蔣益群　　王珊珊　　徐志鵬　　張寧媛　　孫海翔

南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，江蘇南京　210008

商品化培養(yǎng)液對人類胚胎發(fā)育及妊娠結(jié)局的影響

蔣益群王珊珊徐志鵬張寧媛孫海翔▲

南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，江蘇南京210008

目的 比較兩種商品化序貫培養(yǎng)液Cook和Vitrolife對人類胚胎發(fā)育潛能及妊娠結(jié)局的影響。方法 回顧性分析2014年8月～2015年5月于南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心行體外受精（IVF）或卵胞漿內(nèi)單精子注射（ICSI）的398例患者的臨床資料。根據(jù)受精方式與胚胎培養(yǎng)液不同進(jìn)行分組，IVF周期分為Cook組（n= 103例）和Vitrolife組（n=196例），ICSI周期分為Cook組（n=40例）和Vitrolife組（n=59例）。比較同一受精方式下兩種培養(yǎng)液組的受精率、正常受精率、卵裂率、可利用胚胎率、囊胚形成率、可利用囊胚率、臨床妊娠率、胚胎種植率和早期流產(chǎn)率。結(jié)果 IVF和ICSI周期中，Cook組受精后第3天可利用胚胎率均顯著低于Vitrolife組（31.22%比40.61%，33.43%比42.34%，P＜0.05），而可利用囊胚率均顯著高于Vitrolife組 （55.42%比37.82%，46.39%比30.58%，P＜0.05）。受精后第3天胚胎發(fā)育速度方面，Cook組5～7個(gè)細(xì)胞的胚胎所占比例顯著高于Vitrolife組（34.32%比24.23%，P＜0.05），而Vitrolife組8～10個(gè)細(xì)胞的胚胎所占比例顯著高于Cook組（52.22%比42.07%，P＜0.05）。結(jié)論Vitrolife培養(yǎng)液和Cook培養(yǎng)液對妊娠結(jié)局并無顯著影響，但Cook培養(yǎng)液可能更有利于囊胚階段的發(fā)育。

胚胎；培養(yǎng)液；培養(yǎng)發(fā)育；妊娠結(jié)局

［Abstract］Objective To compare the influence of two commercially sequentialmedia Cook and Vitrolife on development potential of human embryos and the clinical pregnancy outcome.M ethods Clinical data of 398 patients conceived through IVF or ICSI from August 2014 to May 2015 in the Reproductive Medicine Center of the Affiliated Drum Tower Hospital of Nanjing University Medical Schoolwere retrospectively analyzed，and according to fertilizationmethods and embryo culturemedia they were divided into Cook group（103 cases）and Vitrolife group（196 cases）in IVF；while Cook group（40 cases）and Vitrolife group（59 cases）in ICSI.In the same fertilizationmode，the rate of fertilization，normal fertilization，cleavage，avaiable embryo，blastocyst formation，avaiable blastocyst，clinical pregnancy，embryo implantation and early abortion in the Vitrolife group and Cook group were compared.Results In IVF and ICSI cycles，the available embryo rate of the 3 days after fertilization in Cook group was lower than that in the Vitrolife group（31.22% vs 40.61%，33.43%vs 42.34%，P＜0.05）.While，the available blastocyst rate in the Cook group was significantly higher than that of the Vitrolife group（55.42%vs 37.82%，46.39%vs 30.58%，P＜0.05）.3 days after fertilization，the proportion of 5-7 cells of the embryo in the Cook group was significantly higher than that in the Vitrolife group（34.32% vs 24.23%，P＜0.05）；and the proportion of 8-10 cells of the embryo in the Vitrolife group was significantly higher than that in the Cook group（52.22%vs 42.07%，P＜0.05）.Conclusion There is no significant effect on pregnancy outcome either in Vitrolife culturemedium or Cook culturemedium，but the Cook culturemedium may be better for the development of blastocyst stage.

