxin 4 (Prdx4) protein expression levels on the migration and invasion of human cervical cancer HeLa cells. METHODS: The plasmid pcDNA3.0-HA-Prdx4 was transfected into HeLa cells. The HeLa cells were infected with LV-Prdx4 RNAi vector to establish stablePrdx4 shRNA HeLa cells. The change in the expression of Prdx4 protein was validated by Western blotting. The wound-healing assay, and Transwell migration and invasion assays were performed to detect the migration and invasion of HeLa cells, respectively. RESULTS: The expression of Prdx4 protein was up-regulated in the HeLa cells after transfection with pcDNA3.0-HA-Prdx4 plasmid (P<0.05), whereas it was down-regulated in thePrdx4 shRNA HeLa cells (P<0.05). The abilities of migration and invasion were significantly increased in Prdx4-overexpressing HeLa cells compared with non-transfected and mock plasmid transfected control groups (P<0.01). WhenPrdx4 was knocked down by shRNA, the migration and invasion of the HeLa cells were remarkably repressed compared with blank control group and negative control group (P<0.01).CONCLUSION: The up-regulation of Prdx4 expression facilitates the migration and invasion of HeLa cells, and the down-regulation of Prdx4 expression inhibits the migration and invasion of HeLa cells, indicating that Prdx4 may be a potential molecular target for cervical cancer therapy.

Uterine cervical neoplasms; Peroxiredoxins 4; Cell migration; Cell invasion

1000- 4718(2016)04- 0637- 07

2016- 01- 11

2016- 03- 14

國家自然科學基金資助項目(No. 81171958；No. 81372030)

龔小衛(wèi) Tel: 020-61648172; E-mail: gongxw@smu.edu.cn； 姜勇Tel: 020-61648231; E-mail: jiang48231@163.com

R730.23; R737.33

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.04.010

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