陳　偉，姜　琦，李　健，周?chē)?guó)雄*

（1.南通大學(xué)附屬東臺(tái)醫(yī)院，江蘇鹽城224200；2.南通大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇南通226001）

低分子肝素對(duì)高脂血癥性胰腺炎大鼠VEGF表達(dá)的影響

陳偉1，姜琦1，李健1，周?chē)?guó)雄2*

（1.南通大學(xué)附屬東臺(tái)醫(yī)院，江蘇鹽城224200；2.南通大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇南通226001）

目的研究低分子肝素對(duì)大鼠高脂血癥性胰腺炎胰腺微循環(huán)的作用機(jī)制。方法將72只健康SD大鼠隨機(jī)分成假手術(shù)組、模型組和治療組各24只，每組再隨機(jī)分成四個(gè)亞組。先采用高脂飲食建立高脂血癥模型，模型組和治療組制作大鼠急性胰腺炎模型，制模成功后治療組分別于0、6、12、18 h開(kāi)始使用低分子肝素皮下注射，各亞組均間隔6 h重復(fù)皮下注射一次，每亞組均干預(yù)4次；模型組和假手術(shù)組同時(shí)間點(diǎn)皮下注射等量生理鹽水對(duì)照。結(jié)果大鼠胰腺血流速度模型組低于假手術(shù)組，治療組高于模型組（P＜0.05）；胰腺組織病理學(xué)評(píng)分模型組高于假手術(shù)組，治療組低于模型組（P＜0.05）；模型組各亞組胰腺血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）蛋白表達(dá)、VEGF mRNA表達(dá)水平均高于假手術(shù)組，而治療組均低于模型組（P＜0.05）。結(jié)論大鼠高脂血癥性胰腺炎，VEGF與微循環(huán)障礙密切相關(guān)；低分子肝素可能通過(guò)下調(diào)胰腺組織VEGF水平來(lái)改善胰腺微循環(huán)障礙，減輕胰腺組織進(jìn)一步損害，且早期干預(yù)價(jià)值更大。

高脂血癥性胰腺炎；低分子肝素；血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子；微循環(huán)障礙；大鼠

〔Abstract〕Objective To study the action mechanism of low molecular weight heparin on pancreatic microcirculation of rats with hyperlipidemic pancreatitis.M ethods 72 healthy SD rats were random ly divided into sham operation group，model group and treatment group with 24 rats in each group.Then each group was random ly divided into four subgroups.The rats were first used the high fat diet to establish hyperlipidemia model，the model group and treatment group was to make acute pancreatitis rat models，after the model success，the treatment group were given low molecular heparin subcutaneous injection at 0，6，12 and 18 h，the subgroups were repeated the rejection per 6 hours for four times per；model group and sham operation group were injected with equivalent saline at the same time.Results The pancreatic blood flow velocity in model group was lower than that in the sham operation group，the treatment group was higher than that in the model group（P＜0.05）.The pathological score in the model group was higher than that in sham operation group，the treatment group was lower than that in model group（P＜0.05）.The expression of VEGF protein and mRNA VEGF expression in the model group were significantly higher than those in the sham operation group，the treament group was lower than that in the model group（P＜0.05）. Conclusion VEGF is closely related to the disturbance of microcirculation in rats with hyperlipidemia.The low molecular weight heparin may down regulate the VEGF level of pancreatic tissue to improve the pancreatic microcirculation disturbance，and reduce the damage of pancreatic tissue，and the value of early intervention is greater.

