萬　強，　楊玉萍，　劉中勇△

(江西中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院 1心內(nèi)科， 2呼吸科，江西 南昌 330006)

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丹參酮IIA通過抑制p38 MAPK通路減輕PM2.5對血管內(nèi)皮細胞的損傷*

萬強1，楊玉萍2，劉中勇1△

(江西中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院1心內(nèi)科，2呼吸科，江西 南昌 330006)

目的： 探討PM2.5對EA.hy926型人臍靜脈內(nèi)皮細胞損傷的影響及丹參酮IIA在這一過程中的作用及機制。方法: 采集廣州城區(qū)大氣PM2.5并以不同質(zhì)量濃度(0、20、200、400 mg/L)染毒EA.hy926細胞24 h，MTT法測細胞存活率，流式細胞術(shù)測細胞凋亡，Western blot法測p-p38 MAPK、Bax和Bcl-2的蛋白水平，ELISA法測白細胞介素-6(IL-6)及腫瘤壞死因子-α(TNF-α)含量，并測定細胞丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)及乳酸脫氫酶(LDH)活性；分別加入丹參酮IIA(5、10、20 μmol/L)和p38 MAPK通路特異性阻滯劑SB203580 20 μmol/L檢測丹參酮IIA的干預(yù)作用及機制。結(jié)果: 與對照組比較，PM2.5染毒后呈劑量依賴性降低EA.hy926細胞的存活率，上調(diào)p-p38 MAPK蛋白水平及Bax/Bcl-2蛋白比率以促進細胞凋亡，誘導(dǎo)分泌IL-6及TNF-α，降低SOD活性，增加MDA含量及LDH活性，差異均有統(tǒng)計學顯著性(P<0.05)；丹參酮IIA呈劑量依賴性增加EA.hy926細胞的存活率，下調(diào)p-p38 MAPK蛋白水平及Bax/Bcl-2蛋白比率以抑制細胞凋亡，降低IL-6及TNF-α含量，增加SOD活性，降低MDA含量及LDH活性，差異均有統(tǒng)計學顯著性(P<0.05)。結(jié)論:丹參酮IIA可通過抑制p38 MAPK通路，減輕PM2.5對EA.hy926細胞的損傷。

PM2.5； 丹參酮IIA； p38 MAPK； 血管內(nèi)皮細胞

大氣污染可嚴重危害人類健康，不僅引起呼吸系統(tǒng)疾病，而且是心血管疾病(cardiovascular disease，CVD)一個獨立的可控制危險因素[1]。動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是CVD的病理基礎(chǔ)之一，研究表明大氣顆粒物(particulate matter，PM)尤其是其中空氣動力學直徑≤2.5 μm的細顆粒物(PM2.5)與AS的形成直接相關(guān)[2-3]。血管內(nèi)皮細胞損傷被認為是AS的起始病理環(huán)節(jié)，可作為預(yù)測CVD的指標之一而獨立存在[4]。丹參酮IIA(tanshinone IIA)為唇形科植物丹參中提取的主要脂溶性成分，可通過抑制炎癥反應(yīng)、抗氧化應(yīng)激損傷、調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、抑制血管平滑肌細胞增殖和遷移等多途徑顯著發(fā)揮抗AS效應(yīng)[5-8]，但其抗AS作用機制尚未完全闡明。本研究觀察PM2.5對EA.hy926型人臍靜脈內(nèi)皮細胞損傷的影響，加用丹參酮IIA和p38有絲分裂原激活蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase，p38 MAPK)信號通路特異性阻滯劑SB203580干預(yù)，探討丹參酮IIA對PM2.5損傷EA.hy926細胞的干預(yù)作用及可能機制。

