吳小燕，王仁才，劉 瓊，石 浩

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院，湖南 長沙 410128）

大孔吸附樹脂純化小米棗黃酮的初步研究

吳小燕，王仁才，劉 瓊，石 浩

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院，湖南 長沙 410128）

為探討利用大孔吸附樹脂分離純化小米棗黃酮的最佳工藝條件，以湖南衡南縣產(chǎn)的小米棗為試材，進行了不同大孔吸附樹脂的靜態(tài)吸附與解吸及動態(tài)吸附與解吸試驗，同時考察了X-5大孔吸附樹脂的動態(tài)吸附與解吸條件。結(jié)果表明：在供試的5種大孔吸附樹脂中，以X-5大孔吸附樹脂的吸附及解吸性能最佳，其對黃酮的動態(tài)吸附率為79.50%，動態(tài)解吸率為99.53%；其分離純化小米棗黃酮的最佳工藝參數(shù)為：上樣液濃度0.263 mg/m L，上樣液pH值5.0，洗脫劑為70%乙醇，洗脫劑pH值6.0，經(jīng)該工藝條件純化后，黃酮的純度達68.12%。

小米棗；黃酮；大孔吸附樹脂；吸附；解吸；純化

棗，又名紅棗、大棗，為鼠李科屬植物［1］。棗作為我國傳統(tǒng)的藥食兩用果品，具有養(yǎng)血、補氣、益脾胃、養(yǎng)顏美容、益智延年、生津止渴等功效，深受研究者的關(guān)注［2-3］。我國棗的種植面積占全世界90%以上［4-6］。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，棗果中的主要功能成分有多糖、蘆丁、環(huán)磷酸腺苷、黃酮類化合物等［7-10］。其中，黃酮類化合物具有抗腫瘤、抗氧化、美容美白等一系列的藥理作用。湖南棗樹品種資源豐富，而衡陽市的地方品種小米棗由于其功能成分黃酮含量高而備受關(guān)注。為促進小米棗黃酮的提取與分離純化以及工業(yè)化生產(chǎn)應(yīng)用，研究了大孔吸附樹脂分離純化小米棗黃酮的工藝與技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 原料與試劑 供試小米棗采自湖南省衡南縣；大孔吸附樹脂型號有D201、XDA-1、X-5、AB-8、NKA-II共5種（南開大學(xué)化工廠）；無水乙醇，亞硝酸鈉，氫氧化鈉，硝酸鋁，鹽酸，均為國藥試劑（分析純）。

1.2 試驗方法

1.2.1 大孔吸附樹脂的預(yù)處理 參照胡迎芬等［11］的方法，對D201、XDA-1、X-5、AB-8、NKA-II 5種型號的大孔吸附樹脂進行預(yù)處理，然后用95%乙醇浸泡備用。

1.2.2 小米棗黃酮供試液的制備 稱取小米棗粉末60.00 g，置于錐形瓶中，以60%乙醇為提取溶劑，料液比1∶16，在超聲功率700 W、提取溫度60℃條件下提取20 m in；重復(fù)提取1次；將2次濾液合并后濃縮，取經(jīng)過稀釋并離心后的溶液上柱。

1.2.3 小米棗黃酮標準曲線的制作 在付曉等［12］方法的基礎(chǔ)上有所改進，精密稱取經(jīng)105℃干燥至恒重的蘆丁標準品10 mg，用甲醇溶解制得0.2 mg/mL蘆丁標準溶液；分別精密量取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL對照品溶液于6只10 m L試管中，依次加入反應(yīng)溶液進行反應(yīng)后測定吸光度；以濃度C對吸光度A作線性圖，得到回歸方程。

1.2.4 大孔吸附樹脂的靜態(tài)吸附與解吸試驗 （1）靜態(tài)吸附試驗。將預(yù)處理過的大孔吸附樹脂用蒸餾水洗至無醇味后抽濾，精確稱取NKA-II、AB-8、D201、X-5、XDA-1型大孔吸附樹脂各2.00 g置于錐形瓶中，各加入黃酮濃度為0.175 mg/m L的提取液40 m L，置于恒溫搖床中，在25℃、120 r/m in下進行靜態(tài)吸附，分別在1、2、4、6、8、10 h之后從上清液中取樣測定，通過檢測黃酮吸光度的變化，按公式（1）計算各樹脂對小米棗黃酮的吸附率。（2）靜態(tài)解吸試驗。分別對上述充分吸附了小米棗黃酮的5種大孔吸附樹脂進行抽濾，并用蒸餾水洗滌，將抽濾后的5種樹脂分別置于錐形瓶中，各加入70%乙醇溶液40 m L，放入恒溫搖床中，與吸附時保持同樣條件進行解吸，定時從上清液中取樣，檢測黃酮含量變化，按公式（2）計算各樹脂對棗黃酮的解吸率。

