鐘　琦，吳慧昊，代軍飛，?！′h*

(1.西北民族大學 生命科學與工程學院，甘肅 蘭州 730030；2.西北民族大學 實驗中心，甘肅 蘭州 730124)

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響應面法優(yōu)化油脂酵母發(fā)酵產(chǎn)油的影響因子

鐘琦1，吳慧昊2，代軍飛1，牛鋒1*

(1.西北民族大學 生命科學與工程學院，甘肅 蘭州 730030；2.西北民族大學 實驗中心，甘肅 蘭州 730124)

微生物油脂作為一種新型油料資源，研究其發(fā)酵條件具有重要意義.以實驗室保存菌株EAM-AC16為出發(fā)菌，通過單因素試驗和響應面法優(yōu)化菌株EAM-AC16的發(fā)酵條件.確定最優(yōu)發(fā)酵條件為：葡萄糖濃度82.37 g/L，接種量9.45%，培養(yǎng)時間為146.4 h，pH6.0，培養(yǎng)溫度30 ℃，空氣量(裝液量mL/三角瓶mL)70mL/250mL和(NH4)2SO4濃度1 g/L時，菌株EAM-AC16的油脂產(chǎn)量達5.204 g/L.利用氣相色譜分析菌株EAM-AC16合成油脂的主要成分為：棕櫚酸(C16:0)、亞油酸(C18:2)、γ-亞麻酸(C18:3)和反油酸(C18:3)等.

油脂酵母;微生物油脂;發(fā)酵條件;氣相色譜

傳統(tǒng)油脂主要從動植物中提取，但因產(chǎn)量不穩(wěn)定、生長周期長且經(jīng)濟成本高等原因，嚴重制約著其大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn).因此，世界各國開始致力于開發(fā)可替代的再生資源.

微生物油脂(microbial oils)，又稱為單細胞油脂 (single cell oil，SCO)，即酵母菌、霉菌、細菌和藻類等油脂微生物在一定培養(yǎng)條件下，利用碳水化合物、碳氫化合物和氨基酸等營養(yǎng)物質(zhì)分別作為碳源和氮源，輔以無機鹽，在菌體內(nèi)產(chǎn)生的大量油脂[1].利用油脂微生物生產(chǎn)油脂的優(yōu)勢[2～4]：①微生物生長周期短、適應性強、代謝旺盛、培養(yǎng)條件和操作簡單.②微生物易于遺傳物質(zhì)的改良，能大幅度提高產(chǎn)量的同時，還能得到符合人類需要的功能性脂肪酸.③微生物可利用農(nóng)副產(chǎn)品、食品加工的廢棄物作為培養(yǎng)基原料，有利于廢棄物的再利用和環(huán)境保護.④微生物油脂生物安全性好，不易被氧化，毒副作用小.⑤微生物生產(chǎn)油脂不受場地和季節(jié)限制，能夠連續(xù)大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn).⑥微生物比高等植物更能有效地積累油脂.⑦利用微生物生產(chǎn)油脂所需的勞動力比動植物生產(chǎn)油脂少.

微生物油脂不僅能作為功能性脂肪酸添加到食品中，具有抗高血壓、抗粥樣動脈硬化、預防心血管和腫瘤的發(fā)生，同時還具有健腦明目和延緩衰老等功能[5～8]，且其主要成分與植物油脂相似，還能作為生物柴油和生物汽油的理想原料[9].因此，微生物油脂作為綠色環(huán)保的新型可再生資源，具有良好的應用前景.

本研究以實驗室保存的油脂酵母菌株為出發(fā)菌，通過優(yōu)化培養(yǎng)條件，進一步提高油脂產(chǎn)量，為該菌株的綜合利用提供參考.

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1菌種

EAM-AC16為粘性絲孢酵母，實驗室保存菌種.

1.1.2培養(yǎng)基

麥氏培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖1，酵母浸粉2.5，醋酸鈉8，氯化鉀1.8，pH自然.

種子培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖20，酵母浸粉10，蛋白胨10，pH自然.

發(fā)酵產(chǎn)脂培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖80，酵母浸粉5，蛋白胨2，磷酸二氫鉀5，硫酸鎂1，pH自然.

1.1.3試劑

葡萄糖、酵母浸粉和蛋白胨為生物試劑；正己烷、氫氧化鉀和甲醇為色譜純；其他試劑均為國產(chǎn)分析純.

1.2方法

1.2.1菌種的活化

將實驗室保存的油脂酵母菌株EAM-AC16接種到麥氏培養(yǎng)基，35 ℃培養(yǎng)36 h，活化待用.

