萬(wàn)　強(qiáng)，　楊玉萍，　劉中勇△

(江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院 1心內(nèi)科， 2呼吸科，江西 南昌 330006)

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丹參酮IIA通過(guò)抑制p38 MAPK通路減輕PM2.5對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷*

萬(wàn)強(qiáng)1，楊玉萍2，劉中勇1△

(江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院1心內(nèi)科，2呼吸科，江西 南昌 330006)

目的： 探討PM2.5對(duì)EA.hy926型人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷的影響及丹參酮IIA在這一過(guò)程中的作用及機(jī)制。方法: 采集廣州城區(qū)大氣PM2.5并以不同質(zhì)量濃度(0、20、200、400 mg/L)染毒EA.hy926細(xì)胞24 h，MTT法測(cè)細(xì)胞存活率，流式細(xì)胞術(shù)測(cè)細(xì)胞凋亡，Western blot法測(cè)p-p38 MAPK、Bax和Bcl-2的蛋白水平，ELISA法測(cè)白細(xì)胞介素-6(IL-6)及腫瘤壞死因子-α(TNF-α)含量，并測(cè)定細(xì)胞丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)及乳酸脫氫酶(LDH)活性；分別加入丹參酮IIA(5、10、20 μmol/L)和p38 MAPK通路特異性阻滯劑SB203580 20 μmol/L檢測(cè)丹參酮IIA的干預(yù)作用及機(jī)制。結(jié)果: 與對(duì)照組比較，PM2.5染毒后呈劑量依賴性降低EA.hy926細(xì)胞的存活率，上調(diào)p-p38 MAPK蛋白水平及Bax/Bcl-2蛋白比率以促進(jìn)細(xì)胞凋亡，誘導(dǎo)分泌IL-6及TNF-α，降低SOD活性，增加MDA含量及LDH活性，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05)；丹參酮IIA呈劑量依賴性增加EA.hy926細(xì)胞的存活率，下調(diào)p-p38 MAPK蛋白水平及Bax/Bcl-2蛋白比率以抑制細(xì)胞凋亡，降低IL-6及TNF-α含量，增加SOD活性，降低MDA含量及LDH活性，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05)。結(jié)論:丹參酮IIA可通過(guò)抑制p38 MAPK通路，減輕PM2.5對(duì)EA.hy926細(xì)胞的損傷。

PM2.5； 丹參酮IIA； p38 MAPK； 血管內(nèi)皮細(xì)胞

大氣污染可嚴(yán)重危害人類健康，不僅引起呼吸系統(tǒng)疾病，而且是心血管疾病(cardiovascular disease，CVD)一個(gè)獨(dú)立的可控制危險(xiǎn)因素[1]。動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是CVD的病理基礎(chǔ)之一，研究表明大氣顆粒物(particulate matter，PM)尤其是其中空氣動(dòng)力學(xué)直徑≤2.5 μm的細(xì)顆粒物(PM2.5)與AS的形成直接相關(guān)[2-3]。血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷被認(rèn)為是AS的起始病理環(huán)節(jié)，可作為預(yù)測(cè)CVD的指標(biāo)之一而獨(dú)立存在[4]。丹參酮IIA(tanshinone IIA)為唇形科植物丹參中提取的主要脂溶性成分，可通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)、抗氧化應(yīng)激損傷、調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖和遷移等多途徑顯著發(fā)揮抗AS效應(yīng)[5-8]，但其抗AS作用機(jī)制尚未完全闡明。本研究觀察PM2.5對(duì)EA.hy926型人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷的影響，加用丹參酮IIA和p38有絲分裂原激活蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase，p38 MAPK)信號(hào)通路特異性阻滯劑SB203580干預(yù)，探討丹參酮IIA對(duì)PM2.5損傷EA.hy926細(xì)胞的干預(yù)作用及可能機(jī)制。