吸附率（%）=

解吸率（%）=CV/W×100 （2）

制酸一系列煙氣進入2#轉(zhuǎn)化器煙道入口有兩個彎頭，氣體流經(jīng)彎頭，由于氣流慣性，管道外側(cè)氣流量大，內(nèi)測氣流量小，導(dǎo)致氣體偏流。氣量大的地方溫度低，氣量小的地方溫度高從而導(dǎo)致同一層轉(zhuǎn)化器內(nèi)部不同位置存在較大的溫差，產(chǎn)生熱應(yīng)力，使轉(zhuǎn)化器發(fā)生形變。焊縫處形變拉力偏大，導(dǎo)致焊縫拉裂漏煙氣，增加檢修費用的同時也影響了工作環(huán)境［4］。

式（2）中：V為洗脫液總體積（m L），C為洗脫液中黃酮濃度（mg/m L），W為吸附黃酮總量（mg）。

1.2.5 大孔吸附樹脂的動態(tài)吸附和解吸試驗 （1）動態(tài)吸附試驗。抽濾經(jīng)預(yù)處理過的樹脂，并用蒸餾水洗至無醇味后再抽濾，稱取靜態(tài)試驗結(jié)果初步篩選出的NKA-Ⅱ、AB-8和X-5型3種大孔吸附樹脂各5.00 g，用蒸餾水濕法裝柱，徑高比為1∶10，將黃酮樣液以2 BV/h的流速進行動態(tài)吸附（其中1 BV代表一個樹脂柱的體積），每30 m in（1 BV）收集一次樣品，測定收集樣品中黃酮的吸光度，吸附飽和后，用3 BV蒸餾水洗柱，計算水洗液體積，并測定水洗液中黃酮的吸光度，按公式（3）計算動態(tài)吸附量，并繪制各樹脂的泄露曲線。（2）動態(tài)解吸試驗。用70%的乙醇溶液以2 BV/h的流速進行動態(tài)解吸，每30 min（1 BV）收集一次樣品，測定洗脫液中黃酮吸光度，并計算其濃度，按公式（4）計算動態(tài)解吸率。

式中：C上為上樣液黃酮濃度，V上為上樣液體積；C殘為過柱流出液中黃酮平均濃度，V殘為過柱流出液總體積；C水洗為蒸餾水洗脫下來的黃酮平均濃度，V水洗為洗脫的蒸餾水體積；C醇為乙醇洗脫下來的黃酮平均濃度，V醇為乙醇體積；M為濕樹脂的質(zhì)量。

1.2.6 X-5大孔吸附樹脂純化小米棗黃酮條件的研究

（1）上樣液濃度的確定。將pH值6.0的黃酮供試液（0.526 mg/m L）分別稀釋2、3、4倍，測定濃度分別為0.263、0.175、0.132 mg/mL，以1 mL/min的流速上樣后用適量蒸餾水洗柱，合并洗滌液和流出液測定其中黃酮含量，考察上樣液濃度對吸附效果的影響。（2）上樣液pH值的確定。準確量取濃度為0.526 mg/ mL的黃酮溶液各100 mL，用適量酸或堿調(diào)節(jié)其pH值分別為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，以l mL/m in流速上柱吸附，靜置一定時間后用蒸餾水洗柱，合并后測黃酮含量，考察上樣液pH值對吸附效果的影響。（3）洗脫液乙醇濃度的確定。準確量取pH值為6.0、濃度為0.526 mg/m L的黃酮溶液100 mL以l m L/min流速上柱吸附，靜置一定時間后用適量蒸餾水洗柱，再分別用100 mL的50%、60%、70%、80%、90%的乙醇溶液進行洗脫，收集洗脫液并測定黃酮含量，考察洗脫液濃度對黃酮解吸效果的影響。（4）洗脫液pH值的確定。 準確量取100 m L、pH值為6.0、濃度為0.526 mg/m L的黃酮溶液進行上柱吸附，靜置一定時間后用適量蒸餾水洗柱，在洗脫液體積均為100 mL條件下，用酸或堿將洗脫液調(diào)成pH值分別為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0，控制解吸流速為1 mL/min，收集洗脫液并測定黃酮含量，考察洗脫液pH值對黃酮解吸效果的影響。