1.2.2菌種的擴大培養(yǎng)

將活化后的菌株以5%的接種量接種至種子培養(yǎng)基，35 ℃，120 r/min培養(yǎng)36 h.

1.2.3影響油脂酵母發(fā)酵產(chǎn)油的單因素試驗

分別考察培養(yǎng)時間、培養(yǎng)溫度、初始pH、接種量、空氣量、葡萄糖濃度和硫酸銨濃度對油脂酵母的生物量和油脂產(chǎn)量的影響.

1.2.4響應面法優(yōu)化培養(yǎng)條件

從單因素中選取對生物量和油脂產(chǎn)量影響較大的因素，進行響應面法優(yōu)化試驗.

1.3分析方法

1.3.1生物量的測定

采用干重法測定生物量[10].

1.3.2油脂提取及脂肪酸成分分析

采用索氏抽提法提取菌體內(nèi)的油脂[11].參照文獻方法[12]，油脂進行堿法甲酯化后進氣相色譜分析.

1.3.3數(shù)據(jù)處理與分析

每組試驗設置3次重復，用EXCEL、SPSS和Design-Expect軟件對數(shù)據(jù)進行分析.

2　結(jié)果與分析

2.1生長曲線

酵母菌的生長一般會經(jīng)過4個時期，即遲緩期、對數(shù)生長期、穩(wěn)定期和衰亡期.由圖1所示，0～8 h時，菌株EAM-AC16剛接種到發(fā)酵產(chǎn)脂培養(yǎng)基，需要適應新培養(yǎng)基，如果菌體數(shù)量維持恒定，說明細胞正處于遲緩期.8～60 h時，菌體濃度急劇增加，說明菌株EAM-AC16處于對數(shù)生長期.到60 h后，細胞生長減慢，逐漸進入穩(wěn)定期，此時油脂開始大量積累.在180 h時進入衰亡期，菌體逐漸衰亡.選擇合適的接種時間，可以保證種子液的濃度和活性，因此確定菌株EAM-AC16在種子培養(yǎng)基中的發(fā)酵周期為36 h.

圖1　菌株EAM-AC16的生長曲線

2.2發(fā)酵條件優(yōu)化——單因素試驗

2.2.1培養(yǎng)時間對菌株EAM-AC16產(chǎn)油的影響

圖2培養(yǎng)時間對菌株EAM-AC16發(fā)酵結(jié)果的影響

培養(yǎng)時間對菌株EAM-AC16生物量和油脂產(chǎn)量的影響較大(圖2).培養(yǎng)時間從96 h增加到144 h.隨著培養(yǎng)時間的增加，其生物量和油脂產(chǎn)量顯著增加(P<0.05).在培養(yǎng)時間為144 h時，生物量和油脂產(chǎn)量均達到最大值；培養(yǎng)時間超過144 h時，生物量和油脂產(chǎn)量隨培養(yǎng)時間增加而顯著下降.因此，菌株EAM-AC16的最佳培養(yǎng)時間為144 h.

2.2.2培養(yǎng)溫度對菌株EAM-AC16產(chǎn)油的影響

圖3培養(yǎng)溫度對菌株EAM-AC16發(fā)酵結(jié)果的影響

溫度通過酶的活性影響微生物的生長和油脂積累[13～14].不同培養(yǎng)溫度對菌株EAM-AC16生物量和油脂產(chǎn)量的影響較大(圖3).隨著溫度增加，生物量和油脂產(chǎn)量呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢.在30 ℃，EAM-AC16生物量和油脂產(chǎn)量顯著高于其他處理水平(P<0.05).因此，選擇30 ℃作為菌株EAM-AC16生長和油脂積累的最適溫度.

2.2.3初始pH對菌株EAM-AC16產(chǎn)油的影響

圖4pH對菌株EAM-AC16發(fā)酵結(jié)果的影響

初始pH通過改變酶的活性、細胞質(zhì)膜通透性、膜結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和物質(zhì)溶解性等方面來影響微生物的生長和油脂積累[15].初始pH對生物量和油脂產(chǎn)量的影響較大(圖4).pH從5.22增加到6.0時，生物量和油脂產(chǎn)量沒有顯著變化.在pH大于6.0時，生物量和油脂產(chǎn)量均顯著下降(P<0.05).說明菌株EAM-AC16適合在pH6.0的弱酸性培養(yǎng)基中生長和合成油脂.

