王 勇,黃永松,李冬春,胡 擁,王 威
(湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院,湖南長(zhǎng)沙410005)
補(bǔ)腎健骨湯對(duì)去卵巢大鼠股骨頸骨小梁微血管和骨密度的影響
王勇,黃永松,李冬春,胡擁,王威
(湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院,湖南長(zhǎng)沙410005)
目的探討補(bǔ)腎健骨湯對(duì)股骨頸骨小梁微血管及骨密度影響。方法采用切除大鼠卵巢方法建立骨質(zhì)疏松癥模型,建模成功后隨機(jī)分為正常組、假手術(shù)組、去勢(shì)模型組、雷洛昔芬組、補(bǔ)腎健骨湯組,電鏡觀察股骨頸骨小梁微血管變化以及骨密度檢測(cè)股骨頸骨密度。結(jié)果(1)正常組微血管規(guī)則、連續(xù),骨小梁連續(xù)且致密,厚度均勻;去勢(shì)模型組微血管變形變窄,斷裂,骨小梁稀疏、萎縮,連續(xù)中斷;補(bǔ)腎健骨湯、雷洛昔芬組骨小梁微血管粗細(xì)較均勻,骨小梁出現(xiàn)部分?jǐn)嗔?、排列欠?guī)則。(2)假手術(shù)組與正常組骨密度無差異(P>0.05);去勢(shì)模型組骨密度下降明顯,但低于補(bǔ)腎健骨湯組及雷洛昔芬組(P<0.05)。結(jié)論補(bǔ)腎健骨湯可有效改善股骨頸骨小梁微結(jié)構(gòu)并提高骨密度,說明其對(duì)絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的防治及降低骨折發(fā)生起到積極作用。
絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥;去卵巢大鼠;骨小梁微血管;骨密度;補(bǔ)腎健骨湯;熟地黃;淫羊藿;骨碎補(bǔ)
〔Abstract〕Objective To investigate the effects of Bushen Jiangu decoction on femoral neck bone trabecular microvascular and its bone mineral density(BMD)in ovariectomized rats.M ethods The osteoporosis model rats were built by their ovaries removed,which were assigned to the normal group,sham-operation group,model group,raloxifene group,Bushen Jiangu decoction group.The changes of femoral neck bone trabecular capillaries were observed by electron microscopy and its BMD was detemined.Results(1)The microvessel of normal group was regular and continuous,bone trabecula was continuous,compact and with uniformity of thickness.The microvessel of ovariectomized models was narrow deformation,fracture,bone trabecular sparse,atrophy and break of continuous.The bone trabecular microvascular of Bushen Jiangu decoction and raloxifene groups was with uniform thickness,bone trabecular appear some fault,arranging owe rules.(2)There is no difference between control group and sham-operation group(P>0.05);the ovariectomized rats's BMD was reduced significantly,but it was lower than that of Bushen Jiangu decoctionand raloxifene groups(P<0.05).Conclusion Bushen Jiangu decoction can improve the ovariectomized rat`s femoral neck bone structure and its bone mineral density.It is proving that Bushen Jiangu decoction can cure postmenopausal osteoporosis and reuce the rate of fracture.
