徐春英，李玉中，李巧珍，毛麗麗，林　偉，強曉晶，鄭　欠

（中國農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)環(huán)境與可持續(xù)發(fā)展研究所/農(nóng)業(yè)部旱作節(jié)水農(nóng)業(yè)重點開放實驗室，北京 100081）

土壤浸提液中硝酸鹽氮氧同位素組成的反硝化細菌法測定

徐春英，李玉中*，李巧珍，毛麗麗，林偉，強曉晶，鄭欠

（中國農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)環(huán)境與可持續(xù)發(fā)展研究所/農(nóng)業(yè)部旱作節(jié)水農(nóng)業(yè)重點開放實驗室，北京 100081）

本研究優(yōu)化了采用反硝化細菌法同時測定土壤浸提液中硝酸鹽氮氧同位素組成的方法。在已有研究結(jié)果的基礎上，通過采用5000～8000 r·min-1的轉(zhuǎn)速離心、高純氮氣吹掃1 h、減少加樣量及改造儀器自動進樣器等措施對已發(fā)表方法進行了優(yōu)化。對國際標準樣品USGS34的分析表明，0.1～0.8 μg-N樣品量即可以得到較穩(wěn)定、準確的測定值和校正值；同一時間內(nèi)制備的硝酸鹽δ15N的SD介于0.05‰～0.09‰之間，δ18O的SD介于0.28‰～0.48‰之間；在三個月之內(nèi)δ15N和δ18O的測定值基本一致，表明該方法具有較好的準確度、精密度和穩(wěn)定性。通過研究浸提劑、保存條件以及加熱對測定土壤浸提液中硝酸鹽氮氧同位素組成的影響，結(jié)果表明：常用的去離子水、KCl、CaCl2可能都含有微量的硝酸鹽，隨著加樣量增大，浸提劑中含有的硝酸鹽可能就會影響δ15N和δ18O的測定；對于土壤硝酸鹽的浸提液，冷凍保存效果較好，保證了土壤硝酸鹽氮氧同位素的準確性和穩(wěn)定性；盡管加熱對硝酸鹽標準樣品USGS34和IAEA-NO3的δ15N沒有顯著影響，但δ18O顯著升高，說明加熱易引起氧同位素分餾；而土壤硝酸鹽浸提液樣品加熱前后的δ15N和δ18O的測定值沒有顯著變化，因此為避免產(chǎn)生氧同位素分餾和節(jié)省測試時間，建議同時測定土壤浸提液硝酸鹽δ15N 和δ18O時直接和反硝化細菌反應。應用本方法對不同肥料處理田間土壤浸提液硝酸鹽的氮氧同位素組成進行了測定。

反硝化細菌法；土壤浸提液；硝酸鹽；氮氧同位素組成

徐春英，李玉中，李巧珍，等.土壤浸提液中硝酸鹽氮氧同位素組成的反硝化細菌法測定［J］.農(nóng)業(yè)環(huán)境科學學報，2016，35（9）：1829-1836.

XU Chun-ying，LI Yu-zhong，LI Qiao-zhen，et al.Determination of15N and18O isotope abundance in the extractable soil nitrate by the denitrifier method［J］. Journal of Agro-Environment Science，2016，35（9）：1829-1836.

我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中存在氮肥過量施用現(xiàn)象，這不僅造成氮肥利用率低，經(jīng)濟效益下降，而且長期過量施用氮肥會造成土壤氮素嚴重冗余［1-3］。土壤氮素形成的硝態(tài)氮極易通過淋溶作用進入水體，造成地表水富營養(yǎng)化、地下水的硝酸鹽含量超標［4-8］及溫室氣體N2O排放［9］等問題。硝態(tài)氮是土壤氮循環(huán)及遷移轉(zhuǎn)化過程的中心形態(tài)，已有研究表明硝態(tài)氮中的氮、氧同位素組成是識別其來源和主要氮循環(huán)過程的有用工具［10-11］。

國內(nèi)硝酸鹽氮氧同位素組成的同時分析主要前處理方法為離子交換樹脂法和反硝化細菌法。盡管離子交換樹脂法是收集和富集的一個重要發(fā)展［12］，但是運用該方法分析硝酸鹽氮氧同位素組成需要將樣品富集、洗脫、中和過量的Cl-、冷凍干燥等，操作步驟繁瑣，費時費力；另外，需要用到離子交換樹脂、濾膜、Ag2O等耗材和試劑，前處理的費用很高，這也成為該方法使用的一個限制因子［13］。反硝化細菌法是近幾年硝酸鹽氮氧同位素測試技術(shù)的重要進展，最早由美國普林斯頓大學的Sigman等［14］提出用于海水和淡水的硝酸鹽氮同位素自然豐度測定。該方法由自然存在的缺乏N2O還原酶的反硝化細菌將水中轉(zhuǎn)化為N2O，再由質(zhì)譜儀測定N2O氣體的氮氧同位素組成，從而得到硝酸鹽的氮氧同位素組成［14-15］。與離子交換樹脂法相比，反硝化細菌法具有許多優(yōu)點：（1）所需樣品量低，該方法可同時分析濃度低至μg·L-1的硝酸鹽氮氧同位素組成，同時也由于降低了樣品量而降低了樣品的空白，測試結(jié)果準確；（2）可在常溫常壓下進行，不受有機氮及其他離子的影響；（3）樣品預處理簡單，并且氮氧同位素可同時分析，分析時間明顯縮短，測試成本也極大降低。反硝化細菌法的諸多優(yōu)點，已成為目前國際上先進的硝酸鹽氮氧同位素組成測試技術(shù)［16-18］。