〔Keywords〕hyperlipidemia pancreatitis；low molecular weight heparin；vascular endothelial growth factor；microcirculation disturbance；rats

近年來(lái)高脂血癥性胰腺炎（hyperlipidemic acute pancreatitis，HLAP）的發(fā)病率逐年升高［1］。新近研究表明微循環(huán)障礙是重癥急性胰腺炎（severe acute pancreatitis，SAP）的啟動(dòng)因子和持續(xù)損傷因子［2］，目前研究發(fā)現(xiàn)低分子量肝素（low molecular weight heparin，LMWH）除了抗凝、抗血小板聚集作用外，還有抗炎、調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)脂代謝等作用［3］。王湘英等［4］研究發(fā)現(xiàn)LMWH可能通過(guò)抑制PAF、ET-1/NO濃度發(fā)揮抗血栓作用，從而改善胰腺微循環(huán)，降低胰腺病理?yè)p害，且早期干預(yù)較晚期干預(yù)效果更好。也有研究發(fā)現(xiàn)，肝素可通過(guò)降低SAP血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）水平從而減輕胰腺損害［5］。本研究通過(guò)制作大鼠HLAP模型，觀察胰腺病理學(xué)、胰腺血流速度及血清VEGF、胰腺VEGF變化，LMWH對(duì)其的影響，旨在探討LMWH對(duì)改善HLAP大鼠胰腺微循環(huán)障礙的可能的其他機(jī)制。

1　材料

1.1動(dòng)物

健康SD大鼠72只，雄性，清潔級(jí)，體質(zhì)量（250±20）g，由南通大學(xué)（醫(yī)學(xué)院）動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（蘇）2008-0010。

1.2飼養(yǎng)條件

動(dòng)物飼養(yǎng)在SPF級(jí)屏障環(huán)境內(nèi)，晝夜明暗交替時(shí)間：12 h/12 h。高脂飼料喂養(yǎng)，飲水為自來(lái)水瓶裝后高壓滅菌。動(dòng)物自由采食和飲水；每周換兩次經(jīng)高壓滅菌的松木刨花墊料。飼養(yǎng)室內(nèi)每周用0.5%新潔爾滅水溶液噴霧消毒一次。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（蘇）2012-0031。

1.3主要儀器

（1）全自動(dòng)生化分析儀（日立7600）；（2）J417R高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司）；（3）Eppendorf AG 22331 Hamburg PCR儀（德國(guó)Eppendorf公司）；（4）電子天平（ML204/02，梅特勒-托利多儀器上海有限公司）；（5）Step One Real-Time PCR System（美國(guó)ABI公司）；（6）Preflux 4001雙通道激光多普勒血流儀（瑞典Perimed公司）。

1.4主要試劑

（1）?；悄懰徕c（Sigma公司）；（2）水合氯醛（青島宇龍海藻有限公司）；（3）低分子肝素鈉（希弗全，意大利阿爾法韋士曼制藥公司）；（4）大鼠VEGF ELISA試劑（上海依科賽生物制品有限公司）；（5）VEGF免疫組化試劑盒（ABCAM公司）。

2　方法

2.1造模方法

按隨機(jī)數(shù)字表法分為3組：治療組、模型組、假手術(shù)組，每組各24只。每組再按開(kāi)始干預(yù)時(shí)間點(diǎn)（0、6、12、18 h）隨機(jī)分成4個(gè)亞組，每亞組6只。3組大鼠以高脂飼料（88%的基礎(chǔ)飼料+10%豬油+2%膽固醇）喂養(yǎng)4周，大鼠在高脂飼料喂養(yǎng)前后均抽血化驗(yàn)甘油三脂濃度，以喂養(yǎng)后血清甘油三酯濃度超過(guò)喂養(yǎng)前三倍以上說(shuō)明高脂血癥大鼠模型造模成功。治療組和模型組采用5%?；悄懰徕c（購(gòu)自Sigma公司）逆行胰膽管注射方法制備AP模型。假手術(shù)組僅在手術(shù)中輕輕翻動(dòng)十二指腸。模型制作成功后，治療組大鼠按事先分好的亞組在右側(cè)腹壁皮下注射LMWH 0.2 ml/100 g/次（100 IU/kg/次），每6 h重復(fù)皮下注射一次，每個(gè)亞組共干預(yù)4次，在最后一次干預(yù)后6 h再次麻醉開(kāi)腹取標(biāo)本。模型組和假手術(shù)組均以等量的生理鹽水同樣方法、同樣時(shí)間點(diǎn)做對(duì)照干預(yù)。成模后各組大鼠均禁食、禁飲，常規(guī)補(bǔ)充生理鹽水（背部皮下注射生理鹽水一次2 ml/100 g，每6 h重復(fù)補(bǔ)液一次，直到各組大鼠試驗(yàn)結(jié)束）。

