李　佳，　辛　毅，　崔　巍，　劉　颯，　黃然然，　陳　娟，　周　潔△，　李　娜△

(1首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京安貞醫(yī)院，北京 100029； 2華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)系，湖北 武漢 430030； 3北京市心肺血管疾病研究所，北京 100029)

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·論著·

人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞外泌小體保護(hù)缺氧復(fù)氧損傷的心肌細(xì)胞*

李佳2，辛毅1,3，崔巍1,3，劉颯1,3，黃然然1,3，陳娟2，周潔2△，李娜1,3△

(1首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京安貞醫(yī)院，北京 100029；2華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)系，湖北 武漢 430030；3北京市心肺血管疾病研究所，北京 100029)

目的： 研究人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(human umbilical mesenchymal stem cells，HUMSCs)外泌小體對心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷后細(xì)胞凋亡的作用，并分析外泌小體內(nèi)具有心臟保護(hù)作用的微小RNA(microRNA,miRNA)表達(dá)水平。方法：酶消化法培養(yǎng)HUMSCs并對其免疫表型進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)鑒定；收集培養(yǎng)的第3代HUMSCs上清液，利用試劑盒提取外泌小體，電鏡觀察其形態(tài)結(jié)構(gòu)，并采用Western blot 法鑒定試劑盒所提物質(zhì)CD63蛋白水平的表達(dá)；用提取的外泌小體處理缺氧復(fù)氧條件下的心肌細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)Annexin V-FITC/PI標(biāo)記法觀察外泌小體對心肌細(xì)胞凋亡的影響；實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測外泌小體中miRNA的表達(dá)水平；miR-22抑制劑處理缺氧復(fù)氧條件下的心肌細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)檢測心肌細(xì)胞的凋亡。結(jié)果：流式細(xì)胞術(shù)檢測第3代HUMSCs的CD105、CD73和CD90呈高表達(dá),而CD45、CD34、CD11b、CD79a、CD19和HLA-DR 的表達(dá)陽性率低，說明第3代培養(yǎng)的HUMSCs具有間充質(zhì)干細(xì)胞的特異性表型特征。向骨細(xì)胞分化誘導(dǎo)HUMSCs，鈣結(jié)節(jié)形成明顯，經(jīng)茜素紅染色呈紅色結(jié)節(jié)，分化率為(92.5±5.1)%以上。經(jīng)向脂肪細(xì)胞分化，細(xì)胞見脂滴形成，油紅染色將脂滴染成紅色，分化率為(91.6±3.8)%以上，說明第3代培養(yǎng)的HUMSCs具有間充質(zhì)干細(xì)胞的多向分化能力。掃描電鏡觀察可見外泌小體球狀結(jié)構(gòu)，并且外泌小體特異性蛋白CD63表達(dá)強(qiáng)陽性。 缺氧復(fù)氧導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡率明顯增加(P<0.05)。在缺氧復(fù)氧條件下，外泌小體處理使心肌細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.05)。不同濃度外泌小體處理心肌細(xì)胞，其抗細(xì)胞凋亡作用無明顯變化(P>0.05)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測外泌小體中富含miR-1a、miR-22、miR-24、miR-133a 和miR-139-5p，其中miR-22表達(dá)水平最高；在缺氧復(fù)氧條件下miR-22抑制劑處理心肌細(xì)胞，細(xì)胞凋亡率明顯增加(P<0.05)。 結(jié)論：人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞外泌小體可有效減少缺氧復(fù)氧條件下的心肌細(xì)胞凋亡，其抗凋亡作用與外泌小體富含的miR-22密切相關(guān)。

人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞； 外泌小體； 微小RNA； 心肌細(xì)胞； 缺氧； 復(fù)氧