1.2.7 X-5大孔吸附樹脂吸附分離小米棗黃酮的純度試驗 將按最佳純化工藝得到的小米棗黃酮洗脫液進行濃縮并干燥至恒重，得到小米棗黃酮粉末，精密稱取100 mg溶解并定容至100 m L，按公式（5）計算小米棗黃酮純化后的純度。純度（%） = CV/W×100 （5）式（5）中：C為溶液中黃酮濃度（mg/mL）；V為定容體積（mL）；W為樣品質(zhì)量（mg）。

2 結(jié)果與分析

2.1 小米棗黃酮的標準曲線

采用亞硝酸鈉—硝酸鋁比色法，得到蘆丁的標準回歸方程為：y=11.475x+ 0.007 3（R2= 0.999 3），由此回歸方程可計算出溶液中黃酮濃度。

2.2 靜態(tài)吸附與解吸試驗

2.2.1 靜態(tài)吸附實驗 由圖1可知，在前4 h內(nèi)，5種樹脂的吸附速率隨時間的延長而快速增加，隨后增加的速度變緩慢，直到8 h后逐漸趨向吸附飽和。各樹脂對小米棗黃酮的吸附量存在差異，以D201吸附效果最差，其飽和吸附量僅為5.12 mg/g，而樹脂AB-8、X-5、XDA-1、NKA-Ⅱ吸附量較高，但差別不大，均在5.58～5.93 mg/g范圍內(nèi)。

圖1 5種類型大孔樹脂對小米棗黃酮的靜態(tài)吸附性能曲線

2.2.2 靜態(tài)解吸試驗 由圖2可知，5種樹脂在70%乙醇溶液中對黃酮的解吸能力存在較大差異，以X-5、NKA-Ⅱ解吸效果較好，其解吸率分別高達90.30%、87.77%；D201的解吸效果最差，其解吸率只有64.45%。

圖2 5種類型大孔樹脂對小米棗黃酮的靜態(tài)解吸性能曲線

2.3 動態(tài)吸附與解吸試驗

2.3.1 動態(tài)吸附試驗 由圖3可知，X-5、NKA-Ⅱ、XDA-1 3種樹脂在13BV附近時均達到飽和。但X-5、NKA-Ⅱ、XDA-1樹脂分別在上樣量為9 BV、8 BV、6 BV時泄露較為明顯，因此確定X-5型大孔吸附樹脂對小米棗黃酮的動態(tài)吸附效果最好。

2.3.2 動態(tài)解吸試驗 由表1可知，3種樹脂對黃酮的吸附率與解吸率均存在明顯差異，其中X-5樹脂對小米棗黃酮的動態(tài)吸附率與解吸率分別高達79.50%、 99.53%，所以最終確定X-5為分離純化小米棗黃酮的最佳樹脂。

圖3 3種樹脂對小米棗黃酮的動態(tài)吸附效果

表1 三種樹脂對小米棗黃酮的動態(tài)吸附率、解吸率（x±s， n=3）

2.4 X-5大孔吸附樹脂對小米棗黃酮的吸附與解吸試驗

2.4.1 上樣液濃度的確定 由圖4可知，隨著上樣液濃度的增加，X-5樹脂對黃酮的吸附率逐漸升高，但上樣液濃度分別為0.526、0.263 mg/m L時，吸附率變化不明顯，考慮到隨上樣液濃度的增加，洗脫時間延長，所以確定上樣液適宜濃度為0.263 mg/mL。

圖4 上樣液濃度對黃酮吸附效果的影響

2.4.2 上樣液pH值的確定 由圖5可知，隨著上樣液pH值的變化，X-5樹脂對黃酮的吸附率有一定的變化，當pH值=5.0時，吸附率達到最高為90.90%，因此確定上樣液的最適pH值為5.0。

2.4.3 洗脫液濃度的確定 由圖6可知，隨著洗脫劑乙醇濃度的增加，X-5樹脂對黃酮的解吸率呈現(xiàn)先增加后減少的規(guī)律，當乙醇濃度為70%解吸率最高，由此確定洗脫劑乙醇的最佳濃度為70%。

