吳 娟, 金晨鐘, 胡一鴻, 胡軍和, 竺錫武, 徐 虹

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MreB在鈍頂螺旋藻中的表達(dá)和定位

吳 娟1, 2, 金晨鐘1, 胡一鴻1, 胡軍和1, 竺錫武1, 徐 虹2

(1. 湖南人文科技學(xué)院農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院, 湖南婁底 417000; 2. 廈門(mén)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 福建廈門(mén) 361102)

為了研究MreB在鈍頂螺旋藻形態(tài)建成中的作用, 克隆了基因并進(jìn)行原核表達(dá), 對(duì)表達(dá)的融合蛋白進(jìn)行了純化, 免疫小鼠制備了MreB的多克隆抗體, 分別用Western blot和免疫熒光技術(shù)檢測(cè)不同形態(tài)藻絲體中MreB的表達(dá)和定位, 結(jié)果顯示MreB表達(dá)量在螺旋形和直線(xiàn)形兩種藻絲體中無(wú)明顯差異; 免疫熒光定位顯示, 熒光主要分布于細(xì)胞膜下一圈, 側(cè)面可觀察到熒光呈雙股螺旋狀分布。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明, MreB含量不是導(dǎo)致螺旋藻形態(tài)改變的因素, MreB細(xì)胞骨架蛋白參與指導(dǎo)細(xì)胞壁肽聚糖的合成, 所以有可能通過(guò)其雙螺旋結(jié)構(gòu)在藻細(xì)胞中的不對(duì)稱(chēng)分布影響螺旋藻的形態(tài)。

螺旋形藻絲體; 直線(xiàn)形藻絲體; 細(xì)胞骨架蛋白

螺旋藻(), 又稱(chēng)節(jié)旋藻(), 是一種光合放氧的原核絲狀微藻, 藻絲是由許多圓柱狀細(xì)胞連結(jié)而成的單列絲狀體, 其典型的形態(tài)學(xué)特征呈疏松或緊密的有規(guī)則的螺旋形或波浪形, 兩端鈍圓, 無(wú)分枝、無(wú)異形細(xì)胞。但是螺旋藻無(wú)論是在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)還是生產(chǎn)條件下都存在多形性變異現(xiàn)象[1]。有時(shí)在同一水體中的同一種螺旋藻形態(tài)也會(huì)有所不同, 據(jù)報(bào)道,當(dāng)培養(yǎng)溫度和光照強(qiáng)度增高時(shí), 螺距變小; 而在光密度很低情況下, 螺距很長(zhǎng), 超過(guò)100μm[2]。彭衛(wèi)民等從正常培養(yǎng)的藻液中分離得到了顏色、長(zhǎng)短、粗細(xì)均與螺旋形藻絲體相同的直線(xiàn)形變異藻株[1]。

原核細(xì)胞骨架蛋白MreB是真核肌動(dòng)蛋白的類(lèi)似物, 在維持細(xì)菌桿狀形態(tài)的功能中起了重要的作用[3-4]。它能在細(xì)胞生長(zhǎng)或分裂時(shí)期分別在膜內(nèi)側(cè)形成螺旋形或環(huán)狀結(jié)構(gòu), 并以此動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)作為平臺(tái), 在其上招募一些肽聚糖合成相關(guān)酶, 指導(dǎo)肽聚糖的合成, 形成新生細(xì)胞壁, 從而使細(xì)胞產(chǎn)生和保持特定的形態(tài)[5-7]。為了研究MreB在螺旋藻形態(tài)建成中的作用, 我們釣取了螺旋藻mreB基因序列, 克隆、表達(dá)、純化了鈍頂螺旋藻(FACHB869S)的MreB蛋白, 免疫小鼠并獲得相應(yīng)的多克隆抗體, 用免疫印跡和間接免疫熒光標(biāo)記技術(shù)對(duì)其表達(dá)量和細(xì)胞定位進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

限制性?xún)?nèi)切酶、DNA Marker、T4DNA連接酶、酶等購(gòu)自大連寶生生物有限公司; 山羊抗小鼠IgG-HRP 購(gòu)自北京博大泰克生物基因技術(shù)公司; PVDF膜為MILLIPORE公司產(chǎn)品; 質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自加拿大BIO BASIC公司; 熒光二抗(Fluorescein Conjugated Affinity Purified anti-Mouse IgG[Goat])購(gòu)自美國(guó)Rockland 公司; IPTG、弗氏完全佐劑和不完全佐劑、丙稀酰胺、甲叉丙稀酰胺、Tris-base、甘氨酸、SDS、巰基乙醇、DTT、Triton X-100、尿素、TEMED、過(guò)硫酸氨、考馬斯亮蘭G250, 等均購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司; 其余試劑和藥品均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭┖退幤?。所有測(cè)序工作均由金思特科技(南京)有限公司完成。

