張立巖，孫新，田丹，徐睿，雷昊，艾津輝，王華，王海濤，陳繼營，柴偉

(1.北華大學(xué)附屬醫(yī)院骨外1科，吉林吉林132001；2.北華大學(xué)生命科學(xué)研究中心，吉林吉林132001；3.解放軍總醫(yī)院，北京100853）

論著

改良分次酶消化法分離培養(yǎng)兔肌腱干細(xì)胞及誘導(dǎo)分化鑒定*

張立巖1，孫新2，田丹2，徐睿1，雷昊1，艾津輝1，王華1，王海濤1，陳繼營3，柴偉3

(1.北華大學(xué)附屬醫(yī)院骨外1科，吉林吉林132001；2.北華大學(xué)生命科學(xué)研究中心，吉林吉林132001；3.解放軍總醫(yī)院，北京100853）

目的采用改良分次酶消化法體外分離培養(yǎng)家兔肌腱干細(xì)胞，觀察其生物學(xué)特性，并進(jìn)行誘導(dǎo)分化及鑒定。方法無菌條件下取出家兔髕腱組織，分別運(yùn)用改良的分次酶消化法和酶消化后低密度稀釋接種法進(jìn)行分離、培養(yǎng)、傳代，用倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)特征并繪制兩種方法的生長曲線，通過流式細(xì)胞鑒定儀檢測(cè)肌腱干細(xì)胞表面抗原標(biāo)志物的表達(dá)，取P3-P4代肌腱干細(xì)胞向成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化并鑒定。結(jié)果改良的分次酶消化法較酶消化后低密度稀釋接種法細(xì)胞增殖速度加快，形態(tài)均一，雜質(zhì)細(xì)胞少。分離出的肌腱干細(xì)胞表面抗原標(biāo)志CD90、CD44呈陽性，而CD34、CD14呈陰性，證實(shí)之前分離的細(xì)胞為肌腱干細(xì)胞。鑒定出肌腱干細(xì)胞具有向成骨細(xì)胞和成軟骨細(xì)胞分化能力。結(jié)論采用改良的分次酶消化法分離培養(yǎng)兔肌腱干細(xì)胞簡(jiǎn)單易行，肌腱干細(xì)胞生長及傳代速度可觀，活性良好，純度較高。另外，肌腱干細(xì)胞的成功分離培養(yǎng)，也為肌腱相關(guān)疾病的研究開辟了一條新途徑。

改良酶消化法；肌腱干細(xì)胞；分化鑒定

肌腱干細(xì)胞（tendon stem cells，TDSCs）是具有自我復(fù)制和多向分化潛能的干細(xì)胞[1]。目前，關(guān)于肌腱病的發(fā)病機(jī)制多集中在肌腱干細(xì)胞方面的研究。RUI等[2]研究發(fā)現(xiàn)，慢性腱病的發(fā)生、發(fā)展可能是肌腱干細(xì)胞發(fā)生錯(cuò)誤分化所致。LONGO等[3]證實(shí)，肌腱損傷后愈合速度十分緩慢并易形成疤痕組織，降低肌腱的韌性，經(jīng)過損傷修復(fù)后的肌腱往往更容易再次受到損傷。該病變的原因可能與肌腱干細(xì)胞的異常分化有關(guān)。

采用酶消化后低密度稀釋接種法是目前分離、培養(yǎng)肌腱干細(xì)胞最為常用的方法。但傳統(tǒng)酶消化法培養(yǎng)過程中容易出現(xiàn)細(xì)胞損傷及生長周期緩慢等局限性，且培養(yǎng)出的干細(xì)胞有體外活力差、純度不高等問題[4]。目前也沒有某種特異性的方法用來鑒定培養(yǎng)出來的肌腱干細(xì)胞。因此，本次研究對(duì)常規(guī)方法進(jìn)行改進(jìn)，采用改良的分次酶消化法培養(yǎng)家兔肌腱干細(xì)胞，可以達(dá)到干細(xì)胞活性良好、增殖速度快、純度較高的目的，并對(duì)其進(jìn)行分化能力鑒定。通過本實(shí)驗(yàn)確立高效、穩(wěn)定的家兔肌腱干細(xì)胞分離培養(yǎng)體系和鑒定方案，旨在為進(jìn)一步研究肌腱相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)制和防治藥物奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物3月齡家兔10只，體重2.0～3.0kg，由北華大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，飼養(yǎng)在北華大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室。動(dòng)物標(biāo)本收集，符合單位相關(guān)倫理學(xué)規(guī)定。