國外研究者已經(jīng)應用反硝化細菌法對土壤浸提液的硝酸鹽氮氧同位素進行測定［19-21］，并用于土壤硝酸鹽溯源與氮轉(zhuǎn)化過程研究［21］；相比而言，國內(nèi)土壤中硝態(tài)氮氮氧同位素自然豐度運用較少，尤其是氧同位素應用更少，其主要原因是缺乏合適有效的分析方法。盡管國內(nèi)已經(jīng)報道了反硝化細菌法測定水體硝酸鹽氮氧同位素方法［22-24］，但是用于土壤浸提液硝酸鹽氮氧同位素分析的相關(guān)文獻較少。本文在前期研究結(jié)果［23］的基礎上進行了一些技術(shù)改進，使反硝化細菌法不但可以用于水體硝酸鹽氮氧同位素的同時測定，而且適于土壤浸提液中硝酸鹽氮氧同位素的同時測定。該方法的完善，有助于促進該方法在國內(nèi)的推廣和應用，從而加強土壤氮循環(huán)和遷移轉(zhuǎn)化過程的研究。

1　材料與方法

1.1儀器

同位素比質(zhì)譜儀Deltaplus（Thermo-Finnigan，美國），連接有PreCon痕量氣體預濃縮裝置（Thermo，美國），CTC-Combi PAL自動進樣器（瑞士CTC Analytics AG），高速離心機（HITACHI，himac CR21G，High-Speed Refrigerated Centrifuge，日本HITACHI公司），氮氣吹掃儀（美國Organomation公司），高壓滅菌鍋（日本SANYO公司），流動注射分析儀（Lachant QC8000，美國Lachant公司）。

1.2試劑

胰蛋白大豆瓊脂培養(yǎng)基、胰蛋白胨大豆肉湯（美國BD公司），試劑（NH4）2SO4、K3PO4、KCl、KNO3（分析純，國藥集團化學試劑有限公司），CaCl2（分析純，西隴化工股份有限公司）、H3PO4（優(yōu)級純，國藥集團化學試劑有限公司），磺胺（美國Sigma公司），N-（1-萘基）乙二胺二鹽酸鹽（優(yōu)級純，國藥集團化學試劑有限公司），國際同位素標準樣品：USGS32、USGS34、USGS35（購自美國USGS），IAEA-NO3（購自IAEA）。

1.3溶液的配制

1.4實驗方法

1.4.1菌株的培養(yǎng)

選用缺乏N2O還原酶活性的反硝化細菌，即致金色假單胞菌P.aureofaciens（ATCC13985，Pseudomonas aureofaciens購自美國農(nóng)業(yè)部菌種保存中心），將該菌株接種并培養(yǎng)7 d待用。

稱取10 g新鮮土壤樣品，加入50 mL 2 mol·L-1的KCl溶液，振蕩1 h，懸液靜置3～5 min后過濾。取15 mL濾液上流動注射分析儀（Lachant QC8000）測定土壤硝態(tài)氮濃度。

將培養(yǎng)7 d的菌液在高速離心機5000～8000 r· min-1的轉(zhuǎn)速下，18℃離心20 min，倒出上層清液，剩余菌體用無的TSB-B培養(yǎng)液懸浮，并濃縮成2倍濃度的菌液，然后加入幾滴止泡劑。吸取2～3 mL濃縮菌液注入容積為20 mL的鉗口頂空瓶后，用高純氮氣（流速為30～40 mL·min-1）吹掃1～3 h，然后用氣密性注射器將0.4～3.5 μg的樣品注入頂空瓶充分混勻，為避免瓶內(nèi)壓力過高，加樣體積一般小于4 mL，最后將頂空瓶倒置放入恒溫箱中26℃過夜培養(yǎng)。次日注入0.15 mL濃度為10 mol·L-1的NaOH，裂解細菌并終止反應，同時吸收產(chǎn)生的CO2。