2.2指標(biāo)檢測(cè)

在實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，再次麻醉開(kāi)腹，用多普勒血流儀測(cè)定胰腺血管血流速度，首先在胰頭和胰尾處，然后在胰體部選取和胰頭、尾等距的兩點(diǎn)測(cè)定，測(cè)定時(shí)避開(kāi)大血管或血腫，最后取平均值作為結(jié)果；門(mén)靜脈取血，采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清甘油三酯（Triglyceride，TG）濃度及淀粉酶；取大鼠胰腺組織放入中性甲醛固定液中，用于病理觀察，參照改良Schmidt評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)［6］對(duì)胰腺組織損傷進(jìn)行定量評(píng)分；應(yīng)用免疫組化方法檢測(cè)胰腺組織VEGF，其陽(yáng)性判斷采用光鏡高倍（×400）下觀察，每視野選取100細(xì)胞，連續(xù)觀察5個(gè)視野，根據(jù)胞漿或胞核染色深淺分為4個(gè)等級(jí)（0～3），求5個(gè)視野的平均值，作為一張切片的染色得分；RT-PCR檢測(cè)胰腺組織VEGF mRNA表達(dá)。

2.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)計(jì)量數(shù)據(jù)分析采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行處理，計(jì)量數(shù)據(jù)用“±s”表示，兩組間比較用t檢驗(yàn)，多組間比較用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3　結(jié)果

3.1血清TG及淀粉酶的變化

喂養(yǎng)前三組大鼠TG水平比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；各組喂養(yǎng)后TG水平均較喂養(yǎng)前升高三倍以上，提示高脂血癥模型制備成功。模型組血清淀粉酶與治療組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），而模型組、治療組均高于假手術(shù)組三倍以上，提示急性胰腺炎大鼠模型制備成功（表1）。

表1　各組大鼠血清TG、淀粉酶變化（±s）

表1　各組大鼠血清TG、淀粉酶變化（±s）

注：與假手術(shù)組喂養(yǎng)前比較，△P＜0.01；與各組喂養(yǎng)前比較，#P＜0.01。

分組n TG（mmol/L）喂養(yǎng)前喂養(yǎng)后假手術(shù)組模型組治療組24 24 24 0.680±0.057 2.487±0.272#0.660±0.102 2.338±0.399#0.648±0.087 2.346±0.353#淀粉酶（u/dL）1730.6±301.9 6213.8±451.8△5339.8±421.4△

3.2胰腺微循環(huán)血流速度變化

模型組與假手術(shù)組各對(duì)應(yīng)亞組比較胰腺血管血流速度明顯下降（P＜0.01）；治療組與假手術(shù)組各對(duì)應(yīng)亞組比較胰腺血管血流速度明顯上升（P＜0.01）（表2）。

表2　胰腺血管血流速度比較（±s，n=6）

表2　胰腺血管血流速度比較（±s，n=6）

注：與同時(shí)段假手術(shù)組比較，*P＜0.01；與同時(shí)段模型組比較△P＜0.01。

0 h 6 h 12 h 18 h組別假手術(shù)組模型組治療組100.2±7.8 98.4±8.5 101.7±8.4 99.7±9.2 90.2±5.3*88.4±4.7*84.7±5.5*86.4±4.9* 149.2±6.9△133.1±8.0△117.6±8.1△106.2±6.5△