材　料　和　方　法

1主要試劑與儀器

EA.hy926型人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株購(gòu)自ATCC，增殖周期約為31 h；丹參酮IIA(純度≥98%)、二甲基亞砜(DMSO)及噻唑藍(lán)(MTT)均購(gòu)自Sigma；胎牛血清和DMEM培養(yǎng)基均購(gòu)自Gibco；p-p38 MAPK、Bcl-2及Bax抗體均購(gòu)自CST；Annexin V-FITC試劑盒購(gòu)自Bio Vision；白細(xì)胞介素-6(interleukin-6，IL-6)和腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)ELISA試劑盒購(gòu)于eBioscience；丙二醛(malondialdehyde，MDA)、乳酸脫氫酶(lactic dehydrogenase，LDH)及超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。超凈臺(tái)、恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱、酶標(biāo)儀及低溫高速離心機(jī)均購(gòu)自Thermo；電泳儀購(gòu)自Bio-Rad；熒光倒置顯微鏡購(gòu)自O(shè)lympus。

2方法

2.1PM2.5的采集與制備根據(jù)廣州市環(huán)保局提供的空氣質(zhì)量指數(shù)和PM2.5監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)，于空氣質(zhì)量指數(shù)5級(jí)及以上的PM2.5嚴(yán)重超標(biāo)的霧霾天氣，在廣州市區(qū)中心距離地面約50 m高建筑樓頂用MiniVol型便攜式PM2.5采樣器(Airmetrics)以流量為5 L/min進(jìn)行24 h/d采樣，連續(xù)采樣3 d。將石英纖維濾膜(Whatman)剪成1 cm×3 cm大小置于去離子水中，超聲震蕩30 min×3次，提取液用6層無(wú)菌紗布過(guò)濾后，以10 000 r/min于4 ℃離心20 min，收集提取物真空冷凍干燥成干粉，稱重，于-20 ℃避光保存。用滅菌PBS配制成質(zhì)量濃度分別為20、200、400 mg/L的PM2.5混懸液。

2.2細(xì)胞分組及處理設(shè)PM2.5不同質(zhì)量濃度組，分別以0、20、200、400 mg/L作用EA.hy926細(xì)胞24 h[9]。分別設(shè)置：對(duì)照組；PM2.5組：PM2.5顆粒物混懸液200 mg/L染毒24 h；PM2.5+丹參酮IIA低、中、高組：分別以丹參酮IIA(5、10、20 μmol/L)預(yù)處理細(xì)胞1 h[10]后再加200 mg/L PM2.5染毒24 h；PM2.5+SB203580組：20 μmol/L SB203580預(yù)處理細(xì)胞30 min[11]后再加200 mg/L PM2.5染毒24 h。

2.3MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率EA.hy926細(xì)胞密度調(diào)至每孔1×104個(gè)接種至96孔培養(yǎng)板，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24 h后撤去血清。不同質(zhì)量濃度PM2.5混懸液染毒后加入20 μL MTT溶液(PBS溶解，濃度為5 g/L)室溫培養(yǎng)4 h，每孔加150 μL DMSO使還原產(chǎn)物完全溶解，低速振蕩10 min，酶標(biāo)儀測(cè)波長(zhǎng)570 nm處各孔吸光度(A)值。細(xì)胞存活率(%)=(實(shí)驗(yàn)組A值-空白對(duì)照組A值)/(對(duì)照組A值-空白對(duì)照組A值)×100%。

2.4流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡EA.hy926細(xì)胞密度調(diào)至每孔2×105個(gè)接種至12孔培養(yǎng)板24 h，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，加不含血清的培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h。收集細(xì)胞，PBS洗滌5 min×2次，加Annexin V-FITC及PI雙染，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

2.5EA.hy926細(xì)胞IL-6、TNF-α及MDA含量，SOD及LDH活性的測(cè)定取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的EA.hy926細(xì)胞以1×108/L接種于培養(yǎng)皿。收集細(xì)胞，以1 000 r/min離心10 min，去除培養(yǎng)液，以2 mL PBS洗1次后加PBS 500 μL混懸。超聲5 s×5次，使細(xì)胞破碎，黃嘌呤氧化酶法檢測(cè)細(xì)胞裂解液中SOD活性。收集細(xì)胞上清液，ELISA法檢測(cè)IL-6及TNF-α含量，硫代巴比妥法檢測(cè)MDA含量，比色法檢測(cè)LDH活性，操作步驟參照說(shuō)明書進(jìn)行。