1.4.4N2O氮氧同位素測定

采用PreCon痕量氣體預濃縮裝置、同位素比質(zhì)譜儀（IRMS，Deltaplus）測定反硝化細菌反應產(chǎn)生的N2O氣體氮氧同位素，PreCon配有CTC-Combi PAL自動進樣器。載氣為高純氦氣，流量為50～60mL·min-1，參考標準氣體為校正過的99.9%N2O氣體。通過CTC-Combi PAL自動進樣器將頂空瓶中N2O氣體輸送至PreCon，經(jīng)PreCon濃縮和捕集N2O氣體，最后由同位素比質(zhì)譜儀同時測定氮氧同位素組成。

1.4.5氮氧同位素測試結(jié)果的校正

氮同位素校正方程如下：

氧同位素校正方程如下：

根據(jù)以上標準樣品的真實值（T）和測定值（M，meas），計算出m和b，得到校正方程，根據(jù)測定值和校正方程計算出樣品的真實值。

1.5統(tǒng)計分析

所得數(shù)據(jù)采用SPSS20.0統(tǒng)計軟件進行顯著性分析。

2　結(jié)果與討論

2.1實驗過程優(yōu)化

2.1.1離心轉(zhuǎn)速

在初期的試驗中［23］，采用30 000 r·min-1的超高速離心，該步驟對于普通實驗室較難操作，本實驗中分別采用了3000、5000、8000 r·min-1的轉(zhuǎn)速離心20 min進行菌液濃縮，對比各自上清液的OD600值發(fā)現(xiàn)，離心轉(zhuǎn)速為3000 r·min-1時OD600值要顯著高于5000 r·min-1和8000 r·min-1（表1），而5000 r·min-1和8000 r·min-1沒有顯著差異，這說明離心轉(zhuǎn)速為5000 r·min-1時已經(jīng)基本將所有的菌體離心沉淀，并且濃縮后菌量也滿足后續(xù)試驗要求，因此，菌液濃縮采用5000～8000 r·min-1轉(zhuǎn)速離心均可，這對于普通實驗室較易實現(xiàn)。

表1　離心轉(zhuǎn)速對菌液OD600值的影響Table 1 Effect of centrifugal rotational speed on OD600 value for denitrifier bacterial solution

2.1.2吹掃時間

表2　不同吹掃時間對USGS34標樣氮氧同位素實測值的影響（n=5）Table 2 Effect of purging time on δ15N and δ18O measured values in USGS34（n=5）

2.1.3自動進樣系統(tǒng)的優(yōu)化

在初期的試驗中［23］，TraceGas標準配置是Gilson自動進樣器和容量為12 mL的樣品瓶，但是該樣品瓶不能直接作為反硝化細菌和樣品的反應瓶，需要抽取2 mL反硝化產(chǎn)生的N2O氣體注入到預抽真空的12 mL樣品瓶中才能進行測定。本研究改用連接CTCCombi PAL自動進樣器，通過設置儀器自動進樣器參數(shù)及改造樣品盤，采用20 mL的頂空鉗口瓶進行反硝化反應，同時根據(jù)樣品濃度加入0.4～3.5 μg，為避免瓶內(nèi)產(chǎn)生過高的壓力，加樣體積應盡量小于4 mL，這個加樣量低于前期試驗樣品量［23］，更明顯低于傳統(tǒng)離線方式同位素測試所需6～20 μg的樣品量［22］。這樣采用20 mL的頂空鉗口瓶可以反硝化反應后直接進樣，無需將N2O氣體另外進行轉(zhuǎn)移［22-23］，從而避免了因N2O氣體轉(zhuǎn)移而可能產(chǎn)生的同位素分餾及實驗誤差。

2.1.4進樣量

為確定PreCon分析系統(tǒng)結(jié)合同位素比質(zhì)譜儀合適的進樣量，本研究考察了不同進樣量下標準樣品USGS34的硝酸鹽氮氧同位素值（表3）。從表3結(jié)果可以看出，在0.1～0.8 μg-N樣品量之間，PreCon預濃縮分析系統(tǒng)結(jié)合同位素比質(zhì)譜儀分析，測定結(jié)果沒有顯著性差異，均能得到較穩(wěn)定、準確的測定值和校正值，比傳統(tǒng)離線方式同位素測試所需1.4～4.5 μg-N的樣品量要低很多［14］。本研究推薦一般用量為0.2～0.4 μg-N。