3.3胰腺組織病理學(xué)改變

假手術(shù)組胰腺組織無(wú)明顯改變。模型組胰腺腺泡小葉水腫，可見(jiàn)大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，點(diǎn)狀出血壞死，胰腺血管內(nèi)可見(jiàn)大量血栓形成，可見(jiàn)較少正常血管管腔。治療組胰腺腺泡小葉水腫，可見(jiàn)大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，點(diǎn)狀出血壞死，胰腺血管內(nèi)可見(jiàn)少量血栓形成，可見(jiàn)較多正常血管管腔，較模型組病理?yè)p傷明顯減輕，病理評(píng)分明顯降低（表3）。

3.4胰腺組織VEGF蛋白表達(dá)的變化

假手術(shù)組胰腺組織中VEGF蛋白較少表達(dá)，胰腺炎成模后胰腺組織中VEGF蛋白明顯表達(dá)，經(jīng)LMWH干預(yù)后治療組胰腺組織VEGF蛋白表達(dá)評(píng)分低于模型組，且隨著開(kāi)始干預(yù)時(shí)間點(diǎn)推移兩者差異逐漸變?。ū?，圖1～4）。

表3　各組胰腺HE染色評(píng)分比較（±s，n=6）

表3　各組胰腺HE染色評(píng)分比較（±s，n=6）

注：與同時(shí)段假手術(shù)組比較，*P＜0.05；與同時(shí)段模型組比較，△P＜0.01。

組別0 h 6 h 12 h 18 h假手術(shù)組模型組治療組0.45±0.51 0.49±0.52 0.50±0.48 0.53±0.51 10.88±0.69*12.31±0.75*12.75±0.73*12.50±0.64* 5.26±0.61*△5.91±0.58*△8.42±0.59*△8.72±0.55*△

表4　胰腺VEGF免疫組化評(píng)分比較（±s，n=6）

表4　胰腺VEGF免疫組化評(píng)分比較（±s，n=6）

注：與同時(shí)段假手術(shù)組比較，*P＜0.05；與同時(shí)段模型組比較，△P＜0.05。

組別0 h 6 h 12 h 18 h假手術(shù)組模型組治療組29.7±5.2 30.2±4.5 31.9±4.7 31.1±5.3 198.4±30.4*232.1±32.2*265.1±31.5*296.5±30.7* 136.2±27.6*△162.7±35.6*△252.1±30.1*284.9±32.8*

圖1　0 h亞組胰腺VEGF免疫組化圖片（×400）

圖2　6 h亞組胰腺VEGF免疫組化圖片（×400）

圖3　12 h亞組胰腺VEGF免疫組化圖片（×400）

圖4　18 h亞組胰腺VEGF免疫組化圖片（×400）

3.5RT-PCR檢測(cè)胰腺組織VEGF mRNA表達(dá)

治療組及模型組中的VEGF mRNA表達(dá)水平均高于假手術(shù)組對(duì)應(yīng)亞組（P＜0.01）（表5）。

4　討論

VEGF屬于一種糖蛋白，其主要作用是促進(jìn)血管的生長(zhǎng)，提高血管通透性，廣泛存在于機(jī)體的各個(gè)組織中，是目前認(rèn)識(shí)的直接作用于機(jī)體內(nèi)皮細(xì)胞最強(qiáng)的細(xì)胞生長(zhǎng)因子［7］。在急性胰腺炎情況下，體內(nèi)VEGF都保持較高水平，在胰腺組織中也出現(xiàn)VEGF高水平表達(dá)，且在急性壞死性胰腺炎升高明顯，VEGF水平的升高可能預(yù)示胰腺炎患者的微循環(huán)障礙出現(xiàn)了加重的趨勢(shì)［8］。VEGF也能夠調(diào)控中性粒細(xì)胞的附壁和浸潤(rùn)，增加血管內(nèi)皮的通透性［9］。

