迪力夏提·金斯汗　吐魯洪·沙列爾　趙　倩

(新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院乳腺外科,新疆　烏魯木齊　830011)

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EZH2抑制劑DZNeP對人乳腺癌細(xì)胞增殖、凋亡及相關(guān)信號通路的影響

迪力夏提·金斯汗吐魯洪·沙列爾趙倩

(新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院乳腺外科,新疆烏魯木齊830011)

目的探討EZH2抑制劑DZNeP對人乳腺癌細(xì)胞增殖、凋亡及相關(guān)信號通路的影響。方法取對數(shù)生長期乳腺癌細(xì)胞MCF-7、MDA-MB-231，經(jīng)2.5、5、10、20 μmol/L DZNeP處理后(設(shè)不加DZNeP僅添加完全培養(yǎng)基組為對照組)，采用四甲基偶氮唑鹽比色法檢測各組24、48、72 h的增殖抑制率，Annexin V-FITC/PI流式細(xì)胞術(shù)檢測各組24、48 h的凋亡率，收集20 μmol/L DZNeP處理72 h的MCF-7、MDA-MB-231細(xì)胞，采用Western印跡檢測磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)通路和Wnt/β-連接素(β-catenin)通路中的蛋白變化。結(jié)果DZNeP在2.5～20 μmol/L范圍內(nèi)可抑制MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞增殖，且與對照組相比增殖抑制率升高(P<0.05)，該抑制效應(yīng)呈濃度和時(shí)間依賴性；與對照組相比，DZNeP處理組的凋亡率均升高(P<0.05)，DZNeP各濃度處理48 h的凋亡率均高于24 h(P<0.05)；PI3K/Akt通路中，與對照組相比，20 μmol/L DZNeP處理72 h后MCF-7、MDA-MB-231細(xì)胞的PTEN水平均升高，Akt水平均降低(P<0.05)；而在Wnt/β-catenin通路上，20 μmol/L DZNeP處理72 h后兩細(xì)胞株中的β-catenin、Cyclin D1和C-myc水平均降低(P<0.05)。結(jié)論DZNeP可抑制人乳腺癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡，可能與抑制腫瘤惡性行為相關(guān)的PI3K/Akt、Wnt/β-catenin通路有關(guān)，在乳腺癌治療上有一定應(yīng)用前景。

EZH2抑制劑；乳腺癌；增殖；凋亡；信號通路

乳腺癌已成為影響女性生命健康的惡性腫瘤之一，目前發(fā)病率逐年上升，嚴(yán)重影響女性身心健康〔1〕。目前研究認(rèn)為，表觀遺傳調(diào)控紊亂是包括乳腺癌在內(nèi)惡性腫瘤的重要特征，組蛋白是重要的表觀遺傳調(diào)控位點(diǎn)〔2〕。組蛋白上的多個氨基酸可被共價(jià)鍵修飾，如甲基化、乙?；头核鼗?，其中乙酰化與甲基化相互關(guān)聯(lián)〔3〕。EZH2為一種調(diào)節(jié)組蛋白修飾的酶，具有甲基轉(zhuǎn)移酶和組蛋白去乙?；傅恼{(diào)控作用，可通過參與靶基因的轉(zhuǎn)錄抑制來促進(jìn)細(xì)胞增殖，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用〔4,5〕。在乳腺癌中針對EZH2靶向治療的研究尚屬空白，本研究選取EZH2抑制劑DZNeP處理乳腺癌MCF-7、MDA-MB-231細(xì)胞，觀察其對細(xì)胞增殖、凋亡及相關(guān)信號通路的影響。

1　材料與方法

1.1細(xì)胞株與試劑乳腺癌細(xì)胞株MCF-7、MDA-MB-231購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)院細(xì)胞庫，DZNeP購自美國Selleck公司，Annexin-FITC/PI凋亡檢測試劑盒購自北京寶賽生物技術(shù)有限公司，噻唑藍(lán)(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)及雙抗(青霉素、鏈霉素)購自美國 Amresco公司，胎牛血清(FCS)、胰蛋白酶及RPMI 1640培養(yǎng)基均購自美國Gibco公司，兔抗人β-catenin多克隆抗體購自武漢博士德生物工程有限公司，鼠抗人Akt、C-myc多克隆抗體均購自Transduction Laboratories公司，兔抗人PTEN、Cyclin D1及內(nèi)參GAPDH多克隆抗體均購自美國Santa Cruz公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)將MCF-7、MDA-MB-231復(fù)蘇后，采用含10% FCS、100 U/ml青霉素及100 μg/ml鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基于溫度為37℃，CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，48 h后首次換液，其后每2～3 d換液1次，待細(xì)胞達(dá)80%～90%融合經(jīng)胰酶消化后，傳代培養(yǎng)。

