余　娜，馬思靜，朱克儉*

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南長沙410208；2.湖南省中醫(yī)藥研究院，湖南長沙410006）

臭牡丹總黃酮對(duì)A549細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白的影響

余娜1，馬思靜2，朱克儉2*

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南長沙410208；2.湖南省中醫(yī)藥研究院，湖南長沙410006）

目的觀察臭牡丹總黃酮對(duì)A549肺腺癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）相關(guān)蛋白的影響。方法構(gòu)建β-catenin真核過表達(dá)載體并轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞，將細(xì)胞分為空載組、β-catenin過表達(dá)組、空載組+臭牡丹總黃酮組、β-catenin過表達(dá)+臭牡丹總黃酮組。MTT法檢測不同濃度的臭牡丹總黃酮對(duì)A549細(xì)胞體外增殖的抑制作用。實(shí)時(shí)定量PCR檢測各組β-catenin mRNA的表達(dá)，Western Blot檢測各組β-catenin、E-Cardherin、Vimentin的蛋白水平。結(jié)果MTT顯示A549細(xì)胞活力隨臭牡丹總黃酮濃度的增加受到明顯抑制，IC50為2.1 mg/mL。β-catenin過表達(dá)組較空載組的β-catenin、Vimentin表達(dá)均明顯上調(diào)，E-cardherin表達(dá)下調(diào)。臭牡丹總黃酮在空載組與β-catenin過表達(dá)組均能明顯降低βcatenin mRNA與蛋白水平，增加E-cardherin蛋白表達(dá)，略微降低Vimentin蛋白表達(dá)。結(jié)論臭牡丹總黃酮對(duì)A549肺癌細(xì)胞具有一定的體外抑制增殖作用，其抗腫瘤作用的可能機(jī)制是通過調(diào)控EMT的相關(guān)蛋白從而逆轉(zhuǎn)β-catenin誘導(dǎo)的EMT現(xiàn)象而起作用。

臭牡丹總黃酮；上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化；β-catenin過表達(dá)載體；A549細(xì)胞

〔Abstract〕Objective To observe the effect of the total flavonoid of Clerodendron bungei Steud（CMD）on the epithelial mesenchvmal transition related proteins in A549 cells.M ethods Building theβ-catenin overexpression vector and transfected A549 cells.The cells can be divied into empty vector group，β-catenin overexpression group，empty vector group +CMD group，β-catenin overexpression+CMD group.The proliferation inhibition of the total flavonoid of Clerodendron bungei Steud with different concentrations on A549 cells in vitro was detected by MTT method.The expression ofβ-catenin mRNA was determined with real-time PCR，and the protein expression ofβ-catenin，E-Cardherin，Vimentin was detected with Western Blot.Results MTT showed that the A549 cells vitality were significantly inhibited with the increasing concentrations of the CMD，the IC50 was 2.1mg/mL.Compared with the empty vector group，the expression ofβ-catenin and vimentin was significantly higher，the E-cardherin was lower inβ-catenin overexpression group.The total flavonoid of Clerodendron bungei Steud can reduce the expression ofβ-catenin，increase the expression of E-cardherin，and slightly reduce the expression of Vimentin protein in empty vehicle and theβ-catenin overexpression groups.Conclusion the total flavonoid of Clerodendron bungei Steud has a certain proliferation inhibition effect on A549 lung cancer cells in vitro.The possible mechanisms is that，it can regulate some related proteins to reverse the EMT phenomenon throughβ-catenin cell signaling.

〔Keywords〕the total flavonoid of Clerodendron bungei Steud；the epithelial mesenchvmal transition；β-catenin expression vector；A549 cell

原發(fā)性支氣管肺癌是一種發(fā)生于支氣管黏膜及腺體的惡性腫瘤，屬中醫(yī)學(xué)“肺積”、“肺巖”、“息賁”等范疇，其發(fā)病率和死亡率在全球以及我國均居首位［1-2］。其中，腫瘤局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是腫瘤病程發(fā)生發(fā)展的主要原因，80%以上的肺癌患者確診時(shí)癌細(xì)胞已發(fā)生全身侵犯和轉(zhuǎn)移，進(jìn)入疾病晚期。臭牡丹性平，味辛、苦，有“祛風(fēng)除濕、解毒散瘀”之功，對(duì)多種腫瘤具有臨床治療作用，尤以肺癌為佳。臭牡丹對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有抑制作用，并有一定預(yù)防肺癌發(fā)生及轉(zhuǎn)移的作用［3-4］。