2.6Western blot法檢測(cè)Bax、Bcl-2和p-p38 MAPK蛋白水平提取EA.hy926細(xì)胞總蛋白，BCA法檢測(cè)蛋白濃度，煮沸5 min蛋白變性后進(jìn)行SDS-PAGE，半干轉(zhuǎn)印，5%脫脂牛奶封閉2 h，加I抗(1∶1 000稀釋)于4 ℃反應(yīng)過(guò)夜，TBST洗膜3次，加 II 抗(1∶2 000稀釋)于室溫結(jié)合，TBST洗膜3次，化學(xué)發(fā)光檢測(cè)。以β-actin為內(nèi)參照蛋白，Quantity One軟件分析各條帶吸光度值。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間比較用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間比較采用Bonferroni法，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)　　果

1PM2.5對(duì)EA.hy926細(xì)胞的影響

1.1PM2.5對(duì)EA.hy926細(xì)胞存活率的影響與對(duì)照組比較，200、400 mg/L PM2.5染毒24 h均可顯著降低EA.hy926細(xì)胞存活率，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1PM2.5對(duì)EA.hy926細(xì)胞存活率，凋亡， IL-6、TNF-α及MDA含量，SOD及LDH活性的影響

Table 1.The effects of PM2.5 on viability, apoptosis, IL-6, TNF-α and MDA contents, and SOD and LDH activity in EA.hy926 cells (Mean±SD.n=3)

TreatmentViability(%)Apoptosis(%)IL-6(ng/L)TNF-α(ng/L)MDA(μmol/L)SOD(×103U/L)LDH(U/L)Control1002.25±0.21348.41±12.27168.42±6.551.21±0.1918.27±0.32623.26±41.33PM2.520mg/L97.88±0.312.72±0.18352.62±13.74171.24±7.321.24±0.1617.89±0.35631.58±46.33PM2.5200mg/L84.16±1.62*22.53±1.32*521.63±14.59*387.35±8.38*4.10±0.18*11.57±0.38*1127.49±60.42*PM2.5400mg/L67.31±1.54*43.68±1.73*563.46±13.23*423.74±9.46*5.47±0.21*8.03±0.24*1539.44±56.28*

*P<0.05vscontrol group.

1.2PM2.5對(duì)EA.hy926細(xì)胞凋亡的影響與對(duì)照組比較，200、400 mg/L PM2.5染毒24 h均可顯著誘導(dǎo)EA.hy926細(xì)胞凋亡，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05)，見(jiàn)表1。

1.3PM2.5對(duì)EA.hy926細(xì)胞IL-6、TNF-α及MDA含量，SOD及LDH活性的影響與對(duì)照組比較，200、400 mg/L PM2.5染毒24 h均可顯著降低EA.hy926細(xì)胞內(nèi)SOD活性(P<0.05)，顯著增加細(xì)胞上清液中IL-6、TNF-α、MDA含量及LDH活性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05)，見(jiàn)表1。

1.4PM2.5對(duì)EA.hy926細(xì)胞內(nèi)Bax、Bcl-2及p-p38 MAPK蛋白表達(dá)的影響與對(duì)照組比較，200、400 mg/L PM2.5染毒24 h均可顯著增加EA.hy926細(xì)胞內(nèi)Bax及p-p38 MAPK蛋白表達(dá)，并顯著減少Bcl-2蛋白表達(dá)，增加Bax/Bcl-2蛋白比率，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05)，見(jiàn)圖1。

2丹參酮IIA對(duì)PM2.5損傷EA.hy926細(xì)胞的干預(yù)作用

2.1丹參酮IIA對(duì)PM2.5降低EA.hy926細(xì)胞存活率的干預(yù)作用與PM2.5組比較，10、20 μmol/L丹參酮IIA和20 μmol/L SB203580對(duì)于PM2.5降低EA.hy926細(xì)胞存活率均有顯著的拮抗作用，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05)，見(jiàn)表2。

2.2丹參酮IIA對(duì)PM2.5誘導(dǎo)EA.hy926細(xì)胞凋亡的干預(yù)作用與PM2.5組比較，10、20 μmol/L丹參酮IIA和20 μmol/L SB203580均可顯著減少由PM2.5誘導(dǎo)的EA.hy926細(xì)胞凋亡，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05)，見(jiàn)表2。