〔Keywords〕postmenopausal osteoporosis;ovariectomized rats;trabecular microvessel;bone mineral density;Bushen Jiangu decoction;Radix Rehmanniae Preparata;Herba Epimedii;Rhizoma Drynariae
隨著老齡化社會(huì)的到來,影響婦女生活質(zhì)量的絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(postmenopausal osteoporosis,PMO)的發(fā)病率越來越高,由其引起的骨折及并發(fā)癥日益受到關(guān)注。在臨床應(yīng)用中發(fā)現(xiàn),具有補(bǔ)腎益骨功效的補(bǔ)腎健骨湯能夠有效地改善婦女PMO的癥狀,為進(jìn)一步明確研究組經(jīng)驗(yàn)方“補(bǔ)腎健骨湯”作用機(jī)制,本文以去卵巢(去勢(shì))大鼠建立PMO模型,使用掃描電鏡觀察去勢(shì)大鼠股骨頸骨小梁微血管變化,骨密度儀檢測(cè)大鼠股骨頸骨密度來探討補(bǔ)腎健骨湯對(duì)PMO的防治作用?,F(xiàn)將方法與結(jié)果報(bào)道如下。
1.1材料
1.1.1動(dòng)物4月齡SPF級(jí)未交配健康雌性大鼠60只,體質(zhì)量(200±20)g,湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供[動(dòng)物許可證號(hào):SCXK(湘)2011-0003,質(zhì)量合格證4304702577]。動(dòng)物購進(jìn)后適應(yīng)性喂養(yǎng)一周,于SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室喂養(yǎng),按清潔級(jí)標(biāo)準(zhǔn)、分籠同環(huán)境飼養(yǎng),大鼠攝食為無菌標(biāo)準(zhǔn)飼料和蒸餾水。保持飼養(yǎng)環(huán)境的通風(fēng),光照,溫度23~26℃,相對(duì)濕度40%-70%,大鼠籠養(yǎng),自由攝食、飲水。許可證號(hào):SYXK(湘)2009-0001。
1.1.2藥物補(bǔ)腎健骨湯:熟地黃20 g,淫羊藿15 g,骨碎補(bǔ)15 g,補(bǔ)骨脂10 g,黃芪20 g,白術(shù)15 g,茯苓10 g,甘草6 g(由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院中藥房提供),由中藥制劑室統(tǒng)一煎制,并經(jīng)過恒溫水浴制成150 mL濃縮藥液,藥液濃度為0.74 g/mL。雷洛昔芬,60 mg×1片,山東宏富達(dá)醫(yī)藥化工有限公司;用法:每次60 mg搗碎后放入60 mL蒸餾水中制成懸濁液,藥液濃度為1 mg/mL。
1.1.3試劑2%戊巴比妥鈉,科昊生物工程有限責(zé)任公司生產(chǎn)(生產(chǎn)編號(hào)DH0602)。注射用青霉素鈉,哈藥集團(tuán)制藥總廠,規(guī)格:80萬單位/瓶,批號(hào):A101002008。
1.1.4實(shí)驗(yàn)設(shè)備掃描電鏡(PHILIPSXL30W/ TMR)、雙能X線吸收骨密度儀(法國MEDILINK公司,型號(hào):OSTEOCORE)。
1.2方法
1.2.1動(dòng)物分組基于預(yù)實(shí)驗(yàn)研究,將若干雌性大鼠(>60只)分為正常對(duì)照組(12只)、假手術(shù)組(12只)、其余雌鼠確認(rèn)造模成功后隨機(jī)分去勢(shì)模型組(12只)、補(bǔ)腎健骨湯組(12只)、雷洛昔芬組(12只)。
1.2.2動(dòng)物造模在SPF實(shí)驗(yàn)中心喂養(yǎng)約一周,待雌鼠適應(yīng)環(huán)境后開始實(shí)驗(yàn)造模。腹腔麻醉根據(jù)每只雌鼠的體質(zhì)量以2%戊巴比妥鈉按40 mg/kg標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算劑量;取俯臥位,備皮、消毒、鋪無菌單。取肋骨緣下、后正中線旁開1.5 cm處雙背側(cè)約1 cm縱切口,進(jìn)入腹腔后緩慢牽出卵巢,結(jié)扎止血后摘除卵巢,依次縫合關(guān)閉傷口。其中,假手術(shù)組僅在雙側(cè)暴露卵巢后,切除其周圍約1 cm3大小脂肪組織,不結(jié)扎輸卵管,不切除卵巢,余手術(shù)操作同上。術(shù)后使用青霉素5萬U/只肌肉注射3 d抗感染;正常組不處理。
