趙倩倩，杜廣慶，陳麗杰，薛闖，白鳳武

（大連理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧 大連 116023）

嚴(yán)格厭氧發(fā)酵體系在線尾氣監(jiān)測系統(tǒng)的設(shè)計(jì)及在梭菌生產(chǎn)生物能源丁醇的應(yīng)用

趙倩倩，杜廣慶，陳麗杰，薛闖，白鳳武

（大連理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧 大連 116023）

目前關(guān)于有氧或微氧的乙醇發(fā)酵的尾氣檢測系統(tǒng)已經(jīng)建立，但是對于丙酮丁醇梭菌等嚴(yán)格厭氧菌發(fā)酵尾氣的在線監(jiān)測鮮見文獻(xiàn)報(bào)道。因此，本研究以丙酮丁醇梭菌生產(chǎn)丁醇的嚴(yán)格厭氧發(fā)酵體系為研究對象，研究了傳統(tǒng)有氧或微氧尾氣檢測方法在丙酮丁醇梭菌厭氧發(fā)酵體系中的檢測結(jié)果，設(shè)計(jì)并建立了適合厭氧菌發(fā)酵的尾氣在線監(jiān)測系統(tǒng)，對丙酮丁醇梭菌的發(fā)酵過程實(shí)時(shí)監(jiān)測。在建立有效的厭氧發(fā)酵尾氣分析系統(tǒng)的條件下，比較了丙酮丁醇梭菌在游離細(xì)胞條件下和高細(xì)胞密度條件下的發(fā)酵性能。相比較于游離發(fā)酵，高細(xì)胞密度發(fā)酵的發(fā)酵周期明顯縮短，丁醇生產(chǎn)強(qiáng)度顯著提高。丁醇最高產(chǎn)量為15.4g/L，生產(chǎn)強(qiáng)度0.64g/（L·h），分別比對照組提高了12.4%和106%，CO2和H2最高產(chǎn)氣速率分別提高60%和9%，產(chǎn)氣量分別提高了20.7%和41.3%。尾氣分析系統(tǒng)采集的氣體數(shù)據(jù)為丙酮丁醇梭菌的代謝分析提供了重要依據(jù)。

尾氣在線監(jiān)測；厭氧發(fā)酵；高密度細(xì)胞發(fā)酵；丁醇；生物燃料

近幾年來，國內(nèi)的原油生產(chǎn)量已經(jīng)跟不上國家經(jīng)濟(jì)飛速發(fā)展的步伐，尋找石油燃料的可替代燃料成為一項(xiàng)緊迫的任務(wù)［1］。丁醇，不僅是一種重要有機(jī)化工原料，同時(shí)又是具有極大潛力的新型生物燃料［2］。與乙醇相比，生物丁醇具有高燃燒值、高辛烷值、方便運(yùn)輸、水溶性低、無需改造發(fā)動(dòng)機(jī)、與汽油配伍性能好等優(yōu)點(diǎn)，面對日益嚴(yán)峻的環(huán)境和石油資源緊缺問題，用生物丁醇作為燃料逐漸取代石油成為國際學(xué)術(shù)界和工業(yè)界的研究熱點(diǎn)［3-4］。

發(fā)酵生產(chǎn)丁醇的常用菌種為丙酮丁醇梭菌（Clostridium acetobutylicum），是一株嚴(yán)格厭氧菌。除了產(chǎn)溶劑之外，也同時(shí)代謝產(chǎn)生CO2和H2［5］。在丙酮丁醇梭菌的代謝過程中，CO2與發(fā)酵狀態(tài)及菌體生長情況相關(guān)［6］，H2與菌體發(fā)酵代謝過程中NADH的生成和鐵氧化還原蛋白密切相關(guān)［7-8］，因此對發(fā)酵尾氣進(jìn)行實(shí)時(shí)定量檢測對了解丙酮丁醇梭菌的代謝過程，以及進(jìn)一步利用過程工程和代謝工程手段對丙酮丁醇梭菌生產(chǎn)進(jìn)行調(diào)控和菌株改造有重要的指導(dǎo)意義。