2.3丹參酮IIA對(duì)PM2.5影響EA.hy926細(xì)胞IL-6、TNF-α及MDA含量，SOD及LDH活性的干預(yù)作用與PM2.5組比較，10、20 μmol/L丹參酮IIA和20 μmol/L SB203580均可顯著增加EA.hy926細(xì)胞內(nèi)SOD活性，顯著降低細(xì)胞上清液中IL-6、TNF-α、MDA含量及LDH活性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05)，見(jiàn)表2。2.4丹參酮IIA對(duì)PM2.5影響EA.hy926細(xì)胞內(nèi)Bax、Bcl-2及p-p38 MAPK蛋白表達(dá)的干預(yù)作用與PM2.5組比較，10、20 μmol/L丹參酮IIA和20 μmol/L SB203580均可顯著降低EA.hy926細(xì)胞內(nèi)Bax及p-p38 MAPK蛋白水平，并顯著增加Bcl-2蛋白的表達(dá)，減少Bax/Bcl-2蛋白比率，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05)，見(jiàn)圖2。

Figure 1.The effects of PM2.5 on the protein levels of p-P38 MAPK, Bax and Bcl-2 in the EA.hy926 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖1PM2.5對(duì)EA.hy926細(xì)胞內(nèi)p-p38 MAPK、Bax及Bcl-2蛋白水平的影響

表2丹參酮IIA及SB203580對(duì)PM2.5影響EA.hy926細(xì)胞存活率，凋亡， IL-6、TNF-α及MDA含量，SOD及LDH活性的干預(yù)作用

Table 2.The effects of tanshinone IIA and SB203580 on viability, apoptosis, IL-6, TNF-α and MDA contents, SOD and LDH activities in EA.hy926 cells (Mean±SD.n=3)

GroupViability(%)Apoptosis(%)IL-6(ng/L)TNF-α(ng/L)MDA(μmol/L)SOD(×103U/L)LDH(U/L)Control1002.23±0.17345.32±12.14166.38±6.471.23±0.1518.36±0.27620.24±44.52PM2.583.49±1.42*22.47±1.23*522.43±14.32*388.25±8.41*4.14±0.16*11.44±0.36*1141.38±59.43*PM2.5+tanshinoneⅡA5μmol/L84.41±1.3121.82±1.25518.21±15.26384.54±8.564.10±0.1411.52±0.261128.39±65.51PM2.5+tanshinoneⅡA10μmol/L88.52±1.41#16.41±1.38#462.34±14.63#321.21±7.39#3.22±0.21#13.98±0.32#959.32±54.33#PM2.5+tanshinoneⅡA20μmol/L91.43±1.22#9.56±0.82#383.56±12.49#245.42±7.14#2.35±0.27#16.57±0.38#768.38±56.26#PM2.5+SB20358088.35±1.15#14.37±1.16#485.46±15.18#347.58±8.04#3.51±0.24#14.36±0.31#824.90±52.57#

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsPM2.5 group.

Figure 2.The effects of tanshinone IIA and SB203580 on the protein levels of p-p38 MAPK,Bax and Bcl-2 in the EA.hy926 cells. A: control group; B: PM2.5 group; C: PM2.5+5 μmol/L tanshinone IIA group; D: PM2.5+10 μmol/L tanshinone IIA group; E: PM2.5+20 μmol/L tanshinone IIA group; F: PM2.5+SB203580 group. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsPM2.5 group.

圖2丹參酮IIA及SB203580對(duì)PM2.5影響EA.hy926細(xì)胞內(nèi)p-p38 MAPK、Bax及Bcl-2蛋白水平的干預(yù)作用