FPROGO5D型PCR儀(美國(guó) BIO-RAD公司); 超聲破碎儀(美國(guó)VirTis公司); 多用電泳儀(美國(guó)VirTis公司); Mini-PROTEAN 3 蛋白電泳系統(tǒng)(美國(guó) BIO-RAD公司); 小型 Trans-Blot 電轉(zhuǎn)印系統(tǒng)(美國(guó) BIO-RAD公司); 熒光顯微鏡(日本Nikon公司)。

1.2 藻種、菌種與質(zhì)粒

實(shí)驗(yàn)采用的鈍頂螺旋藻, FACHB編號(hào)分別為: 869和882, 分離的兩種形態(tài)分別標(biāo)注螺旋形(spiral, S)、直線(xiàn)形(linear, L), 均購(gòu)自中科院武漢水生所, 本實(shí)驗(yàn)室保存。大腸桿菌BL21(DE3)plysS和質(zhì)粒pGEX-6P-1由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1基因的擴(kuò)增

按照茅云翔等的方法[8]提取鈍頂螺旋藻全基因組DNA, 以它為模板, 用引物P1: 5- AAGGAT CCATGGGCATAGACCTAGGAACCG-3; P2: 5-GAG AATTCCTACGGA TTTTGTG ATTGTCGTG -3(上海生工生物工程有限公司合成)進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)液為50μL, 含有1×PCR buffer, 200μmol/L dNTP, 1.5mmol/L MgCl2, 0.6μmol/L引物, 50ng模板DNA, 2.5U酶。擴(kuò)增條件為94℃預(yù)變性5min, 然后94℃ 45s, 58℃ 45s, 72℃ 90s, 35個(gè)循環(huán), 最后于72℃保溫10min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.3.2質(zhì)粒的構(gòu)建

將以P1、P2為引物, PCR擴(kuò)增的基因用H Ⅰ和R Ⅰ雙酶切, 經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后挖膠回收1.1kb大小的mreB片段, 連接到經(jīng)同樣雙酶切的pGEX質(zhì)粒中, 通過(guò)測(cè)序確保插入的基因與質(zhì)粒的閱讀框架一致。

1.3.3目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

將重組表達(dá)質(zhì)粒pGEX-轉(zhuǎn)化BL21 (DE3)plysS, 然后涂布120 μg/mL Amp LB 培養(yǎng)基固體平板, 37℃培養(yǎng)過(guò)夜。挑取單菌落于4 mL LB 液體培養(yǎng)基(Amp100 μg/mL)搖至600=0.8~1.0時(shí)將菌液轉(zhuǎn)接于100 mL 培養(yǎng)基, 37℃搖至600= 0.7左右時(shí), 加IPTG 至終濃度0.5 mmol/L, 然后將菌液轉(zhuǎn)至28℃誘導(dǎo)6h。5000 r/min 離心10min收集誘導(dǎo)培養(yǎng)的菌體, 將誘導(dǎo)的菌液經(jīng)超聲破碎后分別取上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE 電泳以分析蛋白的表達(dá)狀態(tài)。

1.3.4目的蛋白的純化

收集經(jīng)IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)的菌體并重懸于PBS緩沖液中超聲破碎, 15000r/min離心10min取上清過(guò)預(yù)先平衡好的GST -Resin純化柱; 以20倍柱床體積的PBS緩沖液漂洗柱子; 1mL洗脫緩沖液(含6mM 還原型谷胱甘肽的PBS溶液)將目的蛋白從GST-resin純化柱上洗脫并收集。收集組分進(jìn)行SDS-PAGE分析。

1.3.5多克隆抗體的制備

用原核表達(dá)并純化的GST-MreB免疫昆明小鼠。免疫前每只小鼠取20 μL 血清作為陰性對(duì)照備用。首次免疫用弗氏完全佐劑乳化GST-MreB 后, 采用腹腔和皮下多點(diǎn)混合注射, 腹腔注射100 μL, 皮下各點(diǎn)25 μL, 蛋白用量為200 μg/只。此后每隔7d 加強(qiáng)免疫一次, 共3 次。加強(qiáng)免疫用弗氏不完全佐劑, 所用劑量同首次免疫。30d 后摘眼球取血, 4℃靜置過(guò)夜, 取血清, –20℃保存。

1.3.6Western-blot 檢測(cè)

不同形態(tài)藻絲體總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE, 電轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上, TBS 洗膜; 用含5%脫脂奶的TBST37℃封閉30min, TBST 洗膜; 一抗 1︰1000 稀釋, 分別加到相應(yīng)的PVDF 膜上室溫孵育1h, TBST 洗膜; 加入1︰2000 稀釋的羊抗鼠IgG-HRP 室溫孵育1h, TBST 洗膜; 用化學(xué)發(fā)光法顯色定影于底片; 使用Image-Pro Plus 軟件進(jìn)行蛋白定量分析, 分析結(jié)果來(lái)源于3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。