缺氧復(fù)氧損傷引起心肌細(xì)胞凋亡、心臟纖維化和心室重構(gòu),最終導(dǎo)致心衰，嚴(yán)重威脅人類健康和生命。間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)具有多向分化潛能、并可通過旁分泌作用改善心梗局部炎癥反應(yīng)、抑制心肌細(xì)胞的凋亡而成為干細(xì)胞治療心肌梗死的潛能細(xì)胞。大量的臨床試驗(yàn)結(jié)果表明，MSCs 移植治療急性心肌梗死和慢性心衰可使患者的心臟射血分?jǐn)?shù)提高4.5%～11.3%[1]。但MSCs在心肌缺氧復(fù)氧損傷中發(fā)揮心臟保護(hù)功能的相關(guān)機(jī)制尚不甚清楚。深入研究MSCs 發(fā)揮心臟保護(hù)功能的機(jī)制對于MSCs 治療心肌缺血性疾病具有重要的臨床指導(dǎo)意義。

外泌小體(exosome)是一種直徑在30～120 nm、含有RNA和蛋白質(zhì)的微小囊泡，具有脂質(zhì)雙層膜結(jié)構(gòu)，由幾乎所有類型的細(xì)胞分泌而來，同時(shí)在體液如血液、唾液、尿液和乳汁中大量發(fā)現(xiàn)。最近研究表明外泌小體可以起到間接傳遞信號分子給其它細(xì)胞從而改變其細(xì)胞功能的作用，如腫瘤的生長與遷移、組織損傷的修復(fù)等[2]。但是HUMSCs外泌小體對于心肌細(xì)胞在缺氧復(fù)氧條件下的保護(hù)作用及其內(nèi)相關(guān)microRNA表達(dá)尚不甚清楚。本研究利用人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(human umbilical mesenchymal stem cells，HUMSCs)外泌小體處理小鼠心肌細(xì)胞，觀察其對心肌細(xì)胞凋亡的作用，并進(jìn)一步研究HUMSCs外泌小體中與心臟保護(hù)作用相關(guān)microRNA的表達(dá)，探討HUMSCs通過旁分泌機(jī)制保護(hù)心肌細(xì)胞減少凋亡的機(jī)制。

材　料　和　方　法

1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和材料

SPF級C57BL/6乳小鼠，雌雄不限，1～2日齡，體質(zhì)量1.2～1.5 g來源于斯貝福(北京)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司；人臍帶標(biāo)本取自首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京安貞醫(yī)院婦產(chǎn)科當(dāng)日剖宮產(chǎn)健康嬰兒，產(chǎn)婦體健，年齡<35歲，胎齡為38～40周，無肝炎、梅毒、艾滋病等傳染病，無遺傳性疾病史，產(chǎn)婦及家屬對臍帶用于實(shí)驗(yàn)研究均知情同意，并經(jīng)北京安貞醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

2主要試劑

DMEM/F12 培養(yǎng)基、胎牛血清(fetal bovine se-rum，F(xiàn)BS)、Ⅱ型膠原酶和胰蛋白酶購自Gibco；青、鏈霉素混合液購自Solaribio；0.01 mmol/L 磷酸鹽緩沖溶液(PBS)購自HyClone；成脂和成骨誘導(dǎo)試劑盒購自Millipore；心肌細(xì)胞培養(yǎng)基(cardiac myocyte me-dium，CMM)購自ScienCell；外泌小體提取試劑盒和外泌小體RNA與蛋白分離試劑盒均購自Life Technologies；CD63兔多克隆抗體購自Santa Cruz；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Thermo；IRDye標(biāo)記的山羊抗兔IgG購自LI-COR；流式細(xì)胞術(shù)采用的熒光團(tuán)標(biāo)記的小鼠抗人抗體: FITC-CD90、PE-CD105、FITC-CD73、PE-CD45、APC-CD34、PECD79a、APC-CD11b、APC-CD19、PEcy5；5-HLA-DR 及同型對照抗體、FITC Annexin V凋亡檢測試劑盒購自BD；實(shí)驗(yàn)中所用引物U6、miR-1a、miR-22、miR24、miR-133a 和miR-139-5p，以及inhibitor negative control # 22和miR-22 inhibitor均購自廣州市銳博生物科技有限公司。