上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）現(xiàn)象是腫瘤發(fā)生及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的重要因素，EMT現(xiàn)象受多條信號(hào)通路、轉(zhuǎn)錄因子以及生長因子的調(diào)控［5］。研究顯示β-catenin在胞內(nèi)穩(wěn)定的高表達(dá)是誘發(fā)EMT現(xiàn)象的重要因素，參與腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移［6］。本研究采用β-catenin的真核過表達(dá)載體轉(zhuǎn)染人肺癌A549細(xì)胞，誘導(dǎo)EMT現(xiàn)象的發(fā)生，研究臭牡丹總黃酮對(duì)EMT現(xiàn)象標(biāo)志蛋白E-Cadherin、β-catenin、Vimentin的影響。

1　材料

1.1細(xì)胞

人肺腺癌細(xì)胞A549購于中南大學(xué)高等研究中心細(xì)胞庫。β-catenin質(zhì)粒（pCDNA3.1+載體，AMP抗性），空載體pCDNA3.1+（AMP抗性），由上海交通大學(xué)金衛(wèi)林教授饋贈(zèng)。

1.2藥物及試劑

總RNA提取試劑RNAiso Plus，逆轉(zhuǎn)錄試劑RT Master Mix Kit均購自寶生物工程有限公司；SYBR Green熒光染料購自Bio-γad公司；DEPC水購自碧云天生物公司；RT-PCR引物購自Invitrogen公司。引物序列：Anti-β-Catenin（D10A8）、Anti-ECadherin（24E10）RabbitmAb、Anti-Vimentin（D21H3）抗體均購自cell signaling technology。Anti-β-Actin抗體、Western Blot相關(guān)試劑均購自Sigma Aldrich。胎牛血清，DMEM培養(yǎng)液，胰酶均購自gibco公司。臭牡丹總黃酮由湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院中藥房提供臭牡丹生藥，經(jīng)湖南省中醫(yī)藥研究院中藥研究所提取，總黃酮含量51%，1 g相當(dāng)于生藥30 g。批號(hào)：20110720。

1.3儀器

金屬浴Grant-bi公司生產(chǎn)；垂直凝膠電泳系統(tǒng)、轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)、化學(xué)發(fā)光儀XRS+由BIO-RAD公司生產(chǎn)；超凈工作臺(tái)，細(xì)胞培養(yǎng)箱均由Thermo Scientific公司生產(chǎn)。

2　方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng)及傳代

人肺癌細(xì)胞A549培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃，5%CO2環(huán)境下培養(yǎng)。傳代采用0.25%含EDTA的胰酶消化后直接分瓶法。

2.2構(gòu)建β-catenin真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞

制備1DH5α大腸桿菌感受態(tài)，并克隆連接有β-catenin目的基因片段的pcDNA3.1過表達(dá)載體，經(jīng)Amp篩選后，選出有外源序列插入的克隆測序。將A549細(xì)胞按106個(gè)密度接種于6孔板中，待細(xì)胞生長至80%-90%，使用Lipo2000 10 uL分別轉(zhuǎn)染空載體pcDNA3.1（+）/EGFP和β-catenin過表達(dá)載體，每孔質(zhì)粒量4μg，與無血清DMEM混勻后加入6孔板，6 h換有血清DMEM/F12，48 h后用熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率。

2.3細(xì)胞分組與給藥

細(xì)胞共分為4組：轉(zhuǎn)染空載體組（pcDNA3.1），轉(zhuǎn)染空載體+臭牡丹總黃酮組（pcDNA3.1+CMD），轉(zhuǎn)染β-Catenin過表達(dá)組（β-Catenin），轉(zhuǎn)染β-catenin過表達(dá)+臭牡丹總黃酮組（β-Catenin+CMD）。用無菌蒸餾水將臭牡丹總黃酮浸膏配成濃度為10 mg/mL的母液，再用無血清培養(yǎng)基配制成2 mg/mL的含藥溶液。待A549細(xì)胞生長密度達(dá)70%～80%時(shí)，加入含藥溶液，置于37℃，5%CO2環(huán)境下培養(yǎng)48 h后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.4MTT方法檢測臭牡丹總黃酮對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響

將臭牡丹總黃酮浸膏溶于無菌水中，母液濃度10 mg/mL。取對(duì)數(shù)生長期的未轉(zhuǎn)染的人肺腺癌A549細(xì)胞株，按5 000個(gè)/孔細(xì)胞鋪于96孔板。培養(yǎng)6～8 h待細(xì)胞充分貼壁后，用含4%FBS的DMEM液配成的不同濃度的臭牡丹總黃酮溶液置換原培養(yǎng)液，每孔200μL，共0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mg/mL 12個(gè)濃度組，每組6個(gè)復(fù)孔。作用48 h后，吸去上清，撤去藥物，加入MTT溶液，37℃，5%CO2環(huán)境下培養(yǎng)4 h后，吸取板內(nèi)溶液，加入二甲基亞砜，在OD490 nm處測量各孔的吸光值。