材　料　和　方　法

1主要試劑與儀器

EA.hy926型人臍靜脈內(nèi)皮細胞株購自ATCC，增殖周期約為31 h；丹參酮IIA(純度≥98%)、二甲基亞砜(DMSO)及噻唑藍(MTT)均購自Sigma；胎牛血清和DMEM培養(yǎng)基均購自Gibco；p-p38 MAPK、Bcl-2及Bax抗體均購自CST；Annexin V-FITC試劑盒購自Bio Vision；白細胞介素-6(interleukin-6，IL-6)和腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)ELISA試劑盒購于eBioscience；丙二醛(malondialdehyde，MDA)、乳酸脫氫酶(lactic dehydrogenase，LDH)及超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。超凈臺、恒溫細胞培養(yǎng)箱、酶標儀及低溫高速離心機均購自Thermo；電泳儀購自Bio-Rad；熒光倒置顯微鏡購自O(shè)lympus。

2方法

2.1PM2.5的采集與制備根據(jù)廣州市環(huán)保局提供的空氣質(zhì)量指數(shù)和PM2.5監(jiān)測數(shù)據(jù)，于空氣質(zhì)量指數(shù)5級及以上的PM2.5嚴重超標的霧霾天氣，在廣州市區(qū)中心距離地面約50 m高建筑樓頂用MiniVol型便攜式PM2.5采樣器(Airmetrics)以流量為5 L/min進行24 h/d采樣，連續(xù)采樣3 d。將石英纖維濾膜(Whatman)剪成1 cm×3 cm大小置于去離子水中，超聲震蕩30 min×3次，提取液用6層無菌紗布過濾后，以10 000 r/min于4 ℃離心20 min，收集提取物真空冷凍干燥成干粉，稱重，于-20 ℃避光保存。用滅菌PBS配制成質(zhì)量濃度分別為20、200、400 mg/L的PM2.5混懸液。

2.2細胞分組及處理設(shè)PM2.5不同質(zhì)量濃度組，分別以0、20、200、400 mg/L作用EA.hy926細胞24 h[9]。分別設(shè)置：對照組；PM2.5組：PM2.5顆粒物混懸液200 mg/L染毒24 h；PM2.5+丹參酮IIA低、中、高組：分別以丹參酮IIA(5、10、20 μmol/L)預(yù)處理細胞1 h[10]后再加200 mg/L PM2.5染毒24 h；PM2.5+SB203580組：20 μmol/L SB203580預(yù)處理細胞30 min[11]后再加200 mg/L PM2.5染毒24 h。

2.3MTT法檢測細胞存活率EA.hy926細胞密度調(diào)至每孔1×104個接種至96孔培養(yǎng)板，每組設(shè)6個復(fù)孔，培養(yǎng)24 h后撤去血清。不同質(zhì)量濃度PM2.5混懸液染毒后加入20 μL MTT溶液(PBS溶解，濃度為5 g/L)室溫培養(yǎng)4 h，每孔加150 μL DMSO使還原產(chǎn)物完全溶解，低速振蕩10 min，酶標儀測波長570 nm處各孔吸光度(A)值。細胞存活率(%)=(實驗組A值-空白對照組A值)/(對照組A值-空白對照組A值)×100%。

2.4流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡EA.hy926細胞密度調(diào)至每孔2×105個接種至12孔培養(yǎng)板24 h，每組設(shè)6個復(fù)孔，加不含血清的培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h。收集細胞，PBS洗滌5 min×2次，加Annexin V-FITC及PI雙染，流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡。

2.5EA.hy926細胞IL-6、TNF-α及MDA含量，SOD及LDH活性的測定取對數(shù)生長期的EA.hy926細胞以1×108/L接種于培養(yǎng)皿。收集細胞，以1 000 r/min離心10 min，去除培養(yǎng)液，以2 mL PBS洗1次后加PBS 500 μL混懸。超聲5 s×5次，使細胞破碎，黃嘌呤氧化酶法檢測細胞裂解液中SOD活性。收集細胞上清液，ELISA法檢測IL-6及TNF-α含量，硫代巴比妥法檢測MDA含量，比色法檢測LDH活性，操作步驟參照說明書進行。