3主要方法

3.1原代人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)將符合入選標(biāo)準(zhǔn)的新鮮臍帶置于預(yù)冷的含10%雙抗的1×PBS的培養(yǎng)皿中清洗3次，分別剪取臍帶4 cm兩段，剖開臍帶去除其內(nèi)的動(dòng)脈及靜脈血管后得到臍帶華通膠組織，再次分別置于含10%雙抗的1×PBS中清洗3次，去除血污抗菌，將臍帶剪碎成約1 mm×1 mm×1 mm的組織塊，加入2 g/L Ⅱ型膠原酶與2 g/L透明質(zhì)酸酶(1∶1) 混合消化液，37 ℃、100 r/min 水浴搖床消化60～90 min，用移液管輕柔吹打，重復(fù)消化2～3 次，過200 目銅網(wǎng)純化。收集溶液，1 000 r/min離心5 min，棄上清，將沉淀溶解，細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中，置于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔日更換培養(yǎng)基，適時(shí)傳代[3]。

3.2原代心肌細(xì)胞的培養(yǎng)取新生C57乳鼠的心臟置于含有10%雙抗的1×PBS 中，去除心臟組織中的血及雜質(zhì)，將心臟組織剪碎，加入0.2%的膠原酶Ⅱ消化，37 ℃條件下孵育30 min，用移液管輕柔吹打混勻，過200目銅網(wǎng)，收集溶液，1 000 r/min離心5 min，棄上清，將沉淀溶解，細(xì)胞種于培養(yǎng)皿中，孵箱中貼壁1 h，收集未貼壁細(xì)胞，計(jì)數(shù)，以5×105/cm2接種于培養(yǎng)板中。

3.3HUMSCs外泌小體的提取HUMSCs傳至第3代后，以5×106個(gè)細(xì)胞接種于75 cm2的培養(yǎng)瓶中，加入10 mL無血清培養(yǎng)基，培養(yǎng)3 d后，收集無血清培養(yǎng)基，將培養(yǎng)基10 000 r/min離心30 min，去除細(xì)胞殘?jiān)碗s質(zhì)，吸取上清，按每1 mL細(xì)胞培養(yǎng)基體積，加入500 μL外泌小體提取試劑充分混勻，4 ℃孵育過夜，10 000×g離心1 h，沉淀即為外泌小體，以1 mL的初始細(xì)胞培養(yǎng)基體積加入25 μL的1×PBS重懸沉淀，以此作為外泌小體實(shí)驗(yàn)原液，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

3.4細(xì)胞缺氧復(fù)氧(anoxia/reoxygenation，A/R)模型的建立心肌細(xì)胞的培養(yǎng)基更換成經(jīng)氮?dú)馓幚淼牡脱醯脱迮囵B(yǎng)基，置于Thermo的低氧培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行缺氧處理60 min 后更換成含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基，置于5% CO2、37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)復(fù)氧6 h, 進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)檢測。

3.5電鏡觀察外泌小體的結(jié)構(gòu)收集培養(yǎng)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的上清液，經(jīng)外泌小體提取試劑盒提純外泌小體，離心后在管底可見少量的白色沉淀物。用1×PBS溶解，經(jīng)2.5%戊二醛固定、脫水后，利用掃描電鏡觀察。

3.6Western blot 法檢測HUMSCs外泌小體蛋白水平CD63的表達(dá)溶于1×PBS的外泌小體置于冰上，加入5×SDS-PAGE，30 min混勻，經(jīng)SDS-PAGE 蛋白分離后，將其轉(zhuǎn)移至0.45 μm孔徑NC膜上，轉(zhuǎn)膜2 h，50 g/L 脫脂奶粉室溫封閉1 h; 分別加入CD63抗體(1∶200)，4 ℃過夜；TBST洗膜8 min×3 次，分別加入IRDye標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1∶8 000)，室溫孵育2 h; TBST洗膜8 min×3次，Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行圖像掃描和分析。