討　　論

PM2.5表面吸附的大量有毒、有害物質(zhì)可通過(guò)呼吸從肺泡上皮進(jìn)入肺組織間隙，擴(kuò)散至微血管作用于血管內(nèi)皮及凝血、纖溶系統(tǒng)，損傷心血管系統(tǒng)結(jié)構(gòu)及功能而形成CVD。各國(guó)的多中心、多種族臨床對(duì)照試驗(yàn)證實(shí)長(zhǎng)期慢性暴露在高濃度PM2.5環(huán)境中可通過(guò)炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、交感神經(jīng)興奮性增加等機(jī)制，增加動(dòng)脈內(nèi)膜中層厚度、降低AS斑塊穩(wěn)定性，促進(jìn)此人群AS的形成及發(fā)展[2-3]。動(dòng)物研究亦發(fā)現(xiàn)接觸高濃度PM2.5可上調(diào)清道夫受體CD36的表達(dá)，誘導(dǎo)粥樣斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞內(nèi)膽固醇堆積；增加內(nèi)臟脂肪素表達(dá)；促進(jìn)炎癥及氧化應(yīng)激反應(yīng)，加速易損斑塊的不穩(wěn)定及破裂等而促進(jìn)AS的形成[12-13]。血管內(nèi)皮細(xì)胞功能損傷被認(rèn)為是AS的起始改變，受損的內(nèi)皮細(xì)胞在氧化應(yīng)激和炎癥刺激下可吸附單核細(xì)胞，吞噬脂質(zhì)成為成泡沫細(xì)胞，形成脂質(zhì)斑塊，使動(dòng)脈管腔狹窄，管壁失去彈性形成AS[4]。

氧化和抗氧化系統(tǒng)之間的平衡是維持內(nèi)皮細(xì)胞功能的關(guān)鍵因素。SOD是細(xì)胞內(nèi)的抗氧化酶，可通過(guò)清除超氧陰離子減輕活性氧(reactive oxygen species，ROS)損害從而保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞，其活性的高低可反映機(jī)體抗氧化損傷能力。脂質(zhì)在自由基作用下可發(fā)生過(guò)氧化反應(yīng)，其不飽和脂肪酸氧化終產(chǎn)物為MDA，可引起核酸及蛋白質(zhì)等生命大分子交聯(lián)聚合，產(chǎn)生細(xì)胞毒性，MDA含量的高低可反映內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷的嚴(yán)重程度。LDH存在于內(nèi)皮細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞受損時(shí)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)氧依賴性酶受到影響，細(xì)胞膜通透性增加，細(xì)胞外液LDH漏出量相應(yīng)增加，因此LDH含量的高低可反映內(nèi)皮細(xì)胞損傷程度。IL-6及TNF-α在AS慢性炎癥中扮演了重要角色，對(duì)巨噬、單核細(xì)胞的遷移和激活起了調(diào)控作用，并能促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞增殖，從而參與AS形成[14]。在Bcl-2家族中有促凋亡蛋白Bax和抑凋亡蛋白Bcl-2，Bax/Bcl-2比值的高低對(duì)細(xì)胞凋亡起了直接的調(diào)控作用[15]。本研究顯示PM2.5染毒EA.hy926細(xì)胞后，可顯著降低細(xì)胞內(nèi)SOD活性，增加細(xì)胞上清液中IL-6、TNF-α、MDA含量及LDH活性，顯著降低EA.hy926細(xì)胞存活率、增加細(xì)胞內(nèi)Bax/Bcl-2蛋白比率以促進(jìn)細(xì)胞凋亡，證實(shí)PM2.5可通過(guò)氧化應(yīng)激損傷及炎癥反應(yīng)途徑誘導(dǎo)EA.hy926細(xì)胞損傷。

氧化應(yīng)激及炎癥均可激活細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞凋亡信號(hào)級(jí)聯(lián)通路以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。p38 MAPK信號(hào)通路是MAPKs超家族分支之一，介導(dǎo)了調(diào)控炎癥、細(xì)胞應(yīng)激、生長(zhǎng)、發(fā)育、凋亡等多種生理、病理進(jìn)程，該通路的激活可通過(guò)上調(diào)肌球蛋白輕鏈激酶的表達(dá)促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞的異常增殖及內(nèi)皮細(xì)胞凋亡、吞噬脂質(zhì)形成泡沫細(xì)胞等促進(jìn)AS形成[16]。本研究顯示PM2.5染毒可顯著增加EA.hy926細(xì)胞內(nèi)p-p38 MAPK蛋白水平，證實(shí)PM2.5誘導(dǎo)EA.hy926細(xì)胞損傷，可能與激活p38 MAPK通路有關(guān)。