目前關(guān)于有氧或微氧的乙醇發(fā)酵的尾氣檢測系統(tǒng)已經(jīng)建立，例如作者課題組建立了應(yīng)用于自絮凝酵母乙醇發(fā)酵體系的在線顆粒尺度和尾氣 CO2檢測，并用于代謝通量分析（metabolic flux analysis）中［9］，但是這些適用于有氧或微氧體系的在線尾氣方法是否也適用于嚴(yán)格厭氧發(fā)酵體系不得而知。對于丙酮丁醇梭菌等嚴(yán)格厭氧菌發(fā)酵尾氣的在線監(jiān)測鮮見文獻(xiàn)報(bào)道。因此，本研究以丙酮丁醇梭菌生產(chǎn)丁醇的嚴(yán)格厭氧發(fā)酵體系為研究對象，研究了傳統(tǒng)有氧或微氧尾氣檢測方法在丙酮丁醇梭菌厭氧發(fā)酵體系中的檢測結(jié)果，設(shè)計(jì)并建立了適合厭氧菌發(fā)酵的尾氣在線監(jiān)測系統(tǒng)，對丙酮丁醇梭菌的發(fā)酵過程實(shí)時(shí)監(jiān)測。并且在梭菌游離細(xì)胞和固定化高密度發(fā)酵體系進(jìn)一步比較了厭氧尾氣在線監(jiān)測分析方法，結(jié)合丙酮丁醇梭菌生產(chǎn)丁醇的發(fā)酵性能分析，闡明了發(fā)酵過程液體和氣體代謝產(chǎn)物的變化過程。該研究對于深入研究丙酮丁醇梭菌厭氧發(fā)酵過程機(jī)理，優(yōu)化、控制發(fā)酵過程，以及提高溶劑產(chǎn)量具有重要的意義。

1 實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1 菌種

本實(shí)驗(yàn)室-80℃冰箱保存的丙酮丁醇梭菌（Clostridium acetobutylicum ATCC 55025）。

1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基：20g/L葡萄糖，4g/L酵母粉，2g/L胰蛋白胨，微量元素和維生素參照文獻(xiàn)［4］。

發(fā)酵培養(yǎng)基：80g/L葡萄糖，1g/L酵母粉，0.5g/L KH2PO4，0.5g/L K2HPO4，2.2g/L乙酸銨，維生素（1mg/L對氨基苯甲酸，1mg/L維生素 B1和0.01mg/L維生素H），礦物鹽類（0.01g/L MnSO4·H2O，0.2g/L MgSO4·7H2O，0.01g/L NaCl ，0.01g/L FeSO4·7H2O）。

種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基均在 121℃、15min滅菌前通20min氮?dú)獬酢?/p>

1.3 尾氣分析系統(tǒng)

多組分尾氣分析儀是由西安智琦公司生產(chǎn)，用于檢測 ABE發(fā)酵產(chǎn)生的尾氣。尾氣分析儀包括IRME-M型紅外線氣體分析儀、電化學(xué)氧分析儀和HYME-G型氫分析儀，可分別檢測CO2、O2和H2。尾氣分析儀內(nèi)有可對氣體進(jìn)行干燥過濾的裝置（硅膠顆粒填充），可以去除氣體中的雜質(zhì)和水蒸氣。氣體總流量由氣體流量計(jì)（CS200，七星華創(chuàng)電子，北京）測定。CO2、H2、O2氣體濃度數(shù)據(jù)使用組態(tài)王6.55軟件記錄監(jiān)測。3種氣體產(chǎn)氣速率和氣體總量計(jì)算方法一樣，以CO2為例。