3.7實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測HUMSCs外泌小體microRNA的表達(dá)利用外泌小體總RNA分離試劑盒提取微小RNA，應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA ，反轉(zhuǎn)錄進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。利用Bio-Rad實(shí)時(shí)定量PCR儀檢測，反應(yīng)程序設(shè)定為94 ℃ 5 min;94 ℃ 18 s, 60 ℃ 18 s,55 ℃ 6 s,擴(kuò)增40 個(gè)循環(huán);從55 ℃ 開始繪制熔解曲線。

3.8心肌細(xì)胞凋亡的檢測將1×106個(gè)心肌細(xì)胞接種于24孔板中，培養(yǎng)24 h后更換心肌細(xì)胞培養(yǎng)液，1%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行饑餓處理24 h，按實(shí)驗(yàn)分組分別加入不同濃度外泌小體處理24 h、miR-22抑制劑處理48 h后，用2.5 g/L 胰蛋白酶消化，1 000 r/min離心5 min，棄上清，利用Annexin V-FITC/PI檢測試劑盒中的1×buffer重懸細(xì)胞，1 000 r/min 離心5 min，棄上清，一組空白，一組只加5 μL FITC 標(biāo)記的Annexin V，一組只加5 μL碘化丙啶(propidium iodide，PI)溶液，其它各組分別加入5 μL FITC 標(biāo)記的Annexin V和5 μL 濃度為20 mg/L 的PI溶液，混勻后室溫避光孵育15 min，加入300 μL 1×buffer終止反應(yīng)，混勻，立即用流式細(xì)胞儀檢測分析。

4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件Prism GraphPad進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SEM)表示，2 組比較采用t檢驗(yàn)，多組比較采用單因素方差分析，方差分析后各組間的兩兩比較采用Bonferroni校正的t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)　　果

1人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的分離與鑒定

用流式細(xì)胞術(shù)檢測第3代HUMSCs 的CD105、CD73和CD90 表達(dá)陽性率高,分別為(99.4±1.62)%、(99.1±2.41)%和(99.5±2.41)%，而CD45、CD34、CD11b、CD79a、CD19和HLA-DR 的表達(dá)陽性率低，分別為(0.2±0.08)%、(0.8±0.09)%、(0.2±0.08)%、(0.2±0.06)%、(0.2±0.04)%和(0.1±0.08)%，說明第3代培養(yǎng)的HUMSCs具有MSCs特異性表型特征，見圖1A；向骨細(xì)胞分化誘導(dǎo)HUMSCs可見鈣結(jié)節(jié)形成明顯，經(jīng)茜素紅染色呈紅色結(jié)節(jié)，分化率為(92.5±5.1)%以上，見圖1B；經(jīng)向脂肪細(xì)胞分化的細(xì)胞見脂滴形成，油紅染色將脂滴染成紅色，分化率為(91.6±3.8)%以上，見圖1C，說明培養(yǎng)的第3代HUMSCs具有MSCs多向分化能力。

Figure 1.Phynotype and differentiation of HUMSCs. A: phenotype of HUMSCs; B: differentiation of HUMSCs towards the osteogenic progenitors (Alizarin red staining, ×100); C: HUMSCs differentiated into adipocytes (oil red O staining).

圖1人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的分離與鑒定

2間充質(zhì)干細(xì)胞外泌小體的分離與鑒定

經(jīng)外泌小體提取試劑盒提純的外泌小體經(jīng)離心后在管底可見少量的白色沉淀物。用25 μL 1×PBS溶解，經(jīng)2.5%戊二醛固定、脫水后，利用掃描電鏡觀察，可清晰地看到外泌小體的球狀結(jié)構(gòu)，見圖2A；Western blot檢測外泌小體中的CD63蛋白表達(dá)水平，并利用細(xì)胞培養(yǎng)上清作為陰性對照。從灰度圖中可看出沉淀即提取物在CD63蛋白水平上表達(dá)強(qiáng)陽性，見圖2B，提取的外泌小體高表達(dá)外泌小體特異性標(biāo)志物CD63。

Figure 2.Isolation and identification the exosome of the HUMSCs. A: scanning electron microscopy showed the globular structure of the exosome; B: the exosome-specific protein CD63 was strongly positive identified by Western blot.