2.5實(shí)時(shí)定量PCR檢測臭牡丹總黃酮對(duì)βcatenin mRNA的影響

按“2.3”分組與給藥的4組A549細(xì)胞經(jīng)PBS清洗后，收集于總RNA提取試劑，經(jīng)反復(fù)吹打破碎后，加入三氯甲烷溶液劇烈震蕩混勻后，靜置5 min后離心，15 min，4℃；小心吸取上層澄清的水相，加入等體積的異丙醇溶液，上下顛倒混勻10下，離心分離總RNA，加入75%乙醇（DEPC水配制）清洗后，用適量的DEPC水溶解。定量后取一定量RNA，加入適量逆轉(zhuǎn)錄試劑，于37℃轉(zhuǎn)錄15 min。反應(yīng)所得cDNA與上下游引物、SYBR Green熒光染料混勻后進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)。反應(yīng)程序?yàn)轭A(yù)變性95℃10 min，擴(kuò)增：95℃15 s，60℃60 s，最大循環(huán)數(shù)40，引物序列：ACTIN-qPCR-F，CACCATTGGCAATGAGCGGTTCACTIN-qPCR-R，AGGTCTTTGCGGATGTCCACGT，CTNNB1-qPCR-F，CACAAGCAGAGTGCTGAAGGTG，CTNNB1-qPCRR，GATTCCTGAGAGTCCAAAGACAG。結(jié)果采用達(dá)到固定熒光閾值的反應(yīng)循環(huán)數(shù)表示，采用β-actin作為內(nèi)參基因，使用2-ΔΔCT法對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析比較。

2.6Western blot檢測EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)

按2.3分組與給藥的4組A549細(xì)胞經(jīng)裂解液破碎后，收集總蛋白，蛋白樣品與上樣緩沖液混合后，煮沸變性5～10 min。蛋白經(jīng)SDS-PAGE凝膠分離，120 V，70 min后，轉(zhuǎn)移至NC膜；載有蛋白質(zhì)條帶的膜在含有5%脫脂奶粉的TBST溶液中室溫封閉1 h，然后加入含有稀釋一抗（Anti-β-catenin1∶5 000、Anti-E-cadherin 1∶1 500、vimentin 1∶400，內(nèi)參Anti-β-actin1∶5 000），4℃下振蕩孵育過夜，TBST溶液洗滌后加入含1∶2 000稀釋的辣根過氧化物酶（HRP）偶聯(lián)抗體反應(yīng)液（相應(yīng)蛋白的Ⅱ抗、5%脫脂奶粉稀釋），室溫中振蕩孵育1 h。洗滌后，采用ECL化學(xué)發(fā)光顯示液曝光。

2.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量數(shù)據(jù)用“±s”表示，組間比較采用單因素方差分析，并用Sidak法進(jìn)行多重比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3　結(jié)果

3.1臭牡丹總黃酮對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響

臭牡丹總黃酮處理A549細(xì)胞48 h后，MTT檢測細(xì)胞活力顯示，A549細(xì)胞活力受到明顯抑制，隨著給藥濃度增加，細(xì)胞成活率下降，對(duì)細(xì)胞抑制作用增強(qiáng)。其半數(shù)抑制率IC50為2.1 mg/mL。見表1。

表1　臭牡丹總黃酮各濃度組吸光度A值與抑制率濃度（±s，n=6）

表1　臭牡丹總黃酮各濃度組吸光度A值與抑制率濃度（±s，n=6）

濃度mg/mL 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0吸光度1.56±0.25 1.46±0.15 1.43±0.09 1.35±0.12 1.24±0.16 1.05±0.19 0.92±0.23 0.59±0.23 0.40±0.07 0.33±0.03生長抑制率（%）0 6.21 8.01 13.46 20.28 32.3 40.62 61.83 73.77 78.34

3.2臭牡丹總黃酮對(duì)β-catenin mRNA的影響

結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染β-catenin過表達(dá)載體的細(xì)胞的β-catenin mRNA水平明顯增加，而臭牡丹總黃酮可顯著降低β-catenin過表達(dá)A549細(xì)胞內(nèi)βcatenin的mRNA水平，也可降低空載組的βcatenin mRNA水平，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖1。

3.3臭牡丹總黃酮對(duì)EMT相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

β-catenin過表達(dá)組較空載組的β-catenin、Vimentin表達(dá)明顯上調(diào)，E-cardherin表達(dá)略有下調(diào)，有誘導(dǎo)EMT現(xiàn)象的傾向。臭牡丹總黃酮在空載組與β-catenin過表達(dá)組均能明顯降低β-catenin表達(dá)，增加E-cardherin表達(dá)，略微降低Vimentin蛋白表達(dá)，有逆轉(zhuǎn)EMT現(xiàn)象的傾向。見圖2。