［Key words］Embryo；Culturemedia；Embryonic development；Pregnancy outcome

人類胚胎培養(yǎng)液經(jīng)歷了30多年的發(fā)展，如今市場上已出現(xiàn)多種有效的商品化培養(yǎng)液用于胚胎培養(yǎng)。不同品牌的培養(yǎng)液有不同類型及不同濃度的營養(yǎng)成分，同時(shí)由于人類配子的稀缺性、珍貴性，商品化培養(yǎng)液的配制更多是基于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證。而人類配子對營養(yǎng)成分的需求和體外微環(huán)境的適應(yīng)性與動(dòng)物配子又有一定差距［1］，因此不同培養(yǎng)體系可能會(huì)對植入前胚胎的發(fā)育潛能以及種植能力產(chǎn)生一定影響，進(jìn)而導(dǎo)致新生兒早產(chǎn)、低體重以及先天性畸形等子代健康問題［2-7］。造成差異的原因尚未明確，如何選擇更適用于人類胚胎的商品化培養(yǎng)液已成為很多生殖中心工作人員需要考慮的問題。目前，很少有研究比較這些商品化培養(yǎng)液對種植前人類胚胎的發(fā)育潛能及妊娠結(jié)局的影響。因此，本研究就Vitrolife和Cook兩種商品化培養(yǎng)液對胚胎的發(fā)育速度等發(fā)育潛能相關(guān)指標(biāo)及妊娠結(jié)局的影響進(jìn)行深入探討。

1　對象與方法

1.1對象

回顧性分析2014年8月～2015年5月在南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院（以下簡稱“我院”）生殖科行常規(guī)體外受精（in vitro fertilization，IVF）或卵胞漿內(nèi)單精子注射（Intracytoplasmic sperm injection，ICSI）治療并新鮮周期移植的398例患者的臨床資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：①女方年齡≤35歲；②不孕年限＜10年；③第1周期患者；④采用長方案治療；⑤體重指數(shù)（BMI）18～25kg/m2；⑥內(nèi)膜厚度8～12 mm；⑦月經(jīng)第3天卯泡刺激素（FSH）≤12 U/mL；⑧獲卵數(shù)8～15枚。排除標(biāo)準(zhǔn)：①種植前遺傳學(xué)診斷/篩查（PGD/PGS）周期；②供精；③受精失敗行早期補(bǔ)救ICSI周期。根據(jù)受精方式與胚胎培養(yǎng)液的不同進(jìn)行分組：IVF周期分為Cook組（n=103例）和Vitrolife組（n=196例），ICSI周期分為Cook組（n=40例）和Vitrolife組（n= 59例）

1.2控制性超促排卵方案

采用促性腺激素（Gn）釋放激素激動(dòng)劑（GnRh-a，曲普瑞林，德國Ferring公司）/基因重組促卵泡激素（Gonal F，果納芬，瑞士雪蘭諾公司）/人絨毛膜促性腺激素（HCG）長方案進(jìn)行控制性超排卵［8］。當(dāng)主導(dǎo)卵泡直徑≥18mm，給予HCG。當(dāng)主導(dǎo)卵泡直徑≥18mm，給予HCG。

1.3卵子采集及胚胎培養(yǎng)

取卵當(dāng)日，卵泡穿刺獲得卵子-放射冠-卵丘復(fù)合物（OCCCs），置于受精培養(yǎng)液（IVF（Vitrolife，Sweden；FM，COOK，Sydney）中培養(yǎng)3 h，卵母細(xì)胞經(jīng)IVF或ICSI進(jìn)行受精，受精后轉(zhuǎn)移至卵裂培養(yǎng)液（G1，Vitrolife，Sweden；CM，COOK，Sydney）。受精后第3天除移植與冷凍胚胎外，剩余胚胎轉(zhuǎn)移至囊胚培養(yǎng)液（G2，Vitrolife，Sweden；BM，COOK，Sydney）繼續(xù)培養(yǎng)，于第5～6天分別觀察囊胚發(fā)育情況。