圖2間充質(zhì)干細(xì)胞外泌小體的分離與鑒定

3外泌小體對心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧后細(xì)胞凋亡的作用

心肌細(xì)胞經(jīng)Annexin V-FITC/PI標(biāo)記采用流式細(xì)胞術(shù)檢測凋亡，缺氧復(fù)氧處理后的心肌細(xì)胞凋亡率明顯增加(P<0.05)，利用外泌小體處理缺氧復(fù)氧組可顯著減少細(xì)胞的凋亡率(P<0.05)；為觀察不同濃度的外泌小體對心肌細(xì)胞凋亡的作用，將外泌小體實(shí)驗(yàn)原液與培養(yǎng)基以1∶100、2∶100、3∶100混合后處理心肌細(xì)胞，觀察其是否仍具有同樣的抗細(xì)胞凋亡作用，結(jié)果顯示差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見圖3。

Figure 3.Apoptosis of the cardiomyocytes treated with HUMSCs exosomes (EXO) after anoxia and reoxygenation (A/R). Mean±SEM.n=4.*P<0.05,**P<0.01vscontrol.

圖3外泌小體對心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧后細(xì)胞凋亡的作用

4實(shí)時(shí)熒光定量 PCR驗(yàn)證MSCs外泌小體中microRNA表達(dá)

我們利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測HUMSCs外泌小體中與心臟保護(hù)相關(guān)microRNA的表達(dá)水平。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示外泌小體富含miR-1a、miR-22、miR-24、miR-133a和miR-139p，其中miR-22的表達(dá)水平最高，達(dá)到內(nèi)參照U6的(270.4±9.7)倍，見圖4。

Figure 4.The microRNA expression levels in the exosomes detected by real-time PCR. Mean±SEM.n=4.

圖4Real-time PCR驗(yàn)證HUMSCs外泌小體中microRNA的表達(dá)

5miR-22抑制心肌細(xì)胞凋亡

利用miR-22抑制劑處理心肌細(xì)胞可增加缺氧復(fù)氧后細(xì)胞凋亡率(P<0.05)，說明外泌小體中富含的miR-22可有效抑制心肌細(xì)胞的凋亡，見圖5。

Figure 5.Apoptosis of the cardiomyocytes treated with miR-22 inhibitor after anoxia and reoxygenation (A/R). miR-22 INC: miR-22 inhibitor negative control; miR-22 INH: miR-22 inhibitor. Mean±SEM.n=3.*P<0.05vsA/R+miR-22 INC.

圖5miR-22抑制缺氧復(fù)氧后心肌細(xì)胞的凋亡

討　　論

心肌缺血再灌注損傷導(dǎo)致氧自由基增加和細(xì)胞鈣超載引起心肌細(xì)胞凝固型壞死、間質(zhì)細(xì)胞水腫、大量炎癥細(xì)胞浸潤等，從而導(dǎo)致患者心功能的嚴(yán)重受損[4]。研究結(jié)果表明，MSCs 發(fā)揮心臟保護(hù)功能主要是通過旁分泌細(xì)胞因子、生長因子等，抑制心肌缺血區(qū)局部炎癥的級聯(lián)反應(yīng)、抑制心肌細(xì)胞凋亡、促進(jìn)局部血管新生[5]。MSCs不僅旁分泌細(xì)胞因子，而且能夠旁分泌具有生物活性的microRNA，在抑制心肌細(xì)胞凋亡、拮抗心肌肥大、改善血管新生等方面起重要的調(diào)控作用。