2.6Western blot法檢測Bax、Bcl-2和p-p38 MAPK蛋白水平提取EA.hy926細胞總蛋白，BCA法檢測蛋白濃度，煮沸5 min蛋白變性后進行SDS-PAGE，半干轉(zhuǎn)印，5%脫脂牛奶封閉2 h，加I抗(1∶1 000稀釋)于4 ℃反應(yīng)過夜，TBST洗膜3次，加 II 抗(1∶2 000稀釋)于室溫結(jié)合，TBST洗膜3次，化學發(fā)光檢測。以β-actin為內(nèi)參照蛋白，Quantity One軟件分析各條帶吸光度值。

3統(tǒng)計學處理

采用SPSS 13.0軟件進行分析，數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，多組間比較用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間比較采用Bonferroni法，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié)　　果

1PM2.5對EA.hy926細胞的影響

1.1PM2.5對EA.hy926細胞存活率的影響與對照組比較，200、400 mg/L PM2.5染毒24 h均可顯著降低EA.hy926細胞存活率，差異有統(tǒng)計學顯著性(P<0.05)，見表1。

表1PM2.5對EA.hy926細胞存活率，凋亡， IL-6、TNF-α及MDA含量，SOD及LDH活性的影響

Table 1.The effects of PM2.5 on viability, apoptosis, IL-6, TNF-α and MDA contents, and SOD and LDH activity in EA.hy926 cells (Mean±SD.n=3)

TreatmentViability(%)Apoptosis(%)IL-6(ng/L)TNF-α(ng/L)MDA(μmol/L)SOD(×103U/L)LDH(U/L)Control1002.25±0.21348.41±12.27168.42±6.551.21±0.1918.27±0.32623.26±41.33PM2.520mg/L97.88±0.312.72±0.18352.62±13.74171.24±7.321.24±0.1617.89±0.35631.58±46.33PM2.5200mg/L84.16±1.62*22.53±1.32*521.63±14.59*387.35±8.38*4.10±0.18*11.57±0.38*1127.49±60.42*PM2.5400mg/L67.31±1.54*43.68±1.73*563.46±13.23*423.74±9.46*5.47±0.21*8.03±0.24*1539.44±56.28*

*P<0.05vscontrol group.

1.2PM2.5對EA.hy926細胞凋亡的影響與對照組比較，200、400 mg/L PM2.5染毒24 h均可顯著誘導(dǎo)EA.hy926細胞凋亡，差異有統(tǒng)計學顯著性(P<0.05)，見表1。

1.3PM2.5對EA.hy926細胞IL-6、TNF-α及MDA含量，SOD及LDH活性的影響與對照組比較，200、400 mg/L PM2.5染毒24 h均可顯著降低EA.hy926細胞內(nèi)SOD活性(P<0.05)，顯著增加細胞上清液中IL-6、TNF-α、MDA含量及LDH活性，差異有統(tǒng)計學顯著性(P<0.05)，見表1。

1.4PM2.5對EA.hy926細胞內(nèi)Bax、Bcl-2及p-p38 MAPK蛋白表達的影響與對照組比較，200、400 mg/L PM2.5染毒24 h均可顯著增加EA.hy926細胞內(nèi)Bax及p-p38 MAPK蛋白表達，并顯著減少Bcl-2蛋白表達，增加Bax/Bcl-2蛋白比率，差異有統(tǒng)計學顯著性(P<0.05)，見圖1。

2丹參酮IIA對PM2.5損傷EA.hy926細胞的干預(yù)作用

2.1丹參酮IIA對PM2.5降低EA.hy926細胞存活率的干預(yù)作用與PM2.5組比較，10、20 μmol/L丹參酮IIA和20 μmol/L SB203580對于PM2.5降低EA.hy926細胞存活率均有顯著的拮抗作用，差異有統(tǒng)計學顯著性(P<0.05)，見表2。

2.2丹參酮IIA對PM2.5誘導(dǎo)EA.hy926細胞凋亡的干預(yù)作用與PM2.5組比較，10、20 μmol/L丹參酮IIA和20 μmol/L SB203580均可顯著減少由PM2.5誘導(dǎo)的EA.hy926細胞凋亡，差異有統(tǒng)計學顯著性(P<0.05)，見表2。

