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        大黃 蟲丸加味對免疫性肝纖維化大鼠肝組織PDGF及PDGFR的影響

        2016-10-24 07:38:50王金光車念聰李文新杜宇瓊司遠劉曄趙暉
        環(huán)球中醫(yī)藥 2016年10期
        關鍵詞:羥脯氨酸秋水仙堿免疫性

        王金光 車念聰 李文新 杜宇瓊 司遠 劉曄 趙暉

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        大黃蟲丸加味對免疫性肝纖維化大鼠肝組織PDGF及PDGFR的影響

        王金光車念聰李文新杜宇瓊司遠劉曄趙暉

        目的觀察大黃蟲丸配伍黃芪、水紅花子湯劑對免疫性肝纖維化大鼠肝組織血小板源性生長因子(platelet derived growth factor,PDGF)及血小板源性生長因子受體(platelet derived growth factor receptor,PDGFR)的影響。 方法將SD大鼠隨機分為正常組、模型組、中藥組和秋水仙堿組。除了正常組外的3組均建立豬血清腹腔注射誘導的免疫性肝纖維化模型。灌胃治療6周后,取大鼠肝臟進行病理HE染色及通過堿水解法檢測羥脯氨酸含量,并通過蛋白免疫印跡法檢測肝組織PDGF-BB蛋白及PDGFR蛋白的表達。 結果與正常組相比,模型組羥脯氨酸含量、PDGF-BB蛋白及PDGFR蛋白的表達均明顯增加(P<0.01);與模型組相比,中藥組及秋水仙堿組羥脯氨酸含量減少(P<0.05),PDGF-BB蛋白及PDGFR蛋白的表達明顯減少(P<0.01);中藥組與秋水仙堿組羥脯氨酸含量、PDGF-BB蛋白及PDGFR蛋白的表達均未見明顯差異(P>0.05)。 結論大黃蟲丸配伍黃芪、水紅花子能有效拮抗豬血清誘導的大鼠免疫性肝纖維化,其機制可能與抑制PDGF-BB及受體PDGFR蛋白的表達,進而抑制肝星狀細胞的增殖活化有關。

        大黃蟲丸;免疫性肝纖維化;血小板源性生長因子; 血小板源性生長因子受體

        肝纖維化是指由于肝炎病毒、酒精、藥物或其他因素導致肝臟的損害,肝臟內細胞外基質(extracellular matrix,ECM)的合成大于降解,并在肝臟內過度沉積的病理生理過程,是各種慢性肝病病情進展的重要病理階段,也是形成肝硬化、肝癌的必經(jīng)過程[1]。肝臟發(fā)生損傷時,肝星狀細胞(hepatic stellate cell,HSC)是合成ECM的主要細胞。HSC的激活和增殖對肝纖維化的發(fā)生發(fā)展起著至關重要的作用,而血小板源性生長因子(platelet derived growth factor,PDGF)是刺激HSC增殖和相關信號傳導最為有效的有絲分裂因子,分為AA、BB、AB、CC、DD 5種亞型,其中PDGF-BB在促使HSC增殖活化從而促進膠原合成、抑制膠原降解中發(fā)揮最為重要的作用。有研究表明[2],PDGF-BB及其受體在慢性肝炎或肝硬化患者肝組織表達過度,并與膠原纖維沉積成正相關。本研究擬通過建立豬血清誘導的大鼠免疫性肝纖維化模型,觀察經(jīng)大黃蟲丸加味湯劑干預后,肝組織PDGF-BB蛋白及PDGFR蛋白的變化,探討大黃蟲丸加味湯劑拮抗免疫性肝纖維化的作用機制。

        1 材料與方法

        1.1實驗動物

        選用雄性SD大鼠,體質量180~200 g,鼠齡8周,購自北京維通利華實驗動物技術有限公司,合格證號:SCXK (京) 2013-0004,共28只,飼養(yǎng)在首都醫(yī)科大學實驗動物科學部 SPF級動物室。

        1.2試劑和儀器

        大黃蟲丸配伍黃芪、水紅花子湯劑:大黃蟲丸購自北京同仁堂藥店(批號:15013317),從北京同仁堂選購標準中藥材黃芪、水紅花子。根據(jù)等效藥量關系,按照每100 g大鼠每天灌胃1 mL的量,經(jīng)過計算得出每1 mL中藥湯劑中含有大黃蟲丸0.14 g、黃芪水紅花子(黃芪∶水紅花子=3∶1)生藥量為0.47 g,依此要求煎成湯劑備用。