本研究成功培養(yǎng)具有MSCs特異性表型特征的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞。并且發(fā)現(xiàn)外泌小體處理缺氧復(fù)氧條件下的心肌細(xì)胞，其凋亡率較單純?nèi)毖鯊?fù)氧組有顯著降低，說明外泌小體在缺氧復(fù)氧條件下抑制心肌細(xì)胞的凋亡起到了一定的關(guān)鍵性作用；不同濃度外泌小體處理心肌細(xì)胞后，其抗細(xì)胞凋亡作用并無明顯變化，外泌小體的作用達(dá)到生物學(xué)劑量后，對細(xì)胞凋亡的影響趨向于穩(wěn)定，繼續(xù)增加劑量其抗凋亡作用不會(huì)進(jìn)一步增加。

MicroRNA 廣泛參與心臟病理和生理過程的調(diào)節(jié)。既往研究成果顯示microRNA 在心肌細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞的分化、心肌細(xì)胞凋亡、心肌缺血區(qū)炎癥級聯(lián)反應(yīng)等方面都起到重要的調(diào)控作用[6]。心肌梗死急性發(fā)作時(shí)， miR-1、miR-133a、miR-499 和miR-208a在患者血清中表達(dá)迅速增加，參與心肌細(xì)胞缺血預(yù)適應(yīng)，可作為急性心肌梗死的預(yù)警標(biāo)志物[7]。過表達(dá)miR-499 和miR-1 可間接上調(diào)肌球蛋白重鏈(myosin heavy chain，MHC)和心肌轉(zhuǎn)錄因子Mef2c，促進(jìn)MSCs 向心肌細(xì)胞方向分化[8]。miR-1 通過靶向性抑制Bcl-2 減少細(xì)胞凋亡率，從而降低大鼠心肌缺血再灌注損傷[9]。miR-133、miR-210 和miR-21 通過抑制caspase 級聯(lián)反應(yīng)從而抑制心肌細(xì)胞凋亡[10]。本實(shí)驗(yàn)通過對外泌小體內(nèi)可能與心臟保護(hù)作用相關(guān)microRNAs的分析，發(fā)現(xiàn)外泌小體富含miR-1a、miR-22、 miR-24、miR-133a和miR-139p，說明microRNA可能是外泌小體起到心臟保護(hù)作用的重要因素。

近來研究發(fā)現(xiàn)，miR-22在腫瘤發(fā)生、細(xì)胞凋亡、心肌細(xì)胞肥大中起重要的調(diào)控作用。在神經(jīng)系統(tǒng)中，miR-22過表達(dá)通過抑制絲裂原活化蛋白激酶(MAPK14/p38)和腫瘤蛋白p53誘導(dǎo)核蛋白1(tumor protein p53-inducible nuclear protein 1，Tp53inp1) 能夠有效抑制細(xì)胞凋亡，從而起到神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用[11]。在后負(fù)荷增加條件下，miR-22基因敲除鼠肌漿網(wǎng)鈣負(fù)荷降低較容易發(fā)生心肌細(xì)胞肥大和心室擴(kuò)張[12]。最近研究表明，缺氧導(dǎo)致MSCs分泌富含miR-22的外泌小體可通過下調(diào)Mecp2而減少心肌細(xì)胞凋亡[13]。以上研究結(jié)果提示miR-22是參與調(diào)控細(xì)胞凋亡的重要因子。

我們發(fā)現(xiàn)外泌小體富含miR-1a、miR-22、miR-24、miR-133a和miR-139p。其中miR-22表達(dá)水平最高，達(dá)到內(nèi)參照U6的(270.4±9.7)倍，提示外泌小體發(fā)揮作用可能與外泌小體內(nèi)的miR-22有關(guān)；在缺氧復(fù)氧條件下miR-22抑制劑處理心肌細(xì)胞后，其細(xì)胞凋亡率明顯增加，說明miR-22在心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷下起到了一定的保護(hù)作用。