2.2準確度、精密度、穩(wěn)定性

表4對不同制備時間獲得的USGS34的δ15N和δ18O實測值進行了比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，δ15N和δ18O值非常穩(wěn)定，從2014年9月12日—2015年3月16日測定的15N值非常接近，位于-2.32‰～-2.39‰之間；而δ18O測定值穩(wěn)定性稍差一些，測定值位于-23.96‰～-24.23‰之間，測定值之間也沒有顯著差異，以上結(jié)果表明，在6個月內(nèi)反硝化細菌法同時測定硝酸鹽的δ15N和δ18O是準確的、穩(wěn)定的、可行的。同樣從表4可以看出，同一制備時間的5個平行樣品之間δ15N的SD介于0.05‰～0.09‰之間，δ18O的SD介于0.28‰～0.48‰之間，均低于USGS34給定的δ15N和δ18O的標準偏差（σδ15N≤0.2‰，σδ18O≤0.6‰），表明該方法的準確度、精密度、穩(wěn)定性較好。

表4　不同制備時間USGS34氮氧同位素比值測定的準確度、精密度、穩(wěn)定性（n=5）Table 4 Precision and stability of δ15N and δ18O in USGS34 under different date of sample preparation（n=5）

表3　不同硝態(tài)氮進樣量下δ15N和δ18O值（USGS34）（n=5）Table 3 Raw values of δ15N and δ18O of USGS34 solution with different amount of-N（n=5）

表3　不同硝態(tài)氮進樣量下δ15N和δ18O值（USGS34）（n=5）Table 3 Raw values of δ15N and δ18O of USGS34 solution with different amount of-N（n=5）

δ15N/‰標準樣品Nitrate standards加樣量Amount of N/μg δ18O/‰實測值Raw values±SD/‰校正值Corrected values±SD/‰真實值True values±SD/‰實測值Raw values±SD/‰校正值Corrected values±SD/‰真實值True values±SD/‰0.1　-2.34±0.15　-1.85±0.15 USGS34 -23.81±0.30　-27.87±0.33 0.2　-2.30±0.07　-1.81±0.08　-23.96±0.40　-27.65±0.42 0.4　-2.26±0.07　-1.75±0.08　-23.98±0.25　-27.89±0.28 0.8　-2.36±0.04　-1.82±0.04　-24.01±0.31　-27.89±0.33 -1.80±0.2-27.9±0.6

但是需要指出的是，不同樣品制備時間測定的氮氧同位素值仍然有差異，這可能主要與不同批次反應菌株的差異有關(guān)［15］。為減少此類誤差，本研究建議盡量采用新活化或者轉(zhuǎn)接代數(shù)較少的菌株進行反硝化反應。

2.3浸提劑對土壤硝酸鹽氮氧同位素值的影響

目前國內(nèi)較多采用2 mol·L-1KCl或者0.01 mol· L-1CaCl2溶液來浸提土壤中的硝酸鹽，已有研究發(fā)現(xiàn)該兩種浸提劑對土壤中硝酸鹽的測定結(jié)果并無顯著差異［25］。由于不同生產(chǎn)廠商及不同批次的去離子水、KCl以及CaCl2可能質(zhì)量不同，難以保證研究人員采用的浸提劑和標準溶液的配置采用的試劑質(zhì)量完全一致，因此，本研究比較了有代表性的去離子水（H2O）、2 mol·L-1KCl及0.01 mol·L-1CaCl2作為樣品加入反硝化菌液后產(chǎn)生的N2O的豐度和面積，以此來探究浸提劑是否影響土壤浸提液中硝酸鹽氮氧同位素值的測定（表5）。從表5可以看出，本研究所用的0.01 mol·L-1CaCl2中可以檢測出微量硝酸鹽，而去離子水（H2O）和2 mol·L-1KCl中未檢出硝酸鹽。PreCon結(jié)合同位素質(zhì)譜儀進一步檢測反應產(chǎn)生的N2O發(fā)現(xiàn)，無論是吹掃后的空白反硝化細菌菌液、去離子水（H2O）還是2 mol·L-1KCl和0.01 mol·L-1CaCl2都能檢測到一個N2O峰，14N14N16O的豐度空白最低，面積也是空白最小。在本實驗室通常的0.15 mL的加樣量下，各個處理之間豐度和面積沒有顯著差異，但是隨加樣量增加一倍（0.30 mL），0.01 mol·L-1CaCl2產(chǎn)生N2O的豐度和面積要顯著高于其他處理，其他處理之間沒有顯著差異，這說明此次試驗的浸提劑CaCl2自身含有的硝酸鹽可能會影響樣品的測定，而本實驗用KCl和H2O中的硝酸鹽對樣品測定不會產(chǎn)生影響。

表5　不同浸提劑對硝酸鹽氮氧同位素比值測定的影響Table 5 Effect of different extracting agents on δ15N and δ18O of nitrate