1.1.2主要實(shí)驗(yàn)儀器與設(shè)備70μm細(xì)胞過濾器（美國Biologix公司），不銹鋼細(xì)胞篩網(wǎng)（上海易佰聚經(jīng)貿(mào)有限公司），二氧化碳CO2恒溫孵箱（美國Thermo公司），倒置相差顯微鏡（日本Olympus公司），低速離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠Anke），超凈工作臺(tái)（上海力申科學(xué)儀器有限公司），流式細(xì)胞儀（美國Becton Dickinson公司），細(xì)胞培養(yǎng)皿、培養(yǎng)瓶、離心管（美國Coring公司）。

1.1.3主要試劑DMEM培養(yǎng)液（美國Gibco公司）；胎牛血清FBS（美國Gibco公司），Ⅱ型膠原蛋白酶（美國Sigma公司），0.20%DTA、0.25%胰蛋白酶（美國Gibco公司），青霉素鏈霉素混合液P/S（美國Gibco公司），CD90、CD44、CD14、CD34一抗（美國Becton Dickinson公司），維生素C、地塞米松、β-磷酸甘油鈉、骨化三醇、維甲酸（美國Sigma公司），TGF-β（美國R&D Systems公司），堿性磷酸酶染液（南京建成科技有限公司），阿爾新藍(lán)染液（美國Sigma公司）。

1.2方法

1.2.1家兔髕腱組織的分離適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)取3月齡家兔1只，用25%烏拉坦按4ml/kg經(jīng)耳緣靜脈麻醉。于髕骨和脛骨結(jié)節(jié)之間切前正中切口，長約3.0cm，用眼科剪在髕腱中段剪取2.0cm× 1.0cm髕腱組織，放入盛有10ml PBS的Ep管中，將Ep管立刻轉(zhuǎn)移至超凈工作臺(tái)內(nèi)進(jìn)行處理。

1.2.2肌腱干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)、傳代酶消化后低密度稀釋接種法：參照秦勝男等[5]實(shí)驗(yàn)方法，剔除腱鞘及腱周組織，將肌腱均勻剪碎成1 mm3的碎塊，每100 mg組織加入3 mg/mlⅠ型膠原酶37℃消化2 h，70μm細(xì)胞過濾器過濾形成單細(xì)胞懸液。將單細(xì)胞懸液以1 000 r/min離心5 min，棄去上清液，用PBS洗2遍，將細(xì)胞沉淀用10%FBS的DMEM培養(yǎng)液重懸。以200個(gè)/cm2細(xì)胞密度接種至10cm培養(yǎng)皿中，置于37℃、5%二氧化碳CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

改良分次酶消化法：在酶消化法分離培養(yǎng)肌腱干細(xì)胞的基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)采用改良分次酶消化法。用PBS沖洗肌腱組織3次，剔除腱鞘及腱周部分組織，將組織轉(zhuǎn)移至另一裝有PBS的培養(yǎng)皿中。用眼科剪將肌腱均勻剪碎成1 mm3大小，轉(zhuǎn)移至Ep管中，每100 mg組織加入0.20%EDTA和0.25%胰蛋白酶、3 mg/mlⅡ型膠原酶進(jìn)行分次消化，放入37℃、5%二氧化碳CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中分別消化30 min、90 min，每15min震蕩1次Ep管。將消化液經(jīng)過100目不銹鋼細(xì)胞篩網(wǎng)過濾除去未消化完全的組織碎屑，連續(xù)用70μm細(xì)胞過濾器過濾除去雜質(zhì)細(xì)胞，以1000r/min離心5min，棄去上清液，收集細(xì)胞。用不含血清的DMEM培養(yǎng)液離心漂洗2次，棄去上清液，加入10%FBS的DMEM培養(yǎng)液重懸細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，以1×103/cm2的密度接種于10cm培養(yǎng)皿中，置于37℃、5%二氧化碳CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