本課題組前期已證實(shí)臍帶MSCs 較骨髓MSCs 具有較強(qiáng)的增殖能力及分化潛能[14]，而且多次尾靜脈注射HUMSCs，未引起大鼠Th1、Th2 細(xì)胞免疫和體液免疫系統(tǒng)的變化，Th1/Th2 軸無明顯改變；移植的HUMSCs 能較長時(shí)間地存活于大鼠骨髓內(nèi)，具有較好的免疫相容性[15]。故本實(shí)驗(yàn)取材于人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，該材料具有方便的可獲得性，對受試對象無傷害，免疫原性低、不涉及法律倫理問題的優(yōu)勢，為減少心肌缺氧復(fù)氧損傷提供了另一種可有效利用的材料。我們成功提取人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞外泌小體，并驗(yàn)證了外泌小體在心肌缺氧復(fù)氧條件下減少心肌細(xì)胞凋亡，對心肌細(xì)胞起到了一定的保護(hù)作用。與此同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步提示外泌小體起到心肌細(xì)胞保護(hù)作用的關(guān)鍵性因素可能源于外泌小體富含的miRNA-22。本研究為臨床干細(xì)胞治療心臟缺血再灌注損傷提供了一個(gè)新的理論基礎(chǔ)。外泌小體中富含的miR-22可能成為干細(xì)胞治療的新靶點(diǎn)。

[1]Strauer BE, Steinhoff G. 10 years of intracoronary and intramyocardial bone marrow stem cell therapy of the heart: from the methodological origin to clinical practice[J]. J Am Coll Cardiol, 2011, 58(11):1095-1104.

[2]Vlassov AV, Magdaleno S, Setterquist R, et al. Exosomes: current knowledge of their composition, biological functions, and diagnostic and therapeutic potentials[J]. Biochim Biophys Acta, 2012, 1820(7):940-948.

[3]辛毅，李娜，黃益民，等. 人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的原代培養(yǎng)及多向分化潛能的研究[J]. 細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志, 2013, 29(10):1087-1093.

[4]Frank A, Bonney M, Bonney S, et al. Myocardial ischemia reperfusion injury: from basic science to clinical bedside[J]. Semin Cardiothorac Vasc Anesth,2012, 16(3):123-132.

[5]Wen Z, Zheng S, Zhou C, et al. Repair mechanisms of bone marrow mesenchymal stem cells in myocardial infarction[J]. J Cell Mol Med, 2011, 15(5):1032-1043.

[6]Wen Z, Zheng S, Zhou C, et al. Bone marrow mesenchymal stem cells for post-myocardial infarction cardiac repair: microRNAs as novel regulators[J]. J Cell Mol Med, 2012, 16(4):657-671.

[7]Tijsen AJ, Pinto YM, Creemers EE. Circulating microRNAs as diagnostic biomarkers for cardiovascular diseases[J]. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2012, 303(9):H1085-H1095.

[8]Takaya T, Nishi H, Horie T， et al. Roles of microRNAs and myocardial cell differentiation[J]. Prog Mol Biol Transl Sci, 2012, 111:139-152.

[9]Tang Y, Zheng J, Sun Y, et al. MicroRNA-1 regulates cardiomyocyte apoptosis by targeting Bcl-2[J]. Int Heart J, 2009, 50(3):377-387.

[10]王家驥，賈竹青，周春燕. microRNA 在心臟發(fā)育和心臟疾病中的作用[J]. 中國科學(xué), 2012, 42(12): 957-966.

[11]Jovicic A, Zaldivar Jolissaint JF, Moser R, et al. MicroRNA-22 (miR-22) overexpression is neuroprotective via general anti-apoptotic effects and may also target specific Huntington′s disease-related mechanisms[J]. PLoS One, 2013, 8(1):e54222.

[12]Huang ZP, Chen J, Seok HY, et al. MicroRNA-22 regulates cardiac hypertrophy and remodeling in response to stress [J]. Circ Res, 2013, 112(9): 1234-1243.

[13]Feng Y, Huang W, Wani M, et al. Ischemic preconditioning potentiates the protective effect of stem cells through secretion of exosomes by targeting Mecp2 via miR-22[J]. PLoS One, 2014, 9(2):e88685.

[14]辛毅，李娜，張穎，等. 綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠不同源性間充質(zhì)干細(xì)胞原代培養(yǎng)及生物學(xué)特性比較[J]. 中國病理生理雜志, 2014, 30(6) : 1141-1147.