        豬血清(北京百代商貿技術有限公司,批號:150418);生理鹽水(北京市普京康利科技有限公司,批號:150526);秋水仙堿(北京市普京康利科技有限公司,批號:151008),使用時以蒸餾水調制藥液成0.025 g/L;羥脯氨酸測試盒(A030-2,南京建成生物科技有限公司,批號:20160112);蛋白定量試劑盒(北京康為世紀生物科技有限公司),一抗: Anti-Collagen I antibody ab23914(美國Abcam)、一抗:Anti-Collagen I antibody ab19481(美國Abcam);蛋白質印跡法二抗:goat anti rabbit IgG(H+L),HRP(美國Jackson 111-035-003)、二抗: goat anti mous IgG(H+L)、HRP(美國 Jackson 115-035-003)。

        酶標儀(Thermo,美國)垂直電泳槽(Bio-Rad,美國);小型電泳儀(Tanon,美國);Od-yssey雙色紅外熒光成像系統(tǒng)(Li-Cor,美國);全波長分光度計(上海菁華有限公司,UV2000);熒光顯微鏡(Nikon Eclipse 80i);恒溫箱(Sanyo);高速攪拌器(Fluka,美國)。

        1.3造模

        將SD大鼠適應性飼養(yǎng)1周,然后隨機分成正常組、模型組、中藥組和秋水仙堿組,每組各7只。正常組腹腔注射生理鹽水每只0.5 mL/天,其余3組大鼠腹腔注射豬血清每只0.5 mL/天。每周兩次,共注射12周。

        1.4治療

        腹腔注射6周后,在保持造模不變情況下,進行藥物灌胃治療,灌胃量為1 mL/100 g大鼠體質量。中藥組給予大黃蟲丸加味湯劑;正常組及模型組予生理鹽水;秋水仙堿組予以秋水仙堿溶液。治療1次/天,共6周。每周一稱量大鼠體質量,隨體質量的變化更改造模及治療的藥量。

        1.5樣本采集及處理

        1.5.1肝組織病理HE染色 治療6周后,以10%水合氯醛(0.35 mL/100 g)腹腔注射麻醉大鼠,固定,打開腹腔并迅速分離出肝臟,切取左葉肝臟相同部位,常規(guī)脫水后用3%福爾馬林溶液固定,石蠟包埋,4 μm切片。切片用二甲苯脫蠟,經(jīng)各級乙醇至水洗;蘇木素染色浸泡2~5分鐘,自來水沖洗;鹽酸乙醇分化30秒鐘;自來水浸泡15分鐘;0.5%伊紅染液浸泡2分鐘,自來水沖洗;常規(guī)脫水,透明,封片。

        1.5.3蛋白免疫印跡法檢測肝組織PDGF-BB蛋白及PDGFR蛋白的表達 每組隨機選取3個樣本肝臟50~100 g,剪碎勻漿,5%濃縮膠80 V電泳約30分鐘,10%分離膠120 V電泳至溴酚藍到底,60 mA冰浴過夜轉膜,封閉后一抗(1∶10000)室溫搖床孵育1小時,洗膜后二抗(1∶10000)室溫搖床孵育1小時,洗膜后掃描成像,采用軟件Image J2x對圖像進行灰度分析。

        1.6統(tǒng)計學處理

        2 結果

        2.1各組大鼠肝組織病理染色比較

        如圖1所示,正常組大鼠肝組織肝小葉結構正常,肝細胞索排列整齊,以中央靜脈為中心呈放射狀排列,肝細胞無變性、壞死,無膠原纖維增生;模型組大鼠肝小葉結構破壞,肝細胞排列紊亂,匯管區(qū)擴大伴炎性細胞浸潤,伴有膠原纖維增粗增厚。中藥組與秋水仙堿組肝細胞排列較為整齊,肝細胞結構異常少見,有少量膠原纖維增生沉積,肝臟炎癥及纖維化程度較模型組有所減輕。

        2.2各組大鼠肝組織羥脯氨酸含量比較

        與正常組相比,模型組、中藥組、秋水仙堿組羥脯氨酸含量明顯下降,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01);與模型組相比,中藥組、秋水仙堿組羥脯氨酸含量下降(P<0.05),但中藥組與秋水仙堿組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

        注:A:正常組;B:模型組;C:中藥組;D:水仙堿組

        表1 各組大鼠肝組織羥脯氨酸含量±s,μg/mL)

        注: 與正常組相比,aP<0.01;與模型組相比,bP<0.05。剔除造模失敗大鼠,故每組選取3只。

        2.3各組大鼠肝組織PDGF-BB及受體PDGFR蛋白表達結果

        與正常組相比,模型組、中藥組、秋水仙堿組PDGF-BB及受體PDGFR蛋白表達有顯著差異(P<0.01);與模型組相比,中藥組、秋水仙堿組含量下降,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01);中藥組與秋水仙堿組組間比較無差異(P>0.05)。