原代細(xì)胞接種后24、48及72 h各換液1次，以后每3d換液1次，當(dāng)細(xì)胞均勻鋪滿瓶底80%～90%面積時(shí)按1∶2或1∶3的比例傳代，換液及傳代后放入倒置相差顯微鏡下仔細(xì)觀察細(xì)胞形態(tài)特征以及生長情況。原代細(xì)胞為P0代，細(xì)胞擴(kuò)增后，取P3-P4代用于相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3肌腱干細(xì)胞生長曲線的繪制取生長狀態(tài)良好的原代肌腱干細(xì)胞，吸除培養(yǎng)基，用PBS沖洗3遍后，加入適量的0.20%EDTA和0.25%胰蛋白酶，消化2～3min，鏡下觀察貼壁細(xì)胞逐漸脫落，變成圓形，個(gè)別細(xì)胞開始漂浮時(shí)，加入FBS終止消化，反復(fù)吹打，以1 500 r/min離心5 min，棄去上清液，收集細(xì)胞。加入10%FBS的DMEM培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，以1×103/L的密度接種于24孔培養(yǎng)板中，1 ml/孔，置于37℃、5%二氧化碳CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每日取3孔，0.20%EDTA和0.25%胰蛋白酶消化，用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)，求出平均值，以時(shí)間為橫坐標(biāo)、細(xì)胞數(shù)的平均值為縱坐標(biāo)，繪制細(xì)胞生長曲線。

1.2.4肌腱干細(xì)胞的鑒定取生長狀態(tài)良好的P3-P4代細(xì)胞，按上述方法收集細(xì)胞，10ml PBS重懸細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，應(yīng)保證分裝后每個(gè)Ep管的細(xì)胞數(shù)不少于1×106個(gè)。4 ml PBS重懸細(xì)胞，將細(xì)胞懸液分裝到8個(gè)2ml Ep管中，每管500μl，按1～8進(jìn)行編號(hào)，1號(hào)管為空白對(duì)照組，2～6號(hào)管依次為CD44、CD44+90、CD90、CD31、CD14，7、8管為二抗陰性對(duì)照組。用PBS洗2次，30μl重懸后按編號(hào)加入相應(yīng)一抗混勻，3個(gè)對(duì)照組不做處理，30μl重懸后按編號(hào)加入相應(yīng)二抗混勻，避光室溫下反應(yīng)30min，PBS洗1次后經(jīng)篩網(wǎng)過濾到相應(yīng)編號(hào)的流式細(xì)胞管中，使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞表面標(biāo)志物的檢測(cè)，并用Win MDI Version 2.9軟件進(jìn)行檢測(cè)和分析細(xì)胞產(chǎn)生陽性信號(hào)的數(shù)值。

1.2.5肌腱干細(xì)胞誘導(dǎo)分化①成骨誘導(dǎo)分化：取P3-P4代肌腱干細(xì)胞進(jìn)行成骨誘導(dǎo)，按上述方法將肌腱干細(xì)胞按以5×104個(gè)/孔的密度種植在6孔培養(yǎng)板中，置于37℃、5%二氧化碳CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中孵育。培養(yǎng)24h后更換成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基（含10% FBS、10 nmol/L地塞米松、10 nmol/L骨化三醇、50μg/ml維生素C、10 mmol/L β-甘油磷酸鈉的DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基），以后每3d更換成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基，誘導(dǎo)21d。誘導(dǎo)完成后，堿性磷酸酶染色，將細(xì)胞爬片用試劑1固定2～5 min，自然晾干，用蒸餾水潤洗30 s，滴加基質(zhì)液數(shù)滴，37℃避光孵育15 min，甩去多余的染液，立即滴加試劑4染液染色5 min，水洗30s，甩去多余的水，再滴加試劑5染液染色30 s，水洗30 s，甩去多余的水，滴加試劑6復(fù)染30 s，水洗30s，晾干后中性樹膠封固。在倒置顯微鏡下觀察鈣鹽沉積情況并采集圖像。②成軟骨誘導(dǎo)分化：取P3-P4代肌腱干細(xì)胞同上處理，用成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基（含10%FBS、1μmol/L地塞米松、104μmol/l維甲酸、50μg/ml維生素C、10 ng/ml TGF-β的DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基）每3 d換液1次，誘導(dǎo)21 d。誘導(dǎo)完成后，用阿爾新藍(lán)在酸性pH組織學(xué)染色，檢測(cè)成軟骨細(xì)胞特異性表達(dá)的Ⅱ型膠原。每孔加2 ml 4%多聚甲醛固定30 min，吸除固定液，每孔加入2 ml阿爾新藍(lán)液，染色20min，加入3%醋酸洗液，清洗2min，再使用PBS沖洗3次，每次2 min，將細(xì)胞梯度乙醇脫水，蒸餾水沖洗3次，每次2min，干燥后中性樹膠封固，在倒置顯微鏡下觀察成軟骨情況并采集圖像。