[15]李娜，辛毅，林箏，等. 多次移植人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞對大鼠Th1和Th2比值影響[J]. 心肺血管病雜志, 2013, 32(6):789-793.

(責(zé)任編輯： 陳妙玲， 羅森)

Exosomes secreted by human umbilical mesenchymal stem cells protect cardiomyocytes from anoxia-reoxygenation injury

LI Jia2, XIN Yi1,3, CUI Wei1,3, LIU Sa1,3, HUANG Ran-ran1,3, CHEN Juan2, ZHOU Jie2, LI Na1,3

(1CapitalMedicalUniversityAffiliatedBeijingAnzhenHospital,Beijing100029,China;2DepartmentofBiochemistryandMolecularBiology,TongjiMedicalCollege,HuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430030,China;3BeijingInstituteofHeart,Lung&BloodVesselDiseases,Beijing100029,China.E-mail:lina82002@126.com)

AIM: To investigate the anti-apoptosis effects of exosomes secreted by human umbilical mesenchymal stem cells (HUMSCs) in anoxia-reoxygenation injury and to analyze the protective microRNA expression levels in the exosomes. METHODS: HUMSCs were isolated and cultured until the 3rd generation, and the immunophenotype were identified by flow cytometry. The culture supernatant was collected, and the exosomes were purified using a Total Exosome Isolation kit. The morphology of the exosome was observed under electron microscope. The protein expression level of exosome-specific marker CD63 in the extract was determined by Western blot. The cardiomyocytes were treated with the exosomes under the anoxia and reoxygenation conditions and the apoptosis was studied by flow cytometry with Annexin V-FITC/PI staining. The expression levels of the cardioprotective microRNAs in the exosomes were detected. The apoptosis of the cardiomyocytes treated with miR-22 inhibitor was analyzed. RESULTS: The 3rd generation of HUMSCs highly expressed CD105, CD73 and CD90, but negatively expressed CD45, CD34, CD11b, CD79a, CD19 and HLA-DR, indicating that the culture of the 3rd generation of HUMSCs had the specific phenotype characteristics of MSCs. The differentiation percentage of the HUMSCs towards osteocytes was more than (92.5±5.1)%. In the adipocyte differentiation assay, the lipid droplets in the cells were observed and the differentiation rate was more than (91.6±3.8)%, indicating that the HUMSCs had multipotent differentiation capacity. Scanning electron microscopy showed globular structure of the exosomes which also strongly expressed the exosome-specific protein CD63. Anoxia and reoxygenation induced higher apoptosis of cardiomyocytes (P<0.05). The exosome treatment significantly decreased the apoptosis of cardiomyocytes (P<0.05). The anti-apoptotic effects of the exosomes at different concentrations, were almost the same (P>0.05). The high levels of miR-1a, miR-22, miR24, miR-133a and miR-139-5p were detected in the exosomes, among which the expression level of miR-22 was the highest, (270.4±9.7) times as high as the internal reference U6. Under the anoxia and reoxygenation conditions, the apoptosis of cardiomyocytes was significantly increased after miR-22 inhibitor treatment (P<0.05). CONCLUSION: Exosomes secreted by HUMSCs effectively reduce the apoptosis of cardiomyocytes from anoxia-reoxygenation injury. It might be related to high expression level of miR-22 in the secreted exosomes.

Human umbilical mesenchymal stem cells; Exosomes; MicroRNAs; Cardiomyocytes; Anoxia; Reoxygenation

1000- 4718(2016)04- 0577- 07

2015- 10- 27

2015- 12- 18

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 81370228);省部共建重點(diǎn)教育部心血管重塑相關(guān)疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目(No. 110267);北京市衛(wèi)生系統(tǒng)高層次衛(wèi)生技術(shù)人才培養(yǎng)計(jì)劃(No. 2014-3-045)

Tel： 010-64456059； E-mail： lina82002@126.com

R363.2

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.04.001

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