1.2.3動(dòng)物給藥根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,我們?nèi)酝ㄟ^雌鼠去卵巢造模術(shù)后4周行骨密度檢測(cè)驗(yàn)證模型復(fù)制成功,然后按每日兩次開始灌胃,共持續(xù)8周;正常組、假手術(shù)組、去勢(shì)模型組另以蒸餾水灌胃。按照人與動(dòng)物體表面積換算公式計(jì)算給藥劑量(大鼠體質(zhì)量設(shè)200 g,人體質(zhì)量設(shè)60 kg),雷洛昔芬組按照6.092 mg/(kg·d)灌胃,補(bǔ)腎健骨湯組以生藥量計(jì)算,按照11.270 g/(kg·d)灌胃(以上藥物需按藥液濃度換算后以藥液形式灌胃)。
1.2.4指標(biāo)觀察骨密度檢測(cè):大鼠處死前行骨密度儀器檢測(cè)骨密度,采用骨密度儀小動(dòng)物掃描軟件精細(xì)掃描定位測(cè)定一側(cè)股骨頸部的骨密度值;掃描電鏡觀察:股骨近端頭頸部供骨區(qū)用骨刀獲取約5 mm3大小松質(zhì)骨標(biāo)本,后生理鹽水反復(fù)沖洗,除去骨表面組織級(jí)異物后,注意標(biāo)示出股骨頸橫斷面為觀察面,以2.5%戊二醛固定1 d以上,后高頻超聲清洗30 min,酒精脫水,再以醋酸異戊酯保存過夜,檢測(cè)前以離子濺射儀干燥,噴金,標(biāo)記編號(hào)后在掃描電鏡下觀察股骨頸骨小梁微血管形態(tài)及相關(guān)結(jié)構(gòu),記錄后攝片。
1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件包對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,計(jì)量資料用“±s”表示;以正態(tài)性分布檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn)(P>0.05),再用單因素方差分析進(jìn)行組間兩兩比較,用LSD檢驗(yàn),以P<0.05差異統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.1一般情況
基于預(yù)實(shí)驗(yàn)研究,正式實(shí)驗(yàn)雌鼠60只,分為5組:正常組、假手術(shù)組、去勢(shì)模型組、補(bǔ)腎健骨湯組、雷洛昔芬組;整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中無大鼠死亡。
在大鼠飼養(yǎng)過程中,對(duì)其活動(dòng)、飲食及精神狀態(tài)等進(jìn)行觀察。其中正常組在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中,活躍喜動(dòng),反應(yīng)敏捷,毛發(fā)順滑光亮,飲食、睡眠良好;假手術(shù)組在術(shù)后3 d飲食、活動(dòng)及精神狀態(tài)逐漸恢復(fù),與正常組無差異;去勢(shì)模型組、補(bǔ)腎健骨湯組、雷洛昔芬組在造模后1個(gè)月內(nèi)出現(xiàn)活動(dòng)量減少、毛發(fā)干枯、少動(dòng)欲睡等情況。在開始治療灌胃后補(bǔ)腎健骨湯組及雷洛昔芬組的大鼠精神逐漸好轉(zhuǎn),反應(yīng)靈敏,毛發(fā)逐漸順滑;去勢(shì)模型組大鼠精神仍欠佳,少動(dòng)嗜睡,反應(yīng)遲鈍,毛發(fā)干枯無光澤。
2.2股骨頸骨小梁微血管觀察
正常組及假手術(shù)組的骨小梁微血管表面完整,粗細(xì)均勻,連續(xù)性可,骨小梁形態(tài)對(duì)稱,間隙可,骨吸收孔為近圓形;去勢(shì)模型組股骨頸骨小梁微血管變形變窄,發(fā)生斷裂萎縮,表面部分結(jié)構(gòu)脫落,甚至可見游離物質(zhì),骨小梁稀疏、變細(xì)變薄,間隙增寬,連續(xù)性中斷、殘端增多,有大量微骨折形成;補(bǔ)腎健骨湯、雷洛昔芬組與去勢(shì)模型組相比其骨小梁微血管尚規(guī)則,表面少許結(jié)構(gòu)脫落,粗細(xì)較均勻,連續(xù)性尚可,骨小梁結(jié)構(gòu)基本完整,排列欠規(guī)則,表面部分微骨裂。(見圖1)。
圖1 大鼠股骨頸骨小梁表面變化(掃描電鏡圖)
2.3股骨頸骨密度測(cè)定