本研究同時考察了去離子水和2 mol·L-1KCl分別配制的標準樣品USGS32、USGS34、USGS35、IAEANO3的反硝化細菌法測定的氮氧同位素值（表6），從表6可以看出，盡管各個標準樣品氮氧同位素測定值存在差異，但是差異不顯著（α=0.05）。這表明2 mol· L-1KCl浸提劑自身并不影響反硝化細菌的生長和浸提液中硝酸鹽氮氧同位素組成的測定，這點與M?rkved等［19］認為2 mol·L-1KCl通過改變反硝化效率而影響測定值的結(jié)果不同，但Rock等［20］通過測定2 mol·L-1KCl浸提液中硝酸鹽的氮氧同位素組成來進行土壤硝酸鹽溯源，也并未指出浸提劑對反硝化效率的影響。

盡管如此，空白試驗數(shù)據(jù)表明，H2O、2 mol·L-1KCl及0.01 mol·L-1CaCl2溶液的反硝化反應可能也都產(chǎn)生了微量N2O氣體（見表5，m/z 44面積），這說明H2O、KCl、CaCl2可能都含有微量的硝酸鹽，這可能也是不同溶液的標準樣品氮氧同位素測定值存在差異的原因。因此，為了減少系統(tǒng)和測定誤差，一是建議購買純度較高的浸提劑和去離子水，二是建議土壤硝酸鹽浸提液統(tǒng)一采用去離子水配制的標準溶液來校正，且每一次測定都應采用標準樣品重新做校正曲線。

表6　水配制及KCl配制標準樣品的測定值（n=5）Table 6 Raw δ15N and δ18O values of NO-standards prepared with3H2O and KCl solution（n=5）

2.4保存條件對土壤中硝酸鹽氮氧同位素值的影響

以2 mol·L-1的KCl溶液為浸提劑，考查了保存條件對土壤中硝酸鹽氮氧同位素測定值的影響。結(jié)果顯示，土壤浸提液的保存方式顯著影響了土壤浸提液中硝酸鹽的氮氧同位素值（表7）。由表7可見，-18℃冷凍保存效果較好，即使冷凍保存30 d，土壤浸提液硝酸鹽的δ15N和δ18O實測值仍然與新鮮樣品當日測定值相近，沒有顯著差異。在4℃冷藏條件下，各土層硝酸鹽的δ15N在冷藏30 d內(nèi)均與新鮮樣品當日測定值相近，沒有顯著差異；但是，各層次土壤硝酸鹽的δ18O在10 d之內(nèi)沒有顯著變化，在20 d和30 d，除40～60 cm土層外，其余均顯著低于新鮮樣品當日測定值，δ18O最大降低了3.88‰，變化非常大，其比例范圍為19.27%～213%。由此可見，土壤樣品浸提后，為保證其δ15N和δ18O的準確性和穩(wěn)定性，一方面應冷凍保存，另一方面應盡快測定。

2.5加熱對土壤硝酸鹽氮氧同位素組成測定的影響

土壤微生物組成復雜，其浸提液可能含有土壤原生反硝化細菌及其N2O還原酶，從而干擾反硝化細菌還原產(chǎn)生N2O的氮氧同位素測定。對此，M?rkved等［19］建議將土壤浸提液80℃加熱1 h，以消除土壤原生反硝化細菌對其硝酸鹽氮同位素測定的干擾。為考察加熱對同時測定硝酸鹽氮氧同位素的影響，同時鑒于每個研究者的土壤浸提液含有的原生反硝化細菌不盡相同，本研究比較了將USGS34、IAEA-NO3標準樣品以及土壤樣品加熱與否的氮氧同位素測定值，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，δ15N測定值沒有顯著差異（表8），表明加熱與否對δ15N測定值沒有顯著影響，這與M?rkved等［19］的結(jié)果是一致的；但是加熱后標準樣品的δ18O測定值要顯著升高（表8），這說明加熱可能促使標樣的O與空氣中O2的氧發(fā)生了交換，導致反硝化作用產(chǎn)生的N2O氣體產(chǎn)生了同位素分餾，而空氣中的δ18O-O2為23.5‰，比USGS34（δ18O=-23.77‰）及IAEA-NO3 （δ18O=21.33‰）中δ18O的實測值都要高，所以加熱過程可能導致標準樣品的O與空氣中的O2發(fā)生了交換，使其δ18O測定值顯著升高，也說明了加熱影響了標準樣品δ18O的準確測定。與標準樣品不同的是，土壤樣品加熱之后δ18O測定值有的升高（表8），有的降低，沒有明顯的規(guī)律性，這說明不加熱時土壤原生反硝化細菌可能產(chǎn)生一定作用，但是加熱又會產(chǎn)生同位素的熱交換，所以加熱前后δ18O測定值沒有顯著差異，δ15N測定值同樣也沒有顯著差異。因此，為保證測定結(jié)果的準確性及節(jié)省測試時間，本研究建議對于土壤浸提液硝酸鹽氮氧同位素的同時測定，浸提液可以直接和反硝化細菌反應，而無需加熱，這也與Rock等［20］直接采用2 mol·L-1KCl土壤浸提液進行反硝化反應測定其硝酸鹽氮氧同位素組成的方法是一致的。