2.4.4 洗脫液pH值的確定 由圖7可知，隨著洗脫劑pH值增加，X-5樹脂對黃酮的解吸率呈現(xiàn)先增加后減少的規(guī)律，當洗脫劑pH值為6.0是，解吸率最高，由此確定洗脫劑乙醇的最佳pH值為6.0。

圖5 上樣液pH值對黃酮吸附效果的影響

圖6 洗脫劑乙醇濃度對黃酮解吸效果影響

圖7 洗脫劑pH值對黃酮解吸效果影響

3 討論與小結(jié)

黃酮分離純化常見的方法有大孔吸附樹脂法、梯度pH值萃取法、鉛鹽沉淀法、HPLC法、超臨界流體色譜法［13-16］等。由于大孔吸附樹脂純化具有選擇性好、吸附容量大、易解吸、且較易再生等優(yōu)點，近年來該方法逐漸在和田玉棗、沙棗等［4-5］果實黃酮提取純化中研究應(yīng)用，而對衡南小米棗黃酮純化工藝的研究尚未見報道，筆者首次以湖南衡南小米棗為試材，采用大孔吸附樹脂法探討其黃酮純化工藝。

通過對5種大孔吸附樹脂靜態(tài)吸附與解吸試驗的考察，得到其對黃酮的靜態(tài)吸附能力大小依次為XDA-1＞X-5＞AB-8＞NKA-II＞D201；5種樹脂對黃酮的靜態(tài)解吸能力大小依次為X-5＞NKA-II＞AB-8＞XDA-1＞D201。在此基礎(chǔ)上初步篩選出X-5、NKA-II及XDA-1這3種樹脂進行進一步動態(tài)吸附與解吸試驗。結(jié)果表明，X-5樹脂對小米棗黃酮的動態(tài)吸附與解吸率分別為79.50%與99.53%，由于X-5樹脂對小米棗黃酮吸附量大，解吸也容易，所以篩選出X-5型樹脂進行純化的條件優(yōu)化試驗。

采用X-5大孔吸附樹脂對小米棗黃酮進行動態(tài)吸附及解吸試驗，進一步考察上樣液質(zhì)量濃度、上樣液pH值、洗脫劑乙醇濃度及洗脫劑pH值等條件，最終得到X-5型大孔吸附樹脂對小米棗黃酮的最優(yōu)純化條件為：上樣液黃酮濃度為0.263 mg/mL、pH值為5.0、流速為2 BV/h；洗脫劑乙醇濃度為70%，洗脫液pH值為6.0。小米棗黃酮經(jīng)X-5大孔吸附樹脂純化后，其純度為68.12%，表明該方法可行性較高，但還需在這個基礎(chǔ)上進一步研究溫度及洗脫次數(shù)對黃酮純化效果的影響，以進一步提高小米棗黃酮的純度。

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（責任編輯：成 平）

The Prelim inary Research on Purification of Flavonoids from M illet Jujube by M acroporous Adsorp tion Resin

WU Xiao-yan，WANG Ren-cai，LIU Qiong，SHI Hao
（College of Horticulture and Landscape， Hunan Agricultural University， Changsha 410128， PRC）

To discuss the optimum technological conditions for the separation and purification of flavonoids from m illet jujube by macroporous adsorption resin， w e took the m illet jujube from Hengnan County of Hunan as test material， carried out the static adsorption and desorption and their dynam ic adsorption and desorption of different macroporous adsorption resins， at the same time， we investigated the dynam ic adsorption and desorption conditions of X-5 macroporous adsorption resin.The results showed that the adsorption and desorption performance of X-5 macroporous adsorption resin was the best in the 5 kinds of macroporous adsorption resin，the dynamic adsorption rate of favonoids was 79.50% and the dynam ic desorption rate was 99.53%；the optimal process parameters for the separation and purif cation of f avonoids from millet jujube are as follow： the favonoids concentration in the liquid is 0.263mg/mL， the pH value is 5.0，the eluting reagent is 70% ethanol， and the pH value is 6.0， by the purif cation process， the purity of favonoids was 68.12%.

m illet jujube； f avonoids； macroporous adsorption resin； adsorption； desorption； purif cation

TS264.4

A

1006-060X（2016）09-0073-04

10.16498/j.cnki.hnnykx.2016.09.021

2016-07-23

湖南省自然科學(xué)基金委員會與衡陽市政府自然科學(xué)聯(lián)合基金項目（13JJ8010）

吳小燕（1990-），女，湖南東安縣人，碩士研究生，研究方向為功能產(chǎn)品的開發(fā)與評價。

王仁才