2.2.4接種量對菌株EAM-AC16產(chǎn)油的影響

圖5接種量對菌株EAM-AC16發(fā)酵結(jié)果的影響

接種量過少，遲緩期較長；接種量過高，種內(nèi)競爭增加，因此，合適的接種量有利于油脂合成[16].隨著接種量的增加，菌株EAM-AC16的生物量呈現(xiàn)上升趨勢，而油脂產(chǎn)量呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢(圖5).當接種量為10%時，其生物量相對低于接種量為20%的生物量，但油脂產(chǎn)量遠高于接種量為20%的油脂產(chǎn)量.綜合考慮，確定菌株EAM-AC16的最佳接種量為10%.

2.2.5空氣量(裝液量mL/三角瓶mL)對菌株EAM-AC16產(chǎn)油的影響

圖6空氣量對菌株EAM-AC16發(fā)酵結(jié)果的影響

酵母菌利用糖類生長和合成油脂的過程是好氧發(fā)酵[17]，且酵母菌厭氧發(fā)酵產(chǎn)物對細胞生長具有一定毒害作用[18]，因此選擇合適的空氣量對油脂酵母的生長和油脂合成具有重要的作用.空氣量對菌株EAM-AC16生物量的影響較大，而對油脂產(chǎn)量的影響不明顯(圖6).當空氣量為70mL/250mL時，其生物量和油脂產(chǎn)量與空氣量為70mL/300mL相比，差異不顯著(P>0.05)，但隨著空氣量的減少，其生物量和油脂產(chǎn)量均呈下降趨勢.綜合考慮，選擇空氣量70mL/250mL作為EAM-AC16生長和發(fā)酵的最佳空氣量.

2.2.6葡萄糖濃度對菌株EAM-AC16產(chǎn)油的影響

圖7葡萄糖濃度對EAM-AC16發(fā)酵結(jié)果的影響

碳源不僅為微生物生長提供碳源，維持滲透壓，而且還可以為合成油脂提供碳骨架[19].葡萄糖濃度對生物量和油脂產(chǎn)量的影響較顯著(圖7).隨著葡萄糖濃度的增加，生物量和油脂產(chǎn)量逐漸增加，葡萄糖濃度80 g/L時，生物量和油脂產(chǎn)量顯著大于其他水平(P<0.05)；葡萄糖濃度超過80 g/L時，其生物量和油脂產(chǎn)量都顯著下降.因此，菌株EAM-AC16生長和油脂積累的最適葡萄糖濃度為80 g/L.

2.2.7 (NH4)2SO4對菌株EAM-AC16產(chǎn)油的影響

圖8(NH4)2SO4濃度對菌株NU-Y004-2發(fā)酵結(jié)果的影響

無機氮源能促進菌體增殖[20]，且合適的C/N比更有利于油脂酵母的生長和油脂積累[21].(NH4)2SO4濃度對菌株EAM-AC16生物量和油脂產(chǎn)量均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(圖8).當(NH4)2SO4濃度為1 g/L時，生物量和油脂產(chǎn)量均顯著高于其他處理水平(P<0.05).因此，在培養(yǎng)基中添加1 g/L的(NH4)2SO4為菌株生長和油脂積累的最適無機氮源.

2.3發(fā)酵條件優(yōu)化——響應面試驗

2.3.1試驗設計及結(jié)果

表1試驗設計因素及水平

表2　響應面分析方案及結(jié)果

在單因素試驗中，碳源、接種量和發(fā)酵時間對生物量和油脂產(chǎn)量的影響較顯著，因此，采用Design-Expert8.0軟件設計Box-Behnken試驗，考察葡萄糖濃度、接種量和發(fā)酵時間對菌株EAM-AC16發(fā)酵產(chǎn)油的影響.以這3個因素作為變量，每個變量按低、中、高3個水平分別以-1、0、1進行編碼，試驗因素及水平表見表1.以A、B、C為自變量，油脂產(chǎn)量(g/L)作為響應值，分析方案及結(jié)果見表2.

利用Design-Expert 8.0軟件，對表2的試驗結(jié)果進行響應面回歸分析，獲得油脂產(chǎn)量R對自變量葡萄糖濃度(A)、接種量(B)、發(fā)酵時間(C)多元二次擬合回歸方程，其方程為：Y=5.20+0.14A-0.11B+0.017C+0.074AB-0.053AC-0.021BC-0.56A2-0.45B2-0.39C2.方程中的系數(shù)具有正值和負值，說明存在極大點，且響應面最高點對應等高線的最小橢圓的中心點為極值點.