4　討論

圖1　臭牡丹總黃酮對(duì)β-catenin mRNA的影響

臭牡丹，性寒，具有“祛風(fēng)除濕、解毒散瘀、消腫止痛之功”，符合肺癌“化瘀解毒”的中醫(yī)治療原則。并具有一定的的補(bǔ)益脾肺腎之力，可治療肺癌肺腎氣虛所致的虛勞咳喘。課題組曾采用淋巴瘤Raji細(xì)胞與人肺腺癌A549細(xì)胞對(duì)臭牡丹提取物的四個(gè)不同樣品進(jìn)行抗腫瘤實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)四個(gè)樣品均有不同程度的體外細(xì)胞毒作用，在綜合考慮以上四個(gè)組分的抗腫瘤強(qiáng)度、提取工藝等因素后，最終確定臭牡丹總黃酮為抗腫瘤有效成分之一，并對(duì)其抗腫瘤作用機(jī)制進(jìn)行研究。臭牡丹黃酮類化合物對(duì)Lewis肺癌小鼠皮下瘤及轉(zhuǎn)移瘤、人肺癌細(xì)胞A549、H460具有一定的抑制增殖與誘導(dǎo)凋亡作用［7-8］。

圖2　臭牡丹總黃酮對(duì)EMT相關(guān)蛋白的調(diào)控電泳圖

上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）是指上皮細(xì)胞在特定的生理和病理情況下，向間質(zhì)細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化，同時(shí)伴隨有細(xì)胞形態(tài)與細(xì)胞功能的改變［9-10］。EMT現(xiàn)象中具有共同的細(xì)胞學(xué)機(jī)制，上皮屬性蛋白如E鈣黏蛋白（E-eadherin）、角蛋白（Keratin）表達(dá)下調(diào)，間質(zhì)屬性蛋白如波形蛋白（Vimentin）、纖維連接蛋白（Fibronectin）表達(dá)上升，β-catenin入核，細(xì)胞骨架改變。其中E-cardherin維持著上皮細(xì)胞表型，是腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的抑制因子。Vimentin蛋白是EMT中由上皮屬性轉(zhuǎn)向間質(zhì)屬性的重要標(biāo)志物，與腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。β-catenin一方面與E-cardherin結(jié)合，形成β-eatenin/E-cadherin復(fù)合體，調(diào)節(jié)細(xì)胞間粘附，維持著上皮極性和完整性。另一方面β-catenin可作為轉(zhuǎn)錄激活因子，調(diào)控EMT相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展與轉(zhuǎn)移［11］。在腫瘤細(xì)胞中，β-catenin在細(xì)胞核內(nèi)聚集，胞內(nèi)穩(wěn)定的高表達(dá)是發(fā)生EMT的重要條件。相反，抑制β-catenin的表達(dá)則可逆轉(zhuǎn)細(xì)胞的EMT現(xiàn)象［12］。

本研究中采用β-catenin過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞，通過對(duì)相關(guān)蛋白的檢測，發(fā)現(xiàn)高表達(dá)的βcatenin有誘導(dǎo)EMT現(xiàn)象的作用。臭牡丹總黃酮對(duì)A549細(xì)胞的體外增殖具有一定的抑制作用，隨濃度的升高抑制率增大。臭牡丹總黃酮對(duì)β-catenin過表達(dá)組的EMT相關(guān)蛋白具有明顯的調(diào)控作用，有逆轉(zhuǎn)EMT現(xiàn)象的傾向，但在空載組無明顯影響。顯示其抗腫瘤的機(jī)制有可能是通過逆轉(zhuǎn)β-catenin誘導(dǎo)的EMT現(xiàn)象而起作用。

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（本文編輯 楊瑛）

Effect of the Total Flavonoid of Clerodendron bungei Steud on the Epithelial M esenchvmal Transition Related Proteins in A549 Cells

YU Na1，MA Sijing2，ZHU Kejian2*
（1.Hunan University of Chinese medicine，ChangSha，Hunan 410208，China；2.Hunan Academy of Chinese Medicine，Changsha，Hunan 410006，China）

R285.5

A

doi：10.3969/j.issn.1674－070X.2016.05.003

2016-01-25

湖南省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（14JJ4066）。

余娜，女，講師，在讀博士研究生，從事中藥學(xué)教學(xué)與科研工作。

*朱克儉，男，研究員，博士研究生導(dǎo)師，E-mail：zkjo0731@263.net。