式中，VCO2-n表示第n小時(shí)CO2產(chǎn)氣速率。n=1時(shí)，C1表示第10min的氣體濃度，V1表示前10min的氣體體積。

1.4 丙酮丁醇梭菌發(fā)酵

游離批次發(fā)酵：將100mL的種子加入到1.4L發(fā)酵培養(yǎng)基中，在37℃和150r/min下進(jìn)行發(fā)酵。通過自動(dòng)添加氨水（25%）維持pH在5.0以上。

高細(xì)胞密度固定化發(fā)酵：纖維床反應(yīng)器（FBB）由采用50mm×400mm，體積250mL的玻璃柱，和內(nèi)置鋼絲固定的棉毛巾組成。將100mL的種子 培養(yǎng)基加入到1.4L發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃，150r/min，pH通過自動(dòng)添加氨水維持在5.0以上。發(fā)酵進(jìn)行到大約24h即菌體OD值為4.3時(shí)，通過蠕動(dòng)泵將罐內(nèi)的液體循環(huán)加到纖維床反應(yīng)器上，使菌體固定到纖維床反應(yīng)器上。發(fā)酵后的廢液用蠕動(dòng)泵抽離，加入新鮮的發(fā)酵培養(yǎng)基開始下一輪批次發(fā)酵。

1.5 分析方法

菌體OD值采用酶標(biāo)儀（Thermo Spectronic，美國）620nm下檢測。

葡萄糖濃度通過生物傳感器（SBA-50，科學(xué)院生物研究所，山東）檢測。

產(chǎn)物溶劑濃度用氣相色譜Agilent 6890A GC測定。色譜條件為：毛細(xì)管色譜柱 HP-INNOWAX（30m×0.25mm×0.50μm），柱溫 100℃，進(jìn)樣溫度250℃；FID檢測器溫度300℃；H2流速40mL/min，空氣流速400mL/min，N2流速30mL/min；進(jìn)樣量為0.1μL；分流比為50∶1。用異丁醇作為內(nèi)標(biāo)物進(jìn)行定量。

乙酸和丁酸使用Waters 1525高效液相色譜測定。色譜分離條件：Aminex HPX-87H 有機(jī)酸分析柱（30cm×7.8mm；Bio-Rad，Hercules），柱溫50℃，檢測波長為 210nm，進(jìn)樣量為 20μL。流動(dòng)相為50mmol/L的H2SO4，流速為0.5mL/min。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1 丙酮丁醇厭氧發(fā)酵尾氣監(jiān)測系統(tǒng)的設(shè)計(jì)

有氧發(fā)酵的尾氣在線分析系統(tǒng)相當(dāng)于內(nèi)嵌式（in situ）氣體檢測系統(tǒng)，裝置圖如圖1所示。由尾氣分析儀內(nèi)部的泵提供循環(huán)動(dòng)力，將發(fā)酵罐、尾氣分析儀和進(jìn)出氣管組成一個(gè)循環(huán)回路。同時(shí)發(fā)酵產(chǎn)生的尾氣通過自然排出發(fā)酵罐后由氣體流量計(jì)測定。該裝置已經(jīng)成功應(yīng)用于自絮凝酵母乙醇發(fā)酵體系的尾氣在線監(jiān)測中。