2.3丹參酮IIA對PM2.5影響EA.hy926細胞IL-6、TNF-α及MDA含量，SOD及LDH活性的干預(yù)作用與PM2.5組比較，10、20 μmol/L丹參酮IIA和20 μmol/L SB203580均可顯著增加EA.hy926細胞內(nèi)SOD活性，顯著降低細胞上清液中IL-6、TNF-α、MDA含量及LDH活性，差異有統(tǒng)計學顯著性(P<0.05)，見表2。2.4丹參酮IIA對PM2.5影響EA.hy926細胞內(nèi)Bax、Bcl-2及p-p38 MAPK蛋白表達的干預(yù)作用與PM2.5組比較，10、20 μmol/L丹參酮IIA和20 μmol/L SB203580均可顯著降低EA.hy926細胞內(nèi)Bax及p-p38 MAPK蛋白水平，并顯著增加Bcl-2蛋白的表達，減少Bax/Bcl-2蛋白比率，差異有統(tǒng)計學顯著性(P<0.05)，見圖2。

Figure 1.The effects of PM2.5 on the protein levels of p-P38 MAPK, Bax and Bcl-2 in the EA.hy926 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖1PM2.5對EA.hy926細胞內(nèi)p-p38 MAPK、Bax及Bcl-2蛋白水平的影響

表2丹參酮IIA及SB203580對PM2.5影響EA.hy926細胞存活率，凋亡， IL-6、TNF-α及MDA含量，SOD及LDH活性的干預(yù)作用

Table 2.The effects of tanshinone IIA and SB203580 on viability, apoptosis, IL-6, TNF-α and MDA contents, SOD and LDH activities in EA.hy926 cells (Mean±SD.n=3)

GroupViability(%)Apoptosis(%)IL-6(ng/L)TNF-α(ng/L)MDA(μmol/L)SOD(×103U/L)LDH(U/L)Control1002.23±0.17345.32±12.14166.38±6.471.23±0.1518.36±0.27620.24±44.52PM2.583.49±1.42*22.47±1.23*522.43±14.32*388.25±8.41*4.14±0.16*11.44±0.36*1141.38±59.43*PM2.5+tanshinoneⅡA5μmol/L84.41±1.3121.82±1.25518.21±15.26384.54±8.564.10±0.1411.52±0.261128.39±65.51PM2.5+tanshinoneⅡA10μmol/L88.52±1.41#16.41±1.38#462.34±14.63#321.21±7.39#3.22±0.21#13.98±0.32#959.32±54.33#PM2.5+tanshinoneⅡA20μmol/L91.43±1.22#9.56±0.82#383.56±12.49#245.42±7.14#2.35±0.27#16.57±0.38#768.38±56.26#PM2.5+SB20358088.35±1.15#14.37±1.16#485.46±15.18#347.58±8.04#3.51±0.24#14.36±0.31#824.90±52.57#

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsPM2.5 group.

Figure 2.The effects of tanshinone IIA and SB203580 on the protein levels of p-p38 MAPK,Bax and Bcl-2 in the EA.hy926 cells. A: control group; B: PM2.5 group; C: PM2.5+5 μmol/L tanshinone IIA group; D: PM2.5+10 μmol/L tanshinone IIA group; E: PM2.5+20 μmol/L tanshinone IIA group; F: PM2.5+SB203580 group. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsPM2.5 group.