表7　不同保存條件對不同土壤層次硝態(tài)氮氮氧同位素值的影響（n=4）Table 7 Effect of preservation condition on δ15N and δ18O values of soil nitrate in different depth（n=4）

表8　硝酸鹽樣品的氮氧同位素值（加熱與否）Table 8 δ15N and δ18O values in the nitrate samples （heating or not heating）

2.6實際樣品測定

3　結(jié)論

本研究優(yōu)化了已發(fā)表的反硝化細菌結(jié)合Tracegas-同位素比質(zhì)譜儀測定硝酸鹽氮氧同位素的方法，并應用PreCon-同位素質(zhì)譜儀測定。該方法具有較好的準確度、精密度和穩(wěn)定性，且僅需很小的樣品量，并且在普通實驗室即可完成前處理過程，具有很好的推廣應用前景。實驗用去離子水及浸提試劑大多也含有微量的硝酸鹽，隨加樣量增多，有可能會影響浸提液中氮氧同位素的測定，因此建議購買純度較高的浸提劑和去離子水，二是建議土壤硝酸鹽浸提液統(tǒng)一采用去離子水配制的標準溶液來校正，且每一次測定都應采用標準樣品重新做校正曲線。冷凍保存效果較好，δ15N和δ18O值基本沒有變化，因此土壤樣品浸提后，一方面應冷凍保存，另一方面應盡快測定。加熱對硝酸鹽氮同位素測定沒有顯著影響，但會引起氧同位素的分餾，因此建議土壤浸提液直接和反硝化細菌進行反應來測定硝酸鹽氮氧同位素組成。需要指出的是，反硝化細菌可以將土壤中硝酸鹽（）和亞硝酸鹽（NO-2）同時還原為N2O氣體，故測定結(jié)果實際為二者混合物的平均氮同位素組成，因此當亞硝酸鹽同時存在時，可以預先從樣品中除去。其方法是，加足夠量的抗壞血酸使溶液的pH至3.5左右，抗壞血酸不與硝酸鹽作用，而僅與亞硝酸鹽選擇性反應，使其轉(zhuǎn)換為NO并被惰性氣體氦氣連續(xù)移走?？箟难釋Ψ聪趸毦鸁o毒，不影響后續(xù)硝酸鹽的分析。因本研究土壤樣品中未檢測到亞硝酸鹽，故省去該步驟。綜上所述，反硝化細菌法適用于土壤浸提液中硝酸鹽氮氧同位素組成的同時測定。

表9　不同肥料處理田間土壤浸提液硝酸鹽的氮氧同位素校正值Table 9 Corrected δ15N and δ18O values ofof soil extract samples in different fertilizer fields

表9　不同肥料處理田間土壤浸提液硝酸鹽的氮氧同位素校正值Table 9 Corrected δ15N and δ18O values ofof soil extract samples in different fertilizer fields

土壤提取液樣品Soil extract samples　δ15Nnitrate校正值Corrected values±SD/‰　δ18Onitrate校正值Corrected values±SD/‰有機肥田Applied organic fertilizer field　9.40±1.54　1.48±0.97施尿素田Applied urea field　-3.26±0.74　-5.23±1.03農(nóng)戶施肥田Fertilized field as farmers　-3.45±1.04　3.96±0.88

［1］巨曉棠，張福鎖.中國北方土壤硝態(tài)氮的累積及其對環(huán)境的影響［J］.生態(tài)環(huán)境，2003，12（1）：24-28.

JU Xiao-tang，ZHANG Fu-suo.Nitrate accumulation and its implication to environment in North China［J］.Ecology and Environment，2003，12（1）：24-28.

［2］Ju X T，Kou C L，Zhang F S，et al.Nitrogen balance and groundwater nitrate contamination：Comparison among three intensive cropping systems ontheNorthChinaPlain［J］．EnvironmentalPollution，2006，143：117-125.

［3］畢曉慶，山楠，杜連鳳，等.氮肥用量對設施滴灌栽培番茄產(chǎn)量品質(zhì)及土壤硝態(tài)氮累積的影響［J］.農(nóng)業(yè)環(huán)境科學學報，2013，32（11）：2246-2250.

BI Xiao-qing，SHAN Nan，DU Lian-feng，et al.Effects of Nitrogen rates on tomato yield and quality and soil nitrate accumulation under drip irrigationinsolargreenhouse［J］.JournalofAgro-EnvironmentScience，2013，32（11）：2246-2250.

［4］Kol D C，Mayer B，Lee K S，et al.Land-use controls on sources and fate of nitrate in shallow groundwater of an agricultural area revealed by multiple environmental tracers［J］.Journal of Contaminant Hydrology，2010，118（1/2）：62-78.