1.4胚胎評估

根據(jù)ALPHA/ESHRE指南對胚胎質(zhì)量進(jìn)行分級評估［9］，其中分裂期胚胎根據(jù)細(xì)胞數(shù)、卵裂球均一程度、碎片等形態(tài)學(xué)參數(shù)進(jìn)行質(zhì)量評估，分裂胚細(xì)胞數(shù)7～12個(gè)，碎片小于20%，均一或輕度不均為可利用胚胎；囊胚質(zhì)量根據(jù)囊胚的擴(kuò)張和孵出程度將其分為Ⅰ～Ⅵ級，并依據(jù)內(nèi)細(xì)胞團(tuán)（inner cellmass，ICM）和滋養(yǎng)層（trophectoderm，TE）的質(zhì)量分為A～C級，ⅣCB和ⅣBC以上評分者為可利用囊胚［10］。

1.5移植與妊娠

受精后第3天于B超引導(dǎo)下進(jìn)行宮腔內(nèi)雙分裂期胚胎移植。胚胎移植后2周留晨尿行尿HCG檢測，陽性結(jié)果確定為生化妊娠。移植后4周行B超檢查，見妊娠囊者確診為臨床妊娠。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1患者的一般資料

IVF組與ICSI組中，患者的周期數(shù)、年齡、不孕年限、體重指數(shù)、內(nèi)膜厚度、基礎(chǔ)FSH、黃體生成素（LH）用量、平均獲卵數(shù)比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＞0.05）。見表1。

表1　患者一般資料（x±s）

2.2IVF/ICSI周期中Cook與Vitrolife培養(yǎng)液對胚胎發(fā)育及妊娠結(jié)局的影響

IVF/ICSI周期中，Cook組的第3天可利用胚胎率顯著低于Vitrolife組，而囊胚形成率及可利用囊胚率顯著高于Vitrolife組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.05）。兩組受精率、正常受精率、異常受精率、卵裂率、正常卵裂率、可利用胚胎率、臨床妊娠率、種植率及早期流產(chǎn)率比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表2　不同受精方式下Cook和Vitrolife培養(yǎng)液對胚胎發(fā)育及妊娠結(jié)局的影響［%（n1/n2）］

2.3不同培養(yǎng)液對取卵后第3天胚胎發(fā)育速度的影響

對取卵后第3天胚胎的發(fā)育速度進(jìn)行分析（Cook組共1716枚分裂胚，Vitrolife組共2922枚分裂胚）。Cook組 5～7個(gè)細(xì)胞的胚胎所占比例顯著高于Vitrolife組，而Vitrolife組8～10細(xì)胞的胚胎所占比例顯著高于Cook組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；Vitrolife組≥11個(gè)細(xì)胞和Compacting的胚胎所占比例均略高于Cook組，≤4個(gè)細(xì)胞略低于Cook組，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表3。

表3　不同培養(yǎng)液對取卵后第3天胚胎發(fā)育速度的影響［n（%）］

3　討論

國際輔助生殖技術(shù)監(jiān)督委員會(huì)（ICMART）和歐洲人類生殖與胚胎學(xué)會(huì)（ESHRE）的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，通過輔助生殖技術(shù)受孕的孩子逐年增多，但其安全性還需進(jìn)一步驗(yàn)證［11-12］。植入前胚胎在體外培養(yǎng)過程中將經(jīng)歷從受精至內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和滋養(yǎng)外胚層等不同細(xì)胞譜系的派生等過程，體外培養(yǎng)液可能會(huì)導(dǎo)致這些關(guān)鍵性事件發(fā)生改變進(jìn)而可能會(huì)影響胚胎的后續(xù)發(fā)育［13-14］?；谖以褐行膶?shí)驗(yàn)室的培養(yǎng)體系，本研究結(jié)果顯示：Cook和Vitrolife兩種商品化培養(yǎng)液均可獲得較為理想的可利用胚胎和妊娠結(jié)局，但Cook組的第3天可利用胚胎率顯著低于Vitrolife組，而囊胚形成率及可利用囊胚率顯著高于Vitrolife組。