對該模型進行方差分析的結(jié)果見表3，其中A、B、C、A2、B2和C2呈極顯著影響(P<0.01)，AB呈顯著影響(P<0.05)，AC和BC為不顯著影響.失擬項α=0.05水平上不顯著，殘差由隨機誤差引起.模型的F檢驗為極顯著(P<0.01).說明該擬合方程與實際情況相符合，模型顯著，具有實際意義.該模型的決定系數(shù)R2為0.992 2，變異系數(shù)為1.36%，由此可以確定該模型的精確性和可信性.因此，該模型可以用于分析和預測UN-Y004-2的發(fā)酵條件.

表3方差分析

2.3.2三維圖和等高線圖

根據(jù)回歸方程，用Design-Expert8.0軟件做出擬合三維圖，考察三維圖的形狀.三維圖和等高線的顏色和形狀變化能夠反映兩個因素之間的交互作用，即等高線的形狀如果為橢圓形表示交互作用顯著，圓形則表示交互作用不顯著.顏色對比越強烈，交互作用越顯著[22].由圖9、10和11可知，葡萄糖濃度和接種量、葡萄糖濃度和培養(yǎng)時間以及接種量和培養(yǎng)時間之間的交互作用顯著.

圖9　(A) 葡萄糖濃度和接種量的三維圖　　　　　　圖9　(B) 葡萄糖濃度和接種量的等高線圖

圖10　(A) 葡萄糖濃度和培養(yǎng)時間的三維圖　　　　圖10　(B) 葡萄糖濃度和培養(yǎng)時間的等高線圖

圖11　(A) 接種量和培養(yǎng)時間的三維圖　　　　　　　圖11　(B)接種量和培養(yǎng)時間的等高線圖

2.3.3試驗結(jié)果的驗證

利用響應面法得出最優(yōu)發(fā)酵工藝參數(shù)為：在葡萄糖濃度82.37 g/L，接種量9.45%，培養(yǎng)時間為146.4 h，pH6.0，培養(yǎng)溫度為30 ℃，空氣量為70mL/250mL和(NH4)2SO4濃度為1 g/L時，預測油脂產(chǎn)量為5.219 39 g/L.

采用上述最佳發(fā)酵工藝參數(shù)驗證響應面分析的可靠性，經(jīng)過3次平行試驗，得到實際油脂產(chǎn)量為5.204 g/L.說明響應面法提供的模型較真實地擬合了實際情況，可以用于菌株EAM-AC16發(fā)酵條件的預測.

2.4氣相色譜分析

利用索氏抽提法提取菌株EAM-AC16的油脂，氣相色譜結(jié)果如圖12所示.結(jié)果顯示菌株EAM-AC16油脂的主要成分為棕櫚酸(C16:0)、亞油酸(C18:2)、γ-亞麻酸(C18:3)和反油酸(C18:3).

注：1-棕櫚酸甲酯；2-亞油酸甲酯；3-γ-亞麻酸甲酯；4-反油酸甲酯.

圖12以葡萄糖為碳源的微生物油脂的脂肪酸甲酯氣相色譜

3　結(jié)論

通過單因素試驗，確定較優(yōu)的培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)時間144 h、培養(yǎng)溫度30 ℃、初始pH6.0、接種量為10%、空氣量(裝液量mL/三角瓶mL)為70mL/250mL、葡萄糖濃度80 g/L和(NH4)2SO4濃度1 g/L.選取影響較大的影響因子，即葡萄糖濃度、接種量和發(fā)酵時間為自變量，利用響應面法確定最優(yōu)發(fā)酵條件為：葡萄糖濃度82.37 g/L，接種量9.45%，培養(yǎng)時間146.4 h，培養(yǎng)溫度為30 ℃，初始pH6.0，空氣量70mL/250mL 和(NH4)2SO4濃度1 g/L時，菌株EAM-AC16的油脂產(chǎn)量達5.204 g/L.氣相色譜結(jié)果顯示菌株EAM-AC16脂肪酸的主要成分為：棕櫚酸(C16:0)、亞油酸(C18:2)、γ-亞麻酸(C18:3)和反油酸(C18:3)等.

在后續(xù)的研究中，可以建立簡單高效的微生物油脂提取技術和高效的下游分離技術，以實現(xiàn)工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn).同時，在發(fā)酵工藝學方面，可以嘗試補料分批發(fā)酵、連續(xù)發(fā)酵等工藝方法，進一步提高油脂產(chǎn)量、縮短發(fā)酵時間和節(jié)約成本.

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2016-05-10

西北民族大學研究生科研(實踐)創(chuàng)新項目(Ymx2014180).

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鐘琦(1990—)，女(白族)，湖南桑植縣人，碩士研究生，主要從事油脂微生物方面的研究.

TQ641

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1009-2102(2016)02-0057-08