［5］王慶鎖，孫東寶，郝衛(wèi)平，等.密云水庫流域地下水硝態(tài)氮的分布及其影響因素［J］.土壤學報，2011，48（1）：141-150.

WANG Qing-suo，SUN Dong-bao，HAO Wei-ping，et al.Nitrate concentration distribution in groundwater of the Miyun Reservoir Water－shed［J］.Acta Pedologica Sinica，2011，48（1）：141-150.

［6］徐春英，李玉中，李巧珍，等.山東濰坊地下水硝酸鹽污染現(xiàn)狀及δ15N溯源［J］.生態(tài)學報，2011，31（21）：6579-6587.

［7］劉興權(quán)，許晶玉，江麗華，等.山東省種植區(qū)地下水硝酸鹽污染空間變異及分布規(guī)律研究［J］.農(nóng)業(yè)環(huán)境科學學報，2010，29（6）：1172-1179.

LIU Xing-quan，XU Jing-yu，JIANG Li-hua，et al.Spatial variability and distribution pattern of groundwater nitrate pollution in farming regions of Shandong Province，China［J］.Journal of Agro-Environment Science，2010，29（6）：1172-1179.

［8］張麗娟，巨曉棠，劉辰琛，等.北方設施蔬菜種植區(qū)地下水硝酸鹽來源分析：以山東省惠民縣為例［J］.中國農(nóng)業(yè)科學，2010，43（21）：4427-4436.

ZHANG Li-juan，JU Xiao-tang，LIU Chen-chen，et al.A study on nitrate contamination of ground water sources in areas of protected vegetables-growing fields：A case study in Huimin County，Shandong Province ［J］.Scientia Agricultura Sinica，2010，43（21）：4427-4436.

［9］Senbayram M，Chen R，Budai A，et al.N2O emission and the N2O/（N2O+ N2）product ratio of denitrification as controlled by available carbon substrates and nitrate concentrations［J］.Agriculture，Ecosystems&Environment，2012，147（15）：4-12.

［10］Rock L，Ellert B H，Mayer B.Tracing sources of soil nitrate using the dual isotopic composition of nitrate in 2 M KCl-extracts［J］.Soil Biology &Biochemistry，2011，43（12）：2397-2405.

［11］Kelley C J，Keller C K，Evans R D，et al.Nitrate-nitrogen and oxygen isotope ratios for identification of nitrate sources and dominant nitrogen cycle processes in a tile-drained dryland agricultural field［J］.Soil Biology&Biochemistry，2013，57：731-738.

［12］賈小妨，李玉中，徐春英，等.氮、氧同位素與地下水中硝酸鹽溯源研究進展［J］.中國農(nóng)學通報，2009，25（14）：233-239.

JIA Xiao-fang，LI Yu-zhong，XU Chun-ying，et al.Research advanced in N，O isotope and sources of nitrate in groundwater［J］.Chinese Agricultural Science Bulletin，2009，25（14）：233-239.

［13］李玉中，王利民，徐春英，等.地下水硝酸鹽污染治理研究［M］.北京：中國農(nóng)業(yè)科學技術(shù)出版社，2014：113-121.

LI Yu-zhong，WANG Li-min，XU Chun-ying，et al.Research on study of nitrate pollution in groundwater［M］.Beijing：China Agricultural Science and Technology Press，2014：113-121.

［14］Sigman D M，Casciotti K L，Andrean M，et al.A bacterial method for the nitrogen isotopic analysis of nitrate in seawater and freshwater［J］，Analytical Chemistry，2001，73（17）：4145-4153.

［15］Casciotti K L，Sigman D M，Hastings M G，et al.Measurement of the oxygen isotopic composition of nitrate in seawater and freshwater using the denitrifier method［J］.Analytical Chemistry，2002，74（19）：4905-4912.

［16］McIlvin M R，Casciotti K L.Technical updates to the bacterial method for nitrate isotopic analyses［J］.Analytical Chemistry，2011，83（5）：1850-1856.

［17］Révész K，Casciotti K L.Methods of the reston stable isotope laboratory ［S］.U.S.Geological Survey，Reston，Virginia 2007，http：//www.usgs. gov/.

［18］Fenech C，Rock L，Nolan K，et al.The potential for a suite of isotope and chemical markers to differentiate sources of nitrate contamination：A review［J］.Water Research，2012，46（7）：2023-2041.

［19］M?rkved P T，D?rsch P，S?vik A K，et al.Simplified preparation for the δ15N-analysis in soilby the denitrifier method［J］.Soil Biology& Biochemistry，2007，39（8）：1907-1915.

［20］Rock L，Ellert B H.Nitrogen-15 and oxygen-18 natural abundance of potassiumchlorideextractablesoilnitrateusingthedenitrifiermethod［J］. Soil Science Society of America Journal，2007，71（2）：355-361.