1.3細(xì)胞增殖檢測取對數(shù)生長期MCF-7、MDA-MB-231細(xì)胞，采用胰蛋白酶消化制備單細(xì)胞懸液，調(diào)節(jié)濃度至1×105/ml，接種于96孔培養(yǎng)板，向每孔加入20 μl DZNeP溶液，使終濃度依次為2.5、5、10、20 μmol/L(以不加藥物的作對照)，每個濃度設(shè)3個平行孔，常規(guī)培養(yǎng)24、48、72 h后，向每孔加入10 μl MTT工作液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，加入DMSO溶液終止培養(yǎng)，采用酶標(biāo)儀檢測492 nm下的吸光值(A)，根據(jù)公式計(jì)算DZNeP處理組相對于對照組的增殖抑制率：抑制率(%)=(A對照組-ADZNeP處理組)/A對照組×100%。

1.4細(xì)胞凋亡率檢測收集不同濃度DZNeP處理24、48 h的MCF-7、MDA-MB-231細(xì)胞1×106個，經(jīng)PBS緩沖液沖洗后，加入200 μl凋亡結(jié)合液后輕輕吹散細(xì)胞，加入5 μl Annexin-FITC和10 μl PI，避光反應(yīng)15 min后，采用FACS Calibur 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。

1.5Western印跡收集20 μmol/L DZNeP處理72 h后的MCF-7、MDA-MB-231細(xì)胞，冰上裂解后室溫放置10 min，12 000 r/m離心10 min，采用BCA法檢測上清液的蛋白含量，每孔取20 μg蛋白樣品至10% SDS-PAGE凝膠，電泳完畢后采用半干轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至22 μm孔徑硝酸纖維素膜，加適量的Akt、PTEN、β-catenin、C-myc和Cyclin D1一抗(除β-catenin的稀釋度為1∶200外，其余均為1∶300)，4℃孵育過夜后加入二抗，SuperECL Plus超敏發(fā)光液進(jìn)行化學(xué)發(fā)光顯色，將顯影后的X線片用Gel-Pro Analyzer 3.1分析光密度，蛋白的相對表達(dá)量為與內(nèi)參GAPDH的比值。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS18.0軟件，多組比較采用單因素方差分析(one way ANOVA)，兩兩比較采用SNK法。

2　結(jié)　果

2.1DZNeP對MCF-7細(xì)胞增殖的影響DZNeP在2.5～20 μmol/L范圍內(nèi)可抑制MCF-7細(xì)胞增殖，且與對照組相比，DZNeP處理組的增殖抑制率均升高(P<0.05)；高濃度DZNeP(20 μmol/L)處理72 h后的增殖抑制率達(dá)70%以上。見表1。

2.2DZNeP對MDA-MB-231細(xì)胞增殖的影響DZNeP在2.5～20 μmol/L范圍內(nèi)可抑制MDA-MB-231細(xì)胞增殖，且與對照組相比，DZNeP處理組的增殖抑制率均升高(P<0.05)；高濃度DZNeP(20 μmol/L)處理72 h后的細(xì)胞基本死亡。見表2。

2.3DZNeP對MCF-7細(xì)胞、MDA-MB-231細(xì)胞凋亡的影響DZNeP在2.5～20 μmol/L范圍內(nèi)可誘導(dǎo)MCF-7、MDA-MB-231細(xì)胞凋亡，且與對照組相比，DZNeP處理組的凋亡率均升高(P<0.05)；DZNeP各濃度處理48 h的凋亡率均高于24 h(P<0.05)。見表3，表4。

表1　不同濃度DZNeP作用于MCF-7細(xì)胞的增殖抑制率±s,%)

與0 μmol/L組比較:1)P<0.05；與2.5 μmol/L組比較:2)P<0.05；與5 μmol/L組比較:3)P<0.05；與10 μmol/L組比較:4)P<0.05；表2～表4同

表2　不同濃度DZNeP作用于MDA-MB-231細(xì)胞的增殖抑制率±s,%)

表3　DZNeP對MCF-7細(xì)胞凋亡的影響

表4　DZNeP對MDA-MB-231細(xì)胞凋亡的影響(%)