圖2丹參酮IIA及SB203580對PM2.5影響EA.hy926細胞內(nèi)p-p38 MAPK、Bax及Bcl-2蛋白水平的干預(yù)作用

討　　論

PM2.5表面吸附的大量有毒、有害物質(zhì)可通過呼吸從肺泡上皮進入肺組織間隙，擴散至微血管作用于血管內(nèi)皮及凝血、纖溶系統(tǒng)，損傷心血管系統(tǒng)結(jié)構(gòu)及功能而形成CVD。各國的多中心、多種族臨床對照試驗證實長期慢性暴露在高濃度PM2.5環(huán)境中可通過炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、交感神經(jīng)興奮性增加等機制，增加動脈內(nèi)膜中層厚度、降低AS斑塊穩(wěn)定性，促進此人群AS的形成及發(fā)展[2-3]。動物研究亦發(fā)現(xiàn)接觸高濃度PM2.5可上調(diào)清道夫受體CD36的表達，誘導(dǎo)粥樣斑塊內(nèi)巨噬細胞內(nèi)膽固醇堆積；增加內(nèi)臟脂肪素表達；促進炎癥及氧化應(yīng)激反應(yīng)，加速易損斑塊的不穩(wěn)定及破裂等而促進AS的形成[12-13]。血管內(nèi)皮細胞功能損傷被認為是AS的起始改變，受損的內(nèi)皮細胞在氧化應(yīng)激和炎癥刺激下可吸附單核細胞，吞噬脂質(zhì)成為成泡沫細胞，形成脂質(zhì)斑塊，使動脈管腔狹窄，管壁失去彈性形成AS[4]。

氧化和抗氧化系統(tǒng)之間的平衡是維持內(nèi)皮細胞功能的關(guān)鍵因素。SOD是細胞內(nèi)的抗氧化酶，可通過清除超氧陰離子減輕活性氧(reactive oxygen species，ROS)損害從而保護內(nèi)皮細胞，其活性的高低可反映機體抗氧化損傷能力。脂質(zhì)在自由基作用下可發(fā)生過氧化反應(yīng)，其不飽和脂肪酸氧化終產(chǎn)物為MDA，可引起核酸及蛋白質(zhì)等生命大分子交聯(lián)聚合，產(chǎn)生細胞毒性，MDA含量的高低可反映內(nèi)皮細胞氧化損傷的嚴重程度。LDH存在于內(nèi)皮細胞，當細胞受損時細胞膜結(jié)構(gòu)和細胞質(zhì)內(nèi)氧依賴性酶受到影響，細胞膜通透性增加，細胞外液LDH漏出量相應(yīng)增加，因此LDH含量的高低可反映內(nèi)皮細胞損傷程度。IL-6及TNF-α在AS慢性炎癥中扮演了重要角色，對巨噬、單核細胞的遷移和激活起了調(diào)控作用，并能促進血管平滑肌細胞增殖，從而參與AS形成[14]。在Bcl-2家族中有促凋亡蛋白Bax和抑凋亡蛋白Bcl-2，Bax/Bcl-2比值的高低對細胞凋亡起了直接的調(diào)控作用[15]。本研究顯示PM2.5染毒EA.hy926細胞后，可顯著降低細胞內(nèi)SOD活性，增加細胞上清液中IL-6、TNF-α、MDA含量及LDH活性，顯著降低EA.hy926細胞存活率、增加細胞內(nèi)Bax/Bcl-2蛋白比率以促進細胞凋亡，證實PM2.5可通過氧化應(yīng)激損傷及炎癥反應(yīng)途徑誘導(dǎo)EA.hy926細胞損傷。

氧化應(yīng)激及炎癥均可激活細胞內(nèi)的細胞凋亡信號級聯(lián)通路以誘導(dǎo)細胞凋亡。p38 MAPK信號通路是MAPKs超家族分支之一，介導(dǎo)了調(diào)控炎癥、細胞應(yīng)激、生長、發(fā)育、凋亡等多種生理、病理進程，該通路的激活可通過上調(diào)肌球蛋白輕鏈激酶的表達促進血管平滑肌細胞的異常增殖及內(nèi)皮細胞凋亡、吞噬脂質(zhì)形成泡沫細胞等促進AS形成[16]。本研究顯示PM2.5染毒可顯著增加EA.hy926細胞內(nèi)p-p38 MAPK蛋白水平，證實PM2.5誘導(dǎo)EA.hy926細胞損傷，可能與激活p38 MAPK通路有關(guān)。