圖1 有氧或微氧發(fā)酵尾氣在線監(jiān)測裝置圖

圖2 有氧或微氧發(fā)酵尾氣在線體系監(jiān)測丙酮丁醇梭菌游離發(fā)酵氣體圖

采用圖1裝置進(jìn)行丙酮丁醇梭菌厭氧游離發(fā)酵實(shí)驗(yàn)和尾氣在線監(jiān)測，所得氣體分析數(shù)據(jù)如圖2所示。圖2（a），發(fā)酵初期0～10h，氧氣體積分?jǐn)?shù)逐漸上升，第 3h時(shí)，氧氣體積分?jǐn)?shù)為 3%。發(fā)酵中期氧體積分?jǐn)?shù)最低只有0.08%，但發(fā)酵末期30h之后，氧氣體積分?jǐn)?shù)高達(dá)20%。圖2（c）中，氧氣體積升至123.7mL。分析原因主要有：發(fā)酵初期和發(fā)酵末期產(chǎn)氣量小，罐內(nèi)氣壓小，尾氣分析儀和發(fā)酵罐組成的循環(huán)回路中的氣體循環(huán)速率為28.5L/h，遠(yuǎn)大于菌體自產(chǎn)氣體速率［圖 2（b）］，氣體循環(huán)的影響造成了發(fā)酵初期和末期的氧氣含量上升。發(fā)酵中期 10～30h，CO2和H2的產(chǎn)氣速率逐漸增大，產(chǎn)氣速率峰值分別為1.13L/（L·h）和0.46L/（L·h），遠(yuǎn)大于氣泵的氣體循環(huán)速率，氣體循環(huán)雖然在此時(shí)期受干擾可能性小，但對于厭氧菌的整體發(fā)酵有較大影響。

為了避免由于氣體循環(huán)導(dǎo)致的尾氣檢測系統(tǒng)進(jìn)氧氣干擾厭氧發(fā)酵過程，設(shè)計(jì)監(jiān)測裝置，如圖3。在尾氣分析儀和發(fā)酵罐之間連接錐形瓶 1，從發(fā)酵罐中排出的尾氣通過冷凝管排入錐形瓶1后，氣體會在尾氣分析儀和錐形瓶1中形成回路，用于分析尾氣的濃度。同時(shí)，錐形瓶2與氣體流量計(jì)連接，氣體從錐形瓶1排出后會進(jìn)入錐形瓶2，再被氣體流量計(jì)測量，記錄發(fā)酵過程的氣體流速和氣體總量。錐形瓶1和錐形瓶2均液封，防止氣體回流，從而確保發(fā)酵過程不受外界空氣干擾。

采用圖3裝置進(jìn)行丙酮丁醇梭菌厭氧游離發(fā)酵和尾氣在線監(jiān)測，所得氣體分析數(shù)據(jù)如圖4所示。圖4（a），發(fā)酵初期氧氣濃度最高僅為2%，發(fā)酵終點(diǎn)，氧氣體積分?jǐn)?shù)僅為 0.35%。圖 4（c），最終進(jìn)氧量僅為5.9mL，小于圖1裝置的進(jìn)氧量123.7mL，說明裝置的氣密性得到很大改善。改良前裝置發(fā)酵總產(chǎn)氣量為21.0L，H2為7.4L，CO2為12.5L［圖2（c）］，改良后裝置發(fā)酵總產(chǎn)氣量為 34.9L，H2為 13.9L，CO2為19.3L［圖4（c）］，改良之后的裝置總產(chǎn)氣量、CO2產(chǎn)氣量和H2產(chǎn)氣量分別提高 66.2%、87.8%、54.4%，也可以從側(cè)面說明裝置氣密性得到完善，可以用于厭氧菌的發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。