2.4DZNeP對乳腺癌細(xì)胞相關(guān)信號通路的影響

2.4.1PI3K/Akt通路與對照組相比，20 μmol/L DZNeP處理72 h后MCF-7細(xì)胞和MDA-MB-231細(xì)胞的PTEN水平均升高，Akt水平均降低(P<0.05)。見圖1、表5。

2.4.2Wnt/β-catenin通路與對照組相比，20 μmol/L DZNeP處理72 h后MCF-7細(xì)胞和MDA-MB-231細(xì)胞的β-catenin、Cyclin D1和C-myc水平均降低(P<0.05)。見圖1、表5。

表5　DZNeP對乳腺癌細(xì)胞相關(guān)通路的影響±s)

與對照組比較：1)P<0.05

圖1　DZNeP對乳腺癌細(xì)胞相關(guān)信號通路蛋白表達(dá)的影響

3　討　論

研究發(fā)現(xiàn)，EZH2在多種腫瘤組織中異常高表達(dá)〔6,7〕，其可通過轉(zhuǎn)錄后修飾來沉默抑癌基因的表達(dá)，其中包括促凋亡基因及抑制癌細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的基因，繼而促進(jìn)腫瘤組織的生長和浸潤〔8〕。EZH2在消化道腫瘤中表達(dá)的研究較為廣泛，如鄧飛等〔6〕的研究指出EZH2高表達(dá)與結(jié)腸癌患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及Duke分期有關(guān)，高德全等〔7〕發(fā)現(xiàn)EZH2與胃癌的浸潤深度、TNM分期、分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均有關(guān)。此外，EZH2還參與了癌細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和干細(xì)胞干性調(diào)節(jié)〔9〕。然而，EZH2與乳腺癌細(xì)胞增殖、凋亡的關(guān)系目前尚不明確。

DZNeP為S-腺苷同型半胱氨酸水解酶抑制劑，在多種惡性腫瘤細(xì)胞均發(fā)現(xiàn)，其可通過抑制EZH2表達(dá)來發(fā)揮抗腫瘤作用，有望成為靶向治療的候選藥物〔8〕。異常增殖是惡性腫瘤的基本特征，DZNeP已被證實(shí)可抑制食管鱗狀細(xì)胞癌 Eca109細(xì)胞、頭頸部鱗癌Tb3.1細(xì)胞及結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞的增殖〔9～11〕。本研究采用MTT法檢測發(fā)現(xiàn)，DZNeP處理后兩種乳腺癌細(xì)胞的增殖能力均受抑制，且增殖抑制率受作用時(shí)間和濃度的影響，表明DZNeP可抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖過程。此外，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是DZNeP抑制腫瘤惡性轉(zhuǎn)化的基本方式之一，本研究也證實(shí)DZNeP可誘導(dǎo)兩種乳腺癌細(xì)胞的凋亡，與相關(guān)的報(bào)道一致〔9～11〕。以上指出DZNeP在乳腺癌的治療上有較好的前景，但仍需臨床前期研究的結(jié)果支持。

EZH2表達(dá)可影響抑癌基因的表達(dá)，導(dǎo)致與癌細(xì)胞惡性高度相關(guān)的信號通路激活，如PI3K/Akt通路和Wnt/β-catenin通路〔12,13〕。本研究結(jié)果顯示，DZEeP對PI3K/Akt通路起負(fù)性調(diào)節(jié)作用的抑癌基因PTEN水平升高，而處于PI3K/Akt通路中心環(huán)節(jié)的Akt水平降低，提示DZNeP可抑制乳腺癌細(xì)胞中PI3K/Akt通路的活化。同時(shí)，Wnt/β- catenin通路的關(guān)鍵分子β-catenin、C-myc和Cyclin D1水平均降低，提示DZNeP對Wnt/β-catenin通路活化也有較好抑制效果。鑒于DZNeP處理后抑癌基因PTEN的水平升高，而癌基因C-myc水平降低，進(jìn)一步提示EZH2可通過抑制抑癌基因的表達(dá)來促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖，EZH2有望成為癌癥靶向治療的新靶點(diǎn)。

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3Liu TP,Hong YH,Tung KY,etal.In silico and experimental analyses predict the therapeutic value of an EZH2 inhibitor GSK343 against hepatocellular carcinoma through the induction of metallothionein genes〔J〕.Oncoscience,2016;3(1):9-20.

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〔2015-11-17修回〕

(編輯徐杰)

吐魯洪·沙列爾(1963-)，男，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，主要從事乳腺疾病研究。

迪力夏提·金斯汗(1982-)，男，主治醫(yī)師，碩士，主要從事乳腺疾病研究。

R739

A

1005-9202(2016)16-3877-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.16.004