2 結(jié)果

2.1肌腱干細(xì)胞細(xì)胞形態(tài)的觀察

細(xì)胞經(jīng)過7d的培養(yǎng)后，可以觀察到肌腱干細(xì)胞聚集生長，細(xì)胞集落形成大小與細(xì)胞的接種密度有關(guān)，原代細(xì)胞較傳代細(xì)胞大，細(xì)胞多呈多邊形；P1代多呈扁平狀；P3代多呈成纖維狀細(xì)胞（見圖1）。

2.2肌腱干細(xì)胞的生長曲線

從細(xì)胞計(jì)數(shù)來看，兩組細(xì)胞潛伏期為2～4d，對(duì)數(shù)增殖期為6～9d，至第12天進(jìn)入平臺(tái)期。改良分次酶消化法原代細(xì)胞的增殖能力均優(yōu)于酶消化后低密度稀釋接種法，且獲得的細(xì)胞數(shù)量更多（見圖2）。

2.3肌腱干細(xì)胞的鑒定

采用流式細(xì)胞儀鑒定細(xì)胞表面抗原，肌腱干細(xì)胞表面抗原標(biāo)志CD90、CD44均呈陽性，而CD14、CD34均呈陰性（見圖3）。證實(shí)之前分離的干細(xì)胞為肌腱干細(xì)胞，極大程度排除細(xì)胞污染的可能。

圖1　肌腱干細(xì)胞（光鏡×100）

圖2　改良分次酶消化法和酶消化后低密度稀釋接種法培養(yǎng)的原代兔肌腱干細(xì)胞生長曲線比較

圖3　流式細(xì)胞儀檢測(cè)表面標(biāo)志抗原表達(dá)，提示培養(yǎng)的肌腱干細(xì)胞表達(dá)CD44、CD90，不表達(dá)CD14和CD34

2.4肌腱干細(xì)胞誘導(dǎo)分化的鑒定

2.4.1成骨分化能力肌腱干細(xì)胞經(jīng)21 d成骨誘導(dǎo)后，形成鈣鹽沉積，堿性磷酸酶染色為灰黑色顆粒或塊狀、條狀沉淀，可見明顯的鈣化結(jié)節(jié)（見圖4A）。

2.4.2成軟骨分化能力肌腱干細(xì)胞經(jīng)21 d成軟骨誘導(dǎo)后，形成軟骨樣組織，質(zhì)地較為堅(jiān)硬，阿爾新藍(lán)染色可見藍(lán)染的Ⅱ型膠原，細(xì)胞外有軟骨基質(zhì)形成（見圖4B）。

圖4　肌腱干細(xì)胞（光鏡×100）

3 討論

自2007年BI等[6]首次從肌腱中分離出肌腱干細(xì)胞，并證實(shí)其具有多向分化潛能以后。其他學(xué)者也先后報(bào)道從人和動(dòng)物的肌腱中分離培養(yǎng)出肌腱干細(xì)胞，并進(jìn)一步明確該細(xì)胞具有多向分化潛能和自我更新能力[7-8]。隨著人們對(duì)體育鍛煉的日益重視，肌腱病的發(fā)病率也在逐年的提高，其以肌腱局部疼痛、腫脹、功能障礙為主要表現(xiàn)，肌腱病與肌腱干細(xì)胞的異常分化有關(guān)。肌腱干細(xì)胞具有明確的向成骨及成軟骨分化，該特性適合修復(fù)股骨頭壞死的病理過程，因此有望成為治療股骨頭壞死新的種子細(xì)胞[9]。然而據(jù)RUI[2]和BI等[6]的研究發(fā)現(xiàn)，在肌腱組織中肌腱干細(xì)胞含量極低，且在生理狀態(tài)下處于休眠期，不發(fā)生增殖和分化。如何建立有效的肌腱干細(xì)胞體外分離培養(yǎng)方法是肌腱干細(xì)胞研究的核心問題。