不同品牌的培養(yǎng)液其營養(yǎng)成分及含量均會(huì)有差異，Morbeck等［15］利用小鼠凍融后的一細(xì)胞胚胎分別在七種商品化序貫培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)，其結(jié)果表明：7種培養(yǎng)液的營養(yǎng)成分各有差異，其中Vitrolife培養(yǎng)液的G1和G2中的乳酸含量為10.8和6.0mmol/L，明顯高于Cook培養(yǎng)液 （1.8mmol/L）；Vitrolife分裂期培養(yǎng)液G1不含必需氨基酸，而Cook分裂期培養(yǎng)液CM中含有一定量的必需氨基酸。此外，7種培養(yǎng)基在不同的氧氣濃度和蛋白含量下，鼠胚發(fā)育速度和囊胚形成率也有差別。

本研究結(jié)果提示，分裂期培養(yǎng)階段，Vitrolife培養(yǎng)液優(yōu)于Cook培養(yǎng)液，而進(jìn)入囊胚培養(yǎng)階段，Cook培養(yǎng)液呈現(xiàn)出了明顯優(yōu)勢。于是本研究對第3天胚胎的發(fā)育速度進(jìn)行了比對，結(jié)果顯示，Cook組中≤7個(gè)細(xì)胞的胚胎所占比例較Vitrolife組高，而≥8個(gè)細(xì)胞的胚胎Cook組所占比例較Vitrolife組少，說明Cook于分裂期發(fā)育速度慢于Vitrolife，而7個(gè)細(xì)胞以下的胚胎于第3天不會(huì)作為可利用胚胎，因此Cook組第3天可利用胚胎率會(huì)低于Vitrolife組。這一結(jié)論是否能說明G1優(yōu)于CM，BM優(yōu)于G2，仍需進(jìn)一步研究。此外，Vitrolife組異常受精率 （13.96%）略高于Cook組（11.00%），其原因可能由于過高的多精受精率會(huì)降低可利用胚胎率［16-17］，因此Cook培養(yǎng)液的正常受精率比例有所提高，使正常胚胎數(shù)略有增加。

在輔助生殖治療過程中，胚胎培養(yǎng)液是種植前胚胎最直接的接觸環(huán)境，胚胎可能通過表觀遺傳學(xué)修飾做出一些適應(yīng)性改變，產(chǎn)生長期持續(xù)性影響［18-21］。Rinaudo等［22］發(fā)現(xiàn)鼠胚在Whitten′smedium中有114個(gè)基因表達(dá)被影響，在KSOM/AA中有29個(gè)基因表達(dá)被影響。而與在體內(nèi)培養(yǎng)的鼠胚相比，5種不同培養(yǎng)液培養(yǎng)的鼠胚為了維持基因印記會(huì)做出不同的表觀遺傳學(xué)改變［23］。鑒于以上動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果及試管嬰兒逐年增加的趨勢，應(yīng)優(yōu)化胚胎培養(yǎng)液的選擇，以降低胚胎的短期風(fēng)險(xiǎn)，保障母嬰安全。

本次研究對象均是35周歲以下，使用長方案促排的患者，其卵巢功能較好，獲卵數(shù)適中，因此研究對象范圍有局限性。在今后的臨床工作中，本研究將比較不同培養(yǎng)液對年齡較大、卵巢功能較差的患者，以及對獲卵數(shù)過多或過少的患者的胚胎發(fā)育狀況的影響。同時(shí)，本研究還將對新生兒出身狀況及長期健康情況進(jìn)行隨訪，以確保商品化培養(yǎng)液的安全可靠。

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Effect of commercially culture media on human embryonic development and pregnancy outcome

JIANG YiqunWANG ShanshanXU ZhipengZHANG NingyuanSUN Haixiang▲
Reproductive Medicine Center，the Affiliated Drum Tower Hospital of Nanjing University Medical School，Jiangsu Province，Nanjing210008，China

R321

A

1674-4721（2016）09（b）-0072-04

2016-06-07本文編輯：任念）

江蘇省南京市醫(yī)學(xué)科技發(fā)展一般性項(xiàng)目（YKK15074）。