肝素作為一種抗凝藥物在臨床已廣泛應(yīng)用，目前臨床應(yīng)用的肝素制劑有兩種：普通肝素和低分子肝素（LMWH）。LMWH與普通肝素相比具有抗血栓形成能力強(qiáng)、出血危險(xiǎn)性小、半衰期短等優(yōu)點(diǎn)［10］；能和血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合，具有保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞，維持內(nèi)皮細(xì)胞的完整，促使內(nèi)皮細(xì)胞釋放組織纖溶酶原激活物，抑制血栓素的活化，發(fā)揮纖溶和抗血栓作用［11］；近年來(lái)有研究發(fā)現(xiàn)低分子肝素還可能通過(guò)抑制NF-kB的活性，從而誘導(dǎo)胰腺腺泡細(xì)胞凋亡，減輕胰腺炎癥程度［12］。低分子肝素還可能通過(guò)抑制HIF-1α，VEGF和TGF-β1改善腹膜功能和抑制腹膜纖維化［13］。

表5　VEGF mRNA在胰腺組織中表達(dá)水平（±s，n=6）

表5　VEGF mRNA在胰腺組織中表達(dá)水平（±s，n=6）

注：與同時(shí)段假手術(shù)組比較，*P＜0.05；與同時(shí)段模型組比較，##P＜0.01。治療組相鄰各亞組兩兩比較，△P＜0.05。

0 h 6 h 12 h 18 h組別假手術(shù)組模型組治療組0.96±0.12 1.04±0.08 0.97±0.12 1.02±0.07 8.67±1.28*9.32±1.21*10.41±1.33*9.29±1.11* 4.89±1.77*#5.77±1.21*##6.52±1.12*##8.27±1.35*△

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)HLAP大鼠采用LMWH進(jìn)行不同時(shí)間點(diǎn)（0、6、12、18 h）皮下注射干預(yù)和生理鹽水同樣的方法皮下注射對(duì)照比較。結(jié)果說(shuō)明：（1）LMWH可以改善HLAP大鼠模型的胰腺微循環(huán)障礙，減輕胰腺壞死程度及微血管內(nèi)血栓形成，經(jīng)過(guò)LMWH干預(yù)后大鼠血清VEGF、胰腺組織VEGF及VEGF mRNA表達(dá)水平與同時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組均有所下調(diào)，我們推論LMWH可能通過(guò)下調(diào)胰腺組織VEGF水平來(lái)改善胰腺微循環(huán)障礙，減輕胰腺組織進(jìn)一步損害。（2）LMWH早期應(yīng)用（6～12 h）對(duì)降低VEGF水平改善胰腺微循環(huán)障礙意義更大。

綜上所述，大鼠高脂血癥性胰腺炎時(shí)，VEGF與微循環(huán)障礙密切相關(guān)；低分子肝素可能通過(guò)下調(diào)胰腺組織VEGF水平來(lái)改善胰腺微循環(huán)障礙，減輕胰腺組織進(jìn)一步損害，且早期干預(yù)價(jià)值更大。

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（本文編輯 李杰）

Effect of Low M olecular Weight Heparin on the Expression of VEGF in Rats w ith Hyperlipidem ic Pancreatitis

CHEN Wei1，JIANG Qi1，LI Jian1，ZHOU Guoxiong2*
（1.Affiliated Dongtai Hospital of Nantong Medical Uniwersity，Yancheng，Tiangsu 224200，China；2.Affiliated Hospital of Nantong Medical Uniwersity，Nantong，Jiangsu 226001，China）

R587

A

doi：10.3969/j.issn.1674－070X.2016.05.006

2015-10-20

江蘇省鹽城市醫(yī)學(xué)科技發(fā)展項(xiàng)目（YK20130106）。

陳偉，男，主治醫(yī)師，碩士研究生，研究方向：消化內(nèi)科疾病的防治。

*周?chē)?guó)雄，男，教授，博士研究生導(dǎo)師，E-mail：zhou.guoxiong@aliyun.com。