        表2 各組大鼠PDGF、PDGFR蛋白表達情況

        注: 與正常組相比,aP<0.01;與模型組相比,bP<0.01。剔除造模失敗大鼠,故每組選取3只。

        圖2 各組大鼠肝組織PDGF-BB蛋白的表達

        圖3 各組大鼠肝組織PDGFR蛋白的表達

        3 討論

        大黃蟲丸是《金匱要略》中的名方,見于《金匱·血痹虛勞》:“五勞虛極羸瘦,腹?jié)M不能飲食、食傷、憂傷、飲傷、房室傷、饑傷、勞傷、經(jīng)絡營衛(wèi)氣傷,內有干血,肌膚甲錯,兩目黯黑,緩中補虛,大黃蟲丸主之?!北痉接墒齑簏S、土鱉蟲、虻蟲、蠐螬、水蛭、苦杏仁、黃芩、生地黃、干漆、桃仁、白芍、甘草組成,全方共奏活血化瘀、清熱潤燥、滋陰養(yǎng)血之功效。據(jù)報道[3],大黃蟲丸臨床運用較為廣泛,涉及40余種疾病的治療,常用于治療慢性肝炎、肝纖維化及肝硬化[4,7],取得了不錯的療效。黃芪、水紅花子是中醫(yī)藥治療肝病的常用中藥,本課題組在前期的實驗研究中發(fā)現(xiàn)二者均能對免疫性肝纖維化大鼠的肝纖維化指標及肝臟病理都有不同程度的改善[5-6]。本課題實驗將經(jīng)方大黃蟲丸與黃芪、水紅花子配伍結合使用,在臨床經(jīng)驗取得一定療效的基礎上,探討此中藥復方對免疫性肝纖維化大鼠的拮抗作用機制。

        中醫(yī)學無免疫性肝纖維化這一病名,根據(jù)其臨床特點及癥狀可參考“脅痛” “肝積” “臌脹” “黃疸”等病證范疇,其病因多為飲食失節(jié)、情志失常、勞傷虛損、感染蟲毒等,致濕熱邪毒內蘊、傷陰耗氣、痰凝血瘀、損傷肝絡,發(fā)為此病[7]。根據(jù)“久病入絡”理論,免疫性肝纖維化的主要病機往往為正氣虛弱,肝絡瘀阻。大黃蟲丸重在活血化瘀通絡,配伍水紅花子增強化瘀之力,然血行有賴于氣的運行,氣為血之帥,氣行則血行,再配伍黃芪以益氣通絡,全方合用起到益氣化瘀通絡之功效。

        現(xiàn)代研究表明,在免疫性肝纖維化發(fā)生、發(fā)展過程中,羥脯氨酸在肝臟中的含量能反映肝纖維化膠原代謝情況,作為肝星狀細胞的強烈有絲分裂原的PDGF,能夠刺激HSC的增殖從而造成膠原纖維的增生和沉積,同時PDGF能以自分泌和旁分泌的方式發(fā)揮作用[8]。在對肝纖維化患者的研究中發(fā)現(xiàn),對HSC增殖活化起重要作用的PDGF和其受體PDGF-R的表達均上調[9]。本實驗結果表明,模型組大鼠肝組織病理HE及羥脯氨酸含量增高顯示肝纖維化模型成立;經(jīng)大黃蟲丸加味湯劑治療后,肝臟病理反映肝纖維化程度的改善,肝組織羥脯氨酸含量較模型組減少,PDGF-BB蛋白和PDGFR蛋白表達明顯下降。筆者認為,大黃蟲丸加味湯劑能降低肝組織羥脯氨酸含量,能抑制肝組織中PDGF-BB蛋白及PDGFR蛋白的表達,提示大黃蟲丸加味黃芪、水紅花子抗肝纖維化作用可能與其抑制肝星狀細胞增殖活化,進而減少膠原沉積有關。現(xiàn)代藥物抗肝纖維化的研究大部分仍處于臨床前研究階段[10],中藥復方制劑具有多層次、多途徑、多靶點抗肝纖維化的整體治療優(yōu)勢[2]。本實驗為闡釋大黃蟲丸配伍黃芪、水紅花子對免疫性肝纖維化的拮抗作用機制提供了一定的實驗數(shù)據(jù),同時為臨床上更好地使用大黃蟲丸配伍黃芪、水紅花子抗免疫性肝纖維化提供了理論依據(jù)和思路。

        [1]劉瑤. 早期乙肝肝硬化中醫(yī)證素特征及其與血漿CTGF、PDGF的相關性研究[D]. 福州:福建中醫(yī)藥大學, 2014.