丹參酮IIA可通過抑制核因子κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)信號通路降低IL-6、IL-8、血管細胞黏附分子-1(vascular cell adhesion molecule 1，VCAM-1)及細胞間黏附分子-1(intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1)表達而抑制炎癥反應(yīng)；抑制活性氧的產(chǎn)生而抗氧化應(yīng)激；減少巨噬細胞內(nèi)膽固醇外流而調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝；下調(diào)表面抗原CD40表達而調(diào)節(jié)免疫功能；降低基質(zhì)金屬蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2，MMP-2)活性而穩(wěn)定AS斑塊等多途徑發(fā)揮抗AS作用[5-8]。SB203580是應(yīng)用最廣泛的p38 MAPK通路抑制劑，作為一種吡啶咪唑類化合物，SB203580占據(jù)催化位點但不阻礙上游激酶，不抑制P38 MAPK自身磷酸化作用，僅抑制p38 MAPK下游磷酸化過程，可特異性阻斷P38 MAPK信號通路。本研究結(jié)果證實，與PM2.5組比較，丹參酮IIA及SB203580均可不同程度拮抗PM2.5降低EA.hy926細胞存活率、降低Bax/Bcl-2蛋白比率以抑制EA.hy926細胞凋亡、降低EA.hy926細胞內(nèi)p-p38 MAPK蛋白水平、增加EA.hy926細胞內(nèi)SOD活性，降低細胞上清液中IL-6、TNF-α、MDA含量及LDH活性，提示丹參酮IIA抗AS機制之一可能是通過抑制P38 MAPK信號通路，減輕PM2.5誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷及炎癥反應(yīng)，從而保護血管內(nèi)皮細胞。

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(責任編輯： 陳妙玲， 羅森)

Tanshinone IIA attenuates PM2.5-induced vascular endothelial cell injury via p38 MAPK signal pathway

WAN Qiang1, YANG Yu-ping2, LIU Zhong-yong1

(1DepartmentofMedicalCardiology,2DepartmentofRespiratoryMedicine,TheAffiliatedHospitalofJiangxiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Nanchang330006,China.E-mail:liuzhongyong2014@163.com)

AIM: To investigate the effect and the mechanism of tanshinone IIA in attenuating PM2.5-induced human umbilical vein endothelial EA.hy926 cell injury. METHODS: The samples of fine particulate matter (PM2.5) were collected in Guangzhou and made into suspension. Different concentrations (0, 20, 200 and 400 mg/L) of PM2.5 were added to EA.hy926 cells. The viability and apoptosis of EA.hy926 cells, the protein levels of p-p38 MAPK, Bax and Bcl-2 in the EA.hy926 cells, the contents of interleukin-6 (IL-6), tumor necrosis factor-α (TNF-α) and malonaldehyde (MDA), and the activity of superoxide dismutase (SOD) and lactic dehydrogenase (LDH) in the EA.hy926 cell culture supernatant were measured by MTT assay, flow cytometry, Western blot, ELISA and colorimetry, respectively. Tanshinone IIA at different concentrations (5, 10 and 20 μmol/L) or a specific inhibitor of p38 MAPK pathway, SB203580 (20 μmol/L), was added into the EA.hy926 cells to observe the effect of tanshinone IIA. RESULTS: Compared with control group, PM2.5 significantly increased the apoptosis, the contents of IL-6, TNF-α and MDA, the activity of LDH, and the protein levels of p-p38 MAPK and Bax/Bcl-2 ratio, but decreased the viability and SOD activity in the EA.hy926 cells (P<0.05). Compared with PM2.5 group, tanshinone IIA significantly decreased the apoptosis, the contents of IL-6, TNF-α and MDA, the activity of LDH, and the protein levels of p-38 MAPK and Bax/Bcl-2 ratio, but increased the viability and SOD activity in the EA.hy926 cells (P<0.05). CONCLUSION: Tanshinone IIA attenuates PM2.5-induced EA.hy926 cell injury via the inhibition of p38 MAPK pathway.

PM2.5; Tanshinone IIA; p38 MAPK; Vascular endothelial cells

1000- 4718(2016)04- 0597- 05

2015- 10- 31

2015- 12- 17

國家自然科學基金資助項目(No. 81460680)；江西省科技計劃項目(No. 20135BBG70002)

Tel: 0791-86360490; E-mail: liuzhongyong2014@163.com

R285.5; R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.04.004

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