圖3 厭氧發(fā)酵尾氣在線監(jiān)測裝置圖

圖4 厭氧發(fā)酵尾氣在線體系監(jiān)測丙酮丁醇梭菌游離發(fā)酵氣體圖

2.2 高細(xì)胞密度條件下的在線尾氣分析

通過纖維床反應(yīng)器固定化富集細(xì)胞，同時(shí)對發(fā)酵過程中產(chǎn)生的尾氣進(jìn)行在線監(jiān)測。所得氣體數(shù)據(jù)如圖5所示。通過比較圖5（a）和圖4（a）可以看到，氣體濃度趨勢均為 H2先增加后降低、CO2后增加。從圖5（b）得知，H2產(chǎn)氣速率在第8h達(dá)到峰值1.42L/（L·h），CO2產(chǎn)氣速率在第15h時(shí)最高，1.61L/（L·h），從圖4（b）中可以看出，H2的產(chǎn)氣速率最高為0.89L/（L·h），CO2的最高產(chǎn)氣速率可以達(dá)到1.47L/（L·h），相比較于游離發(fā)酵的產(chǎn)氣速率，高細(xì)胞密度條件下的H2和CO2的產(chǎn)氣速率分別提高了60%和9%。圖5（c）中可以看到CO2產(chǎn)氣量23.3L，H2產(chǎn)氣量 19.5L，相比較游離發(fā)酵 CO2產(chǎn)氣量19.3L，H2產(chǎn)氣量13.8L，分別提高了20.7%和41.3%。高細(xì)胞密度條件下的發(fā)酵，H2和CO2的產(chǎn)氣速率和產(chǎn)氣量均有提高。H2的產(chǎn)生和梭菌代謝過程中的NADH和鐵氧還蛋白密切相關(guān)，通過尾氣在線監(jiān)測，量化氣體生成，為高密度條件下細(xì)胞代謝分析提供準(zhǔn)確的氣體數(shù)據(jù)。高細(xì)胞密度條件下丙酮丁醇梭菌的厭氧發(fā)酵需要在細(xì)胞密度最大時(shí)富集細(xì)胞，由于菌體生長和CO2相偶聯(lián)，可以在線通過CO2的濃度含量判斷富集細(xì)胞的時(shí)間點(diǎn)。

圖5 厭氧發(fā)酵尾氣在線體系監(jiān)測丙酮丁醇梭菌高密度細(xì)胞發(fā)酵氣體圖

2.3 游離細(xì)胞和高細(xì)胞密度條件下的丙酮丁醇梭菌的發(fā)酵性能比較

高密度條件下丙酮丁醇梭菌發(fā)酵是纖維床反應(yīng)器和發(fā)酵罐之間循環(huán)發(fā)酵，在細(xì)胞密度最大第23h、第37h時(shí)，通過兩次更換新鮮培養(yǎng)基使細(xì)胞保持較高活性，具體發(fā)酵過程如圖6（b）。

對照組是游離批次發(fā)酵，由圖6（a）得知，發(fā)酵周期44h，丁醇13.7g/L，丙酮5.6g/L，乙醇2.0g/L，計(jì)算得到丁醇得率0.18g/g，丁醇產(chǎn)率0.31g/（L·h）。高密度條件下的發(fā)酵結(jié)果由圖6（b）可知，F(xiàn)BB發(fā)酵周期24h，丁醇15.4g/L，丙酮7.3g/L，乙醇2.4g/L，計(jì)算得到丁醇得率0.2g/g，丁醇產(chǎn)率0.64g/（L·h）。

高細(xì)胞密度條件下發(fā)酵與對照組相比，丁醇產(chǎn)量提高12.4%、得率提高11.1%，生產(chǎn)強(qiáng)度提高了一倍多，發(fā)酵周期從44h縮短到24h，主要原因是固定化可以提高細(xì)胞密度，同時(shí)延長細(xì)胞存活時(shí)間，提高細(xì)胞溶劑耐性［10-11］。

2.4 氣體分析和菌體代謝

丙酮丁醇梭菌的代謝特點(diǎn)是兩階段代謝發(fā)酵，包括產(chǎn)酸期和產(chǎn)溶劑期。產(chǎn)酸期丙酮丁醇梭菌代謝產(chǎn)乙酸、丁酸，同時(shí)并伴隨著大量的氫氣和二氧化碳產(chǎn)生。產(chǎn)溶劑期，產(chǎn)酸期產(chǎn)生的乙酸和丁酸重吸收，生成乙醇和丁醇［12］。

二氧化碳的變化，反映了發(fā)酵過程中丙酮丁醇梭菌的代謝狀態(tài)，因此CO2濃度可作為衡量發(fā)酵水平的重要指標(biāo)［13］。從圖6（a）中可以看出，OD值從0～20h逐漸增長，圖4（b）的CO2的產(chǎn)氣速率從0～20h逐漸遞增，兩者變化規(guī)律趨近，CO2產(chǎn)氣速率越大，菌體生長力越旺盛，這和劉仲匯、姜長江等［14-15］的研究相符，可以通過檢測CO2的生成跟蹤丙酮丁醇梭菌的生長情況。