假手術(shù)組與正常對(duì)照組相比,兩組骨密度無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);去勢(shì)模型組與正常對(duì)照組相比,骨密度減少明顯,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),提示造模成功;與去勢(shì)模型組相比較,補(bǔ)腎健骨湯組、雷洛昔芬組骨密度差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);其中雷洛昔芬組骨密度要略高于補(bǔ)腎健骨湯組,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。
表1 各組大鼠股骨頸骨密度比較(±s)
表1 各組大鼠股骨頸骨密度比較(±s)
注:與正常組比△P<0.05;與去勢(shì)模型組比●P<0.05。
組別正常對(duì)照組假手術(shù)組去勢(shì)模型組雷洛昔芬組補(bǔ)腎健骨湯組n 12 12 12 12 12骨密度(g/cm2)0.211±0.016 0.209±0.015 0.169±0.008△0.207±0.014●0.204±0.011●
PMO是婦女的一種全身性骨代謝疾病,見于更年期,目前發(fā)病率不斷上升;目前檢測(cè)骨質(zhì)疏松是通過骨密度儀檢測(cè)。骨質(zhì)疏松直接表現(xiàn)是骨密度的降低,嚴(yán)重時(shí)直接導(dǎo)致骨質(zhì)疏松性骨折[1],我國女性一生發(fā)生骨質(zhì)疏松性骨折的危險(xiǎn)性(40%)高于乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌和卵巢癌的總和[2]。發(fā)生此類骨折的患者此后一年死亡風(fēng)險(xiǎn)明顯增高;長(zhǎng)期的慢性疼痛和功能障礙也很常見;對(duì)跌倒的畏懼還可導(dǎo)致臥床、孤獨(dú),并容易患上老年抑郁癥?,F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為,女性絕經(jīng)后,卵巢功能下降,雌激素迅速減少,從而引起骨吸收和骨重建平衡失調(diào),被公認(rèn)為是PMO發(fā)生的重要原因[3]。雌激素缺乏一方面使破骨細(xì)胞過度活躍,骨吸收大于骨形成,影響骨膠原的成熟、轉(zhuǎn)換和骨礦化;另一方面抑制甲狀旁腺素(PTH)分泌,使1-25(OH)2D3合成減少,造成負(fù)鈣平衡,骨礦含量減少,導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥。從微觀角度看,PMO發(fā)生后,骨小梁微血管發(fā)生形變、狹窄、萎縮甚至斷裂,骨小梁變細(xì)、變形、稀疏,小梁間隙增大,壁變薄。HE Shuzheng[4]研究表明,絕經(jīng)后婦女雌激素水平下降,血液流變學(xué)呈“高黏稠”狀態(tài),造成微循環(huán)障礙,導(dǎo)致微血管滲漏和結(jié)構(gòu)破壞。微血管損傷是骨質(zhì)疏松松質(zhì)骨超微結(jié)構(gòu)改變的基礎(chǔ),微血管在骨的生成、重建、修復(fù)過程中起著至關(guān)重要的作用;超微結(jié)構(gòu)改變必將導(dǎo)致骨質(zhì)的整體力學(xué)強(qiáng)度下降,使微骨裂、微骨折增多。目前西藥治療骨質(zhì)疏松癥從減少骨吸收或者促進(jìn)骨形成著手,而PMO的骨松質(zhì)吸收迅速,骨代謝轉(zhuǎn)換率高,呈高轉(zhuǎn)換狀態(tài),治療時(shí)可考慮使用骨吸收抑制劑[5]。
中醫(yī)學(xué)無“絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥”一詞記載,從其臨床主要表現(xiàn)以及發(fā)病機(jī)制來看,可屬“骨痿”“骨枯”或“腎虛腰痛”范疇。絕經(jīng)后婦女由于腎氣虛衰,沖任不足,精枯髓少,充養(yǎng)乏源,骨失所養(yǎng),則骨體枯槁,則發(fā)為腰膝酸軟、行走不便的骨痿或骨枯。可見本病的發(fā)病關(guān)鍵是“腎虛”,其病機(jī)主要與肝腎虧損、脾弱血虛、瘀血阻絡(luò)有關(guān)[6]。中醫(yī)藥對(duì)PMO的治療著重于整體的調(diào)節(jié),緊密圍繞腎主骨生髓的理論,多用補(bǔ)腎法,或在此基礎(chǔ)上加用養(yǎng)肝健脾、補(bǔ)血活血之品治療[7]。大量實(shí)驗(yàn)證實(shí)了一些補(bǔ)腎中藥具有與雌激素類似的作用,或被證明含有黃酮類藥植物具有抗骨質(zhì)疏松作用[8]。黎漢文等[9]以補(bǔ)腎壯骨方(杜仲、熟地黃、鹿角膠、黃芪、當(dāng)歸、延胡索、牛膝、丹參、補(bǔ)骨脂、茯苓)治療30例PMO患者10個(gè)月后,臨床總有效率96%,明顯優(yōu)于西藥對(duì)照組(50%),且雌二醇及BMD明顯增加。