［21］Minet E，Coxon C E，Goodhue R，et al.Evaluating the utility of15N and18O isotope abundance analyses to identify nitrate sources：A soil zone study［J］.Water Research，2012，46（12）：3723-3736.

［22］張翠云，張俊霞，馬琳娜，等.硝酸鹽氮同位素反硝化細菌法測試技術(shù)的建立［J］.核技術(shù)，2011，34（3）：237-240.

ZHANG Cui-yun，ZHANG Jin-xia，MA Lin-na，et al.A technique for measuring nitrogen isotopic composition of nitrate using the denitrifier method［J］.Nuclear Techniques，2011，34（3）：237-240.

［23］徐春英，李玉中，郝衛(wèi)平，等.反硝化細菌法結(jié)合痕量氣體分析儀/同位素比質(zhì)譜儀分析水體硝酸鹽氮同位素組成［J］.分析化學，2012，40（9）：1360-1365.

XU Chun-ying，LI Yu-zhong，HAO Wei-ping，et al.Analysis of nitrogen isotopic composition of nitrate in water by denitrifier method and trace-gas/isotope ratio mass spectrometry［J］.Chinese Journal of Analytical Chemistry，2012，40（9）：1360-1365.

［24］岳甫均，李思亮，劉叢強，等.利用反硝化細菌法測試水體硝酸鹽氮氧同位素［J］.生態(tài)學雜志，2012，31（8）：2152-2157.

YUE Fu-jun，LI Si-liang，LIU Cong-qiang，et al.Measurement of waters nitrate dual isotopes based on denitrifier method［J］.Chinese Journal of Ecology，2012，31（8）：2152-2157.

［25］陜紅，張慶忠，張曉娟，等.保存、分析方法等因素對土壤中硝態(tài)氮測定的影響［J］.分析測試學報，2013，32（12）：1466-1471.

SHAN Hong，ZHANG Qing-zhong，ZHANG Xiao-juan，et al.Effect of preservation，analysis method on determination of nitrate in soils［J］. Journal of Instrumental Analysis，2013，32（12）：1466-1471.

Determination of15N and18O isotope abundance in the extractable soil nitrate by the denitrifier method

XU Chun-ying，LI Yu-zhong*，LI Qiao-zhen，MAO Li-li，LIN Wei，QIANG Xiao-jing，ZHENG Qian
（Key Laboratory of Dryland Agriculture，Ministry of Agriculture in China，Institute of Environment and Sustainable Development in Agriculture，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081，China）

A method has been established for determing simultaneouslyN andO isotope abundance in the extractable soil nitrate using denitrifier bacteria.The method was optimized by using 5000～8000 r·min-1centrifugal rotational speed，purging 1 h with high pure N2，reducing the amounts of samples and improving the autosampler based on the preliminary findings.Analysis of international standard of USGS34 showed that the method presented better accuracy，precision，and stability.The standard deviations（SD）of δ15N and δ18O were 0.05‰～0.09‰and 0.28‰～0.48‰respectively in the same sample at the same time within 3 months.Additionally，the effects of some factors such as the extracting agents，storage condition and heating on δ15N and δ18O of soil nitrate were analyzed.The results showed that the extracted solution such as KCl or CaCl2had no effect on the determination of δ15N and δ18O if sampling amount was small.Nevertheless，the significant difference would be found under bigger sampling amount with impure extracting agents.Moreover，the results also indicated that the cryopreservation method was better than the cold preservation for the δ15N and δ18O in the soil nitrate.Analysis of δ15N and δ18O shouldbe finished as soon as possible；on the other hand，the soil extracted solution should be cryopreserved.No significant effect of the heat treatment was observed for δ15N values of USGS34 and IAEA-NO3.However，the raw δ18O values showed that there were significant differences in heating，and this caused oxygen isotopic fractionation.But no significant differences were observed for δ15N and δ18O in the extracted soil nitrate samples.Therefore，we suggested that the soil nitrate extracts can directly react with denitrifier in order to avoid the oxygen isotopic fractionation and save the test time.Based on these，15N and18O isotope abundance in the extractable soil nitrate under the different fertilizer fields were investigated by using this method.

denitrifier method；soil extract；nitrate；15N and18O isotope abundance

S151.9

A

1672-2043（2016）09-1829-08doi：10.11654/jaes.2016-0551

2016－04－19

國家自然科學基金（41301553，41473004）；中央級公益性科研院所基本業(yè)務費專項資金；中國農(nóng)科院科技創(chuàng)新工程資助項目（農(nóng)業(yè)水生產(chǎn)力與水環(huán)境創(chuàng)新團隊）

徐春英（1978—），女，副研究員，博士，主要研究方向為農(nóng)業(yè)水環(huán)境。E-mail：xuchuny@126.com

李玉中E-mail：liyuzhong@caas.cn