圖6 丙酮丁醇梭菌發(fā)酵生長動(dòng)力學(xué)

高密度條件下的發(fā)酵，生物量提高，菌體的整體代謝能力提高，因此，CO2和H2產(chǎn)氣量分別提高了20.7%和41.3%。H2比率提高了3.8%，但是乙醇和丁醇的比例降低了2.8%，可能是因?yàn)镠2生成和NADH的生成有關(guān)，菌體代謝過程中電子流過多的流向H2，會造成NADH的減少。生成醇需要醛脫氫酶和醇脫氫酶，也需要NADH，當(dāng)NADH減少，乙醇和丁醇的比例就會減少［16-18］。

3 結(jié) 論

（1）設(shè)計(jì)了一種適用于厭氧菌丙酮丁醇梭菌發(fā)酵的尾氣在線監(jiān)測系統(tǒng)。

（2）高細(xì)胞密度條件下，丙酮丁醇梭菌的發(fā)酵性能有所提高，發(fā)酵周期明顯縮短，丁醇最高產(chǎn)量為15.4g/L，生產(chǎn)強(qiáng)度0.64g/（L·h），分別較對照組提高了12.4%和106%，CO2和H2最高產(chǎn)氣速率分別提高60%和9%，產(chǎn)氣量分別提高20.7%和41.3%。

（3）通過尾氣在線監(jiān)測系統(tǒng)實(shí)時(shí)監(jiān)測厭氧發(fā)酵過程，獲得的氣體數(shù)據(jù)為丙酮丁醇梭菌的代謝分析提供了準(zhǔn)確的依據(jù)。

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The design of online off-gas analysis for anaerobic fermentation and its application in biobutanol production by Clostridium as advanced biofuels

ZHAO Qianqian，DU Guangqing，CHEN Lijie，XUE Chuang，BAI Fengwu
（School of Life Science and Biotechnology，Dalian University of Technology，Dalian 116023，Liaoning，China）

Currently，an online off-gas analysis for aerobic or micro-aerobic ethanol fermentation has been established，but the online off-gas analysis for Clostridium acetobutylicum and other strict anaerobic fermentation are rarely reported. Therefore，the study on anaerobic fermentation system is based on an online off-gas analysis for aerobic or micro-aerobic ethanol fermentation，and we take a strictly anaerobic fermentation system of C. acetobutylicum which produces butanol as our research target. Then we get a detection result for the C. acetobutylicum fermentation system by traditional aerobic or micro oxygen gas. Then a design of online off-gas analysis for anaerobic fermentation can be confirmed. Using the online off-gas analysis，the fermentation performance of C.acetobutylicum under the condition of high cell density was investigated. Compared with the batch fermentation，the fermentation time was shortened，and thus butanol productivity was markedly increased. C.acetobutylicum produced 15.40g/L butanol with a productivity of 0.64g/（L·h） when grown in high cell density. Meanwhile，the butanol production and the productivity were 12.4% and 106%，respectively，higher than those of the control. CO2and H2maximum gas rate increased by 60% and 9% respectively，while gas production increased by 20.7% and 41.3%，respectively，while gas data from online off-gas analysis provides an important basis for metabolic analysis of C.acetobutylicum.

online off-gas analysis；anaerobic fermentation；high cell density fermentation；butanol；biofuel；

TQ 923

A

1000-6613（2016）10-3295-06

10.16085/j.issn.1000-6613.2016.10.039

2016-03-15；修改稿日期：2016-06-01。

國家自然科學(xué)基金（21576045， 21306020）及遼寧省博士科研啟動(dòng)基金（20141197）項(xiàng)目。

趙倩倩（1990—），女，碩士研究生。E-mail 519241612@qq.com。聯(lián)系人：薛闖，副教授，主要從事生物能源方面研究。E-mail xue.1@dlut.edu.cn。