補(bǔ)腎健骨湯治療PMO,方中重用熟地黃為君以滋腎填精,大補(bǔ)真陰。淫羊藿、骨碎補(bǔ)、補(bǔ)骨脂補(bǔ)腎壯陽,強(qiáng)筋壯骨,在補(bǔ)陰之中配伍補(bǔ)陽藥,取“陽中求陰”之義,均為臣藥;黃芪、白術(shù)、茯苓益氣健脾,補(bǔ)后天生化之源以充腎精,又防補(bǔ)甚滋膩傷及脾胃,俱為佐藥;甘草調(diào)中。諸藥合用共奏補(bǔ)腎益精、強(qiáng)筋壯骨增髓之效。熟地黃作為中藥最為常用的補(bǔ)益品種,被各位醫(yī)家廣為選用[10]?,F(xiàn)代的研究證實(shí)熟地黃具有抗疲勞、益智之效;同時(shí)可改善免疫系統(tǒng)和造血系統(tǒng),增強(qiáng)人的體質(zhì)。傳統(tǒng)補(bǔ)腎中藥淫羊藿,有研究證實(shí)淫羊藿具有雌激素樣作用,在骨質(zhì)代謝中能降低可誘導(dǎo)骨質(zhì)疏松發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)[11]。劉劍鋼等人研究表明骨碎補(bǔ)能改善患者的骨密度,加強(qiáng)骨的生物力學(xué)性,升高血清中正性骨重建指標(biāo),如鈣,將有利于骨形成[12]?,F(xiàn)代研究補(bǔ)骨脂可能對(duì)破骨細(xì)胞存在抑制性,而大鼠骨密度、骨鈣含量經(jīng)過本藥的乙酸乙酯萃取物干預(yù)后得到增加,并證實(shí)該生藥提取液能促進(jìn)成骨細(xì)胞形成,達(dá)到防治骨質(zhì)疏松目的?!度杖A子本草》將黃芪功效描述為“助氣,壯筋骨”。研究人員采用體外實(shí)驗(yàn)得出了黃芪能抑制破骨細(xì)胞的骨吸收效能,降低骨吸收率,并促進(jìn)骨形成;為黃芪水提物治療類固醇所致的大鼠骨質(zhì)疏松獲取積極效果提供了可靠的證據(jù)[13]。
本次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)大鼠去卵巢后骨密度明顯下降,骨小梁微血管變形變窄,發(fā)生斷裂,骨小梁稀疏萎縮、變細(xì)變薄,間隙增寬,連續(xù)性中斷,結(jié)構(gòu)破壞明顯,能較客觀地反映PMO模型。使用補(bǔ)腎健骨湯可有效提高骨量,骨小梁微血管形態(tài)及連續(xù)性尚可,少許游離端,骨小梁結(jié)構(gòu)欠完整,排列基本規(guī)則,在改善大鼠股骨頸骨小梁顯微結(jié)構(gòu)及降低骨折發(fā)生方面起到積極的作用,且與雷洛昔芬效果無明顯差異。這一結(jié)果為補(bǔ)腎健骨湯防治PMO的臨床應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。從微觀狀態(tài)或細(xì)胞、分子水平對(duì)其作用點(diǎn)、途徑、機(jī)制及其影響因素的闡明,將有助于提高臨床應(yīng)用中藥的科學(xué)性和準(zhǔn)確性[14],也是時(shí)下(補(bǔ)腎)中藥治療骨質(zhì)疏松取得進(jìn)展的理想途徑。
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(本文編輯 李杰)
Effects of Bushen Jiangu Decoction on Femoral Neck Bone Trabecular M icrovascular and its Bone M ineral Density in Ovariectom ized Rats
WANG Yong,HUANG Yongsong,LIDongchun,HU Yong,WANG Wei
(The Second Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410005,China)
R274
A
doi:10.3969/j.issn.1674-070X.2016.05.004
2015-10-10
湖南省中醫(yī)藥管理局項(xiàng)目(2012106)。
王勇,男,主任醫(yī)師、教授,研究方向:骨與關(guān)節(jié)、骨病的中醫(yī)藥防治。