丹參酮IIA可通過(guò)抑制核因子κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)信號(hào)通路降低IL-6、IL-8、血管細(xì)胞黏附分子-1(vascular cell adhesion molecule 1，VCAM-1)及細(xì)胞間黏附分子-1(intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1)表達(dá)而抑制炎癥反應(yīng)；抑制活性氧的產(chǎn)生而抗氧化應(yīng)激；減少巨噬細(xì)胞內(nèi)膽固醇外流而調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝；下調(diào)表面抗原CD40表達(dá)而調(diào)節(jié)免疫功能；降低基質(zhì)金屬蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2，MMP-2)活性而穩(wěn)定AS斑塊等多途徑發(fā)揮抗AS作用[5-8]。SB203580是應(yīng)用最廣泛的p38 MAPK通路抑制劑，作為一種吡啶咪唑類化合物，SB203580占據(jù)催化位點(diǎn)但不阻礙上游激酶，不抑制P38 MAPK自身磷酸化作用，僅抑制p38 MAPK下游磷酸化過(guò)程，可特異性阻斷P38 MAPK信號(hào)通路。本研究結(jié)果證實(shí)，與PM2.5組比較，丹參酮IIA及SB203580均可不同程度拮抗PM2.5降低EA.hy926細(xì)胞存活率、降低Bax/Bcl-2蛋白比率以抑制EA.hy926細(xì)胞凋亡、降低EA.hy926細(xì)胞內(nèi)p-p38 MAPK蛋白水平、增加EA.hy926細(xì)胞內(nèi)SOD活性，降低細(xì)胞上清液中IL-6、TNF-α、MDA含量及LDH活性，提示丹參酮IIA抗AS機(jī)制之一可能是通過(guò)抑制P38 MAPK信號(hào)通路，減輕PM2.5誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷及炎癥反應(yīng)，從而保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞。

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(責(zé)任編輯： 陳妙玲， 羅森)

Tanshinone IIA attenuates PM2.5-induced vascular endothelial cell injury via p38 MAPK signal pathway

WAN Qiang1, YANG Yu-ping2, LIU Zhong-yong1

(1DepartmentofMedicalCardiology,2DepartmentofRespiratoryMedicine,TheAffiliatedHospitalofJiangxiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Nanchang330006,China.E-mail:liuzhongyong2014@163.com)

AIM: To investigate the effect and the mechanism of tanshinone IIA in attenuating PM2.5-induced human umbilical vein endothelial EA.hy926 cell injury. METHODS: The samples of fine particulate matter (PM2.5) were collected in Guangzhou and made into suspension. Different concentrations (0, 20, 200 and 400 mg/L) of PM2.5 were added to EA.hy926 cells. The viability and apoptosis of EA.hy926 cells, the protein levels of p-p38 MAPK, Bax and Bcl-2 in the EA.hy926 cells, the contents of interleukin-6 (IL-6), tumor necrosis factor-α (TNF-α) and malonaldehyde (MDA), and the activity of superoxide dismutase (SOD) and lactic dehydrogenase (LDH) in the EA.hy926 cell culture supernatant were measured by MTT assay, flow cytometry, Western blot, ELISA and colorimetry, respectively. Tanshinone IIA at different concentrations (5, 10 and 20 μmol/L) or a specific inhibitor of p38 MAPK pathway, SB203580 (20 μmol/L), was added into the EA.hy926 cells to observe the effect of tanshinone IIA. RESULTS: Compared with control group, PM2.5 significantly increased the apoptosis, the contents of IL-6, TNF-α and MDA, the activity of LDH, and the protein levels of p-p38 MAPK and Bax/Bcl-2 ratio, but decreased the viability and SOD activity in the EA.hy926 cells (P<0.05). Compared with PM2.5 group, tanshinone IIA significantly decreased the apoptosis, the contents of IL-6, TNF-α and MDA, the activity of LDH, and the protein levels of p-38 MAPK and Bax/Bcl-2 ratio, but increased the viability and SOD activity in the EA.hy926 cells (P<0.05). CONCLUSION: Tanshinone IIA attenuates PM2.5-induced EA.hy926 cell injury via the inhibition of p38 MAPK pathway.

PM2.5; Tanshinone IIA; p38 MAPK; Vascular endothelial cells

1000- 4718(2016)04- 0597- 05

2015- 10- 31

2015- 12- 17

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 81460680)；江西省科技計(jì)劃項(xiàng)目(No. 20135BBG70002)

Tel: 0791-86360490; E-mail: liuzhongyong2014@163.com

R285.5; R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.04.004

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