        [2]李川, 呂文良. 常見中藥復方制劑抗肝纖維化機制研究進展[J]. 環(huán)球中醫(yī)藥, 2013, 6(1): 70-73.

        [3]李康, 黨誠學.大黃蟄蟲丸藥理作用及臨床應用[J].現(xiàn)代中西醫(yī)結合雜志,2004,13(11):1440.

        [4]陳紅. 中西醫(yī)結合治療肝硬化腹水近況[J].廣西中醫(yī)學院學報,2005, 8(1): 65.

        [5]杜宇瓊,車念聰. 黃芪對肝纖維化大鼠肝組織TIMP-1及MMP-1表達的影響[J]. 北京中醫(yī)藥大學學報, 2013, 36(11): 775-778.

        [6]杜宇瓊,車念聰. 水紅花子對免疫肝纖維化大鼠肝功能及血清肝纖維化標志物的影響 [J].中國中醫(yī)急癥, 2011, 20(9):1433-1434.

        [7]翟延君, 張淑榮, 郝寧. 水紅花子研究概況[J].遼寧中醫(yī)學院學報, 2005, 7(3): 226.

        [8]Nagashio Y, Ueno H, Imamura M. Inhibition of transforming growth factor beta decreases pancreatic fibrosis and protects the pancreas against chronic injury inmice[J]. Lab Invest, 2004, 84(12) :1610-1618.

        [9]Bonner JC. Regulation of PDGF and its receptors in fibrotic diseases[J].Cytokine Growth Factor Rev,2004,15(4):255-273.

        [10]白辰,車念聰,劉文蘭.一貫煎湯劑對肝纖維化大鼠肝臟1型膠原的影響[J]. 環(huán)球中醫(yī)藥, 2015, 8(8): 901-903.

        (本文編輯: 韓虹娟)

        Influence of variation on Dahuang Zhechong pill on PDGF protein and PDGFR protein in liver of rats with immune hepatic fibrosis

        WANGJin-guang,CHENian-cong,LIWen-xin,etal.

        SchoolofTraditionalChineseMedicine,CapitalMedicalUniversity,Beijing100069,China

        CHENian-cong,E-mail:cnc088@sohu.com

        ObjectiveTo investigate the influence ofvariationonDahuangZhechongpill combine with mikvetch root and prince’s-feather fruit decoction on PDGF protein and PDGFR protein of rats with hepatic fibrosis. MethodsSD rats were randomly divided into normal group, model group and western medicine, Chinese medicine group. Except the normal group, the other 3 groups were induced liver fibrosis model by intraperitoneal injection of porcine serum, after six weeks of treatment,pathology HE of rat liver was conducted and alkali hydrolysis method was used to decect hydroxyproline content, the expression of PDGF - BB protein and PDGFR protein was detected by protein immunoblot method. ResultsCompared with the normal group, hydroxyproline content ,PDGF-BB proteins and PDGFR protein expression of model group was significantly increased (P<0.01); Compared with model group, the hydroxyproline content in Chinese medicine group and colchicine group was decreased (P<0.05), the expression of PDGF-BB protein and PDGFR protein was decreased significantly (P<0.01); the hydroxyproline content, the expression of PDGF-BB protein and PDGFR protein between Chinese medicine group and colchicine group had no significant difference (P>0.05). ConclusionvariationonDahuangZhechongpill combine with mikvrtch root and prince’s-feather fruit decoction can antagonism liver fibrosis induced by porcine serum, the mechanism may be related to the inhibition of PDGF-BB and PDGFR protein expression, and the inhibition of the hepatic stellate cell activation.

        variationonDahuangZhechongpill;Immune hepatic fibrosis;PDGF;PDGFR

        2015年度首都中醫(yī)藥研究專項(15ZY01);2015年度首都醫(yī)科大學校自然基金(2015ZR25)

        100069北京,首都醫(yī)科大學中醫(yī)藥學院中醫(yī)臨床基礎學系[王金光(碩士研究生) 、車念聰、李文新(碩士研究生)、杜宇瓊、司遠(碩士研究生)、劉曄(碩士研究生)、趙暉]

        王金光(1987- ),2014 級在讀碩士研究生。研究方向:中醫(yī)肝病的證治規(guī)律研究。E-mail:jinguang1213@163.com

        車念聰(1957- ),教授,博士生導師,主任醫(yī)師。研究方向:中醫(yī)肝病。E-mail: cnc088@ sohu.com

        R249

        Adoi:10.3969/j.issn.1674-1749.2016.10.007

        2016-05-15)

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