目前肌腱干細(xì)胞可以從大鼠、家兔等的肌腱組織中分離培養(yǎng)獲得[3，7]，其體外分離的主要方法是將酶消化法和低密度稀釋接種法相結(jié)合，酶消化法主要利用膠原酶消化組織間質(zhì)，使細(xì)胞彼此分離，充分發(fā)揮肌腱干細(xì)胞增殖能力，且對(duì)細(xì)胞的損傷較小，低密度稀釋接種法是利用干細(xì)胞能在較低的接種密度時(shí)增殖速度較其他已分化的細(xì)胞快的特點(diǎn)。但該方法在體外分離培養(yǎng)的過程中只對(duì)未消化完全的組織塊進(jìn)行過濾除雜，會(huì)使原代細(xì)胞中雜質(zhì)細(xì)胞較多，而雜質(zhì)細(xì)胞會(huì)影響肌腱干細(xì)胞增殖速度，只有經(jīng)過連續(xù)傳代后才能逐漸達(dá)到純化的目的。本研究采用改良分次酶消化法，用0.25%胰酶和3mg/mlⅡ型膠原酶分次消化，在膠原酶的選擇上采用Ⅱ型膠原酶，在前期實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)其優(yōu)于Ⅰ型膠原酶，更適合消化肌腱組織，棄胰酶消化液和首次膠原酶消化液后，過濾除去未消化完全的組織塊，再連續(xù)用濾器過濾除去雜質(zhì)細(xì)胞后重懸細(xì)胞接種，該方法有效地避免原代細(xì)胞中雜質(zhì)細(xì)胞較多的問題，但離心的過程可能會(huì)對(duì)細(xì)胞造成損傷，不過從結(jié)果上看原代細(xì)胞保持干細(xì)胞良好的增殖能力，且獲得的肌腱干細(xì)胞數(shù)量相對(duì)前種方法更多，改良分次酶消化法細(xì)胞純度也較前種方法更高，是一種可行且更加有效的方法。

實(shí)驗(yàn)利用改良分次酶消化法分離純化大量肌腱干細(xì)胞，細(xì)胞培養(yǎng)至P3代時(shí)，可得到活性良好、形態(tài)均一、較高純度的肌腱干細(xì)胞。然而肌腱干細(xì)胞仍缺乏特異性的免疫標(biāo)志物，目前已證實(shí)，肌腱干細(xì)胞具有和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）等其他干細(xì)胞相似的標(biāo)志物：白細(xì)胞分化抗原分化群（CD44、CD90、CD90.1、CD90.2、CD105、CD146）、干細(xì)胞抗原-1（Sca-1）、基質(zhì)細(xì)胞抗原（Stro-1）、核干細(xì)胞因子（NS）等。不表達(dá)造血干細(xì)胞表面標(biāo)記物CD34和白細(xì)胞分化抗原CD14[10]。該數(shù)據(jù)表明肌腱干細(xì)胞與BMSCs非常相似，但又不完全一致。有研究進(jìn)一步證實(shí)肌腱干細(xì)胞中肌腱相關(guān)標(biāo)記物（tenomodulin，scleraxis，typeⅠcollagen，decorin和biglycan）、軟骨相關(guān)標(biāo)記物（typeⅡcollagen和aggrecan）以及骨相關(guān)標(biāo)記物（ALP和Os teocalcin）的mRNA表達(dá)均明顯高于BMSCs[6]。在人和鼠的肌腱干細(xì)胞中都沒有CD18的表達(dá)，而在BMSCs中就存在這種分子[11]，該差異可能決定肌腱干細(xì)胞在分化時(shí)不同于BMSCs。但其特征性的免疫標(biāo)志物還有待進(jìn)一步研究。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，改良分次酶消化法培養(yǎng)P3代細(xì)胞能夠較穩(wěn)定、均一地表達(dá)細(xì)胞表面抗原CD90、CD44，幾乎不表達(dá)CD34、CD14，證實(shí)該方法可制備純度較高的肌腱干細(xì)胞群。

除檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)志物外，本實(shí)驗(yàn)還分別將P3-P4代的肌腱干細(xì)胞向成骨、成軟骨方向進(jìn)行誘導(dǎo)。結(jié)果顯示，在誘導(dǎo)分化過程中，分別誘導(dǎo)出成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞的標(biāo)志-鈣化結(jié)節(jié)和藍(lán)染的Ⅱ型膠原，證實(shí)本方法培養(yǎng)的肌腱干細(xì)胞具有向成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞分化潛能。

綜上所述，本研究采用改良分次酶消化法成功分離、純化肌腱干細(xì)胞，此法分離培養(yǎng)的肌腱干細(xì)胞具有活性良好、形態(tài)均一、較高純度的特點(diǎn)，因此有望成為較理想的組織工程種子細(xì)胞，為肌腱干細(xì)胞的進(jìn)一步研究和應(yīng)用提供良好的基礎(chǔ)。

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（張蕾編輯）

Isolation and culture of rabbit tendon stem cells by modified fractional enzyme digestion and identification of their induced differentiation*

Li-yan Zhang1，Xin Sun2，Dan Tian2，Rui Xu1，Hao Lei1，Jin-hui Ai1，Hua Wang1，Hai-tao Wang1，Ji-ying Chen3，Wei Chai3
（1.The First Department of Orthopaedics，the Affiliated Hospital of Beihua University，Jilin，Jilin 132001，China；2.Life Science Research Center，Beihua University，Jilin，Jilin 132001，China；3. Department of Orthopedics，General Hospital of Chinese PLA，Beijing 100853，China）

Objective To isolate and culture rabbit tendon stem cellsin vitro by a modified fractional enzyme digestion method，observe their biological characteristics，and induce and identify their differentiation.Methods Rabbit patellar tendon tissue was removed under sterile condition.After the tissue was digested by a modified fractional enzyme digestion method and enzyme digestion method respectively，a low-density dilution inoculation method was adopted to isolate，culture and passage the rabbit tendon stem cells.Morphological characteristics of the cells were observed under an inverted phase contrast microscope and the growth curves of the cells isolated from the tendon tissue with the two methods were drawn.The expressions of tendon stem cell surface antigen markers were identified by a flow cytometer.The P3-P4 generations of the tendon stem cells were induced for the differentiation into osteoblasts and chondroblasts，and the differentiation was identified.Results The proliferation of tendon stemcells isolated by the modified fractional enzymatic digestion and inoculated with low-density dilution inoculation method was accelerated，and the cell shapes were uniform with few impure cells.Surface antigen markers CD90 and CD44 of the isolated tendon stem cells were positive，but CD34 and CD14 were negative，indicating that the isolated cells were the tendon stem cells and the identified tendon stem cells had the ability of differentiation into osteoblasts and chondroblasts.Conclusions The modified fractional enzyme digestion for isolation and culture of rabbit tendon stem cells is simple and practicable.The growth and passage speed of the cells are satisfactory，their viability is good，and the purity is high.In addition，the successful isolation and culture of tendon stem cells may create a new way for the research on tendon-related diseases.

modified enzyme digestion method；tendon stem cell；differentiation and identification

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.18.001

1005-8982（2016）18-0001-05

中國分類號(hào)：R 318A

2016-04-27

國家自然科學(xué)基金委員會(huì)資助項(xiàng)目（81301564）；吉林省教育廳“十二五”科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目（吉教科合字【2015】第141號(hào)）；吉林省科技廳項(xiàng)目（20130624003JC）；吉林省教育廳“十二五”科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目（吉教科合字【2011】第132號(hào)）；吉林市科技項(xiàng)目（201536048）

孫新，E-mail：sunxinbh@126.com；Tel：18604498911