1.3.7MreB的免疫熒光定位

培養(yǎng)螺旋藻至560為 0.5~ 1.0, 4000 r/min 離心收集藻細(xì)胞, 加入適量PBS重懸藻細(xì)胞, 超聲波處理5 次, 輸出功率為5 W, 每次2s; 低速離心收集藻細(xì)胞, 用1.5 mol/L NaCl的Zarrouk培養(yǎng)基洗去細(xì)胞外壁的膠質(zhì)鞘; 低速離心收集藻細(xì)胞, 轉(zhuǎn)入酶解液(0.2 mol/L磷酸鉀緩沖液pH7.2, 滲透穩(wěn)定劑KCl 0.8 mol/L, 0.5%溶菌酶)中, 在28~30℃水浴低速震蕩下酶解1 h, 用PBS 洗滌3 遍, 每次5min; 用4%多聚甲醛常溫固定30min, PBS 洗滌3次; 冰甲醇處理5min, 冰丙酮處理30s; PBS 洗滌3次; 用含1% BSA的PBS封閉藻細(xì)胞1h, 加入小鼠多克隆抗體, 4℃孵育過(guò)夜; PBS 洗滌3次后, 用FITC標(biāo)記的羊抗鼠熒光二抗孵育1h; PBS 洗滌4 次, 取一滴藻液于載玻片上, 加一滴防熒光萃滅劑, 蓋上蓋玻片, 用指甲油封片, 熒光顯微鏡下觀察MreB的細(xì)胞定位。

2 結(jié)果

2.1 鈍頂螺旋藻的克隆

取560為0.8左右的螺旋藻藻液50 mL, 離心后提取藻總DNA, 以總DNA 為模板, P1和P2為引物PCR擴(kuò)增基因, 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè), 結(jié)果表明, 擴(kuò)增產(chǎn)物的大小約為1100 bp, 與預(yù)期結(jié)果相符合(圖1)。

2.2 融合表達(dá)載體pGEX-的構(gòu)建和鑒定

為了研究MreB在螺旋藻中的表達(dá)和定位, 需要將MreB進(jìn)行外源表達(dá)純化后制備多克隆抗體。首先將經(jīng)P1、P2 擴(kuò)增并測(cè)序正確的片段用HⅠ+R Ⅰ雙酶切, 然后與同樣雙酶切的載體pGEX連接, 以構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX-。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α, 經(jīng)Amp抗性篩選后挑取陽(yáng)性克隆菌落進(jìn)行酶切鑒定。重組質(zhì)粒經(jīng)H Ⅰ+RⅠ雙酶切后進(jìn)行電泳檢測(cè), 結(jié)果顯示pGEX載體中已連入1100 bp 的單一片段(圖1)。該重組質(zhì)粒經(jīng)測(cè)序證實(shí)閱讀框正確。

M1. DL2000 DNA Marker; M2. λDNA/RI +dI Marker; 1. PCR production of; 2. pGEX-6P-1/HI; 3. pGEX- 6P-1-/HI; 4. pGEX-6P-1-B/HI +RI

2.3 MreB蛋白的表達(dá)純化

將鑒定正確的重組質(zhì)粒pGEX-6P-1-轉(zhuǎn)化表達(dá)菌BL21, 用0.4mmol/L的IPTG 28℃誘導(dǎo)12 h, 提取菌體總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分析。結(jié)果表明, pGEX-6P-1轉(zhuǎn)化菌誘導(dǎo)后比誘導(dǎo)前多一條分子量26ku的特異性GST蛋白條帶(圖2中的2), pGEX-6P-1-轉(zhuǎn)化表達(dá)菌株在約62ku處出現(xiàn)一條特異性蛋白條帶(圖2中的3和4)。將誘導(dǎo)的菌液經(jīng)超聲破碎后分別取上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE分析, 結(jié)果表明, GST-MreB融合蛋白主要存在于上清中(圖2中的5), 在上清中占總蛋白的50%以上。用GST.Bind resin純化, 純化后的GST-MreB融合蛋白經(jīng)過(guò)SDS-PAGE分析表明, 純度都達(dá)到90%以上, 可用作抗原免疫小鼠。

1, 2. 分別為pGEX-6P-1轉(zhuǎn)化菌誘導(dǎo)前、后總蛋白; 3, 4. 分別為pGEX-6P-1-轉(zhuǎn)化菌誘導(dǎo)前、后總蛋白; 5, 6. 分別為轉(zhuǎn)化菌菌體裂解物上清, 沉淀; 7. 割膠純化后的GST-MreB

1, 2. Cell lysates respectively fromtransformed with empty pGEX-6P-1without or with IPTG induction (negative control); 3, 4. cell lysates respectively fromtransformed with pGEX-6P-1-without or with IPTG induction; 5, 6. soluble protein or insoluble protein fromtransformed with pGEX-6P-1-under IPTGinduction; 7. GST-MreB protein purified by GST.Bind resin agarose chromatograph

2.4 MreB抗體制備與檢測(cè)

用純化得到的融合蛋白作為抗原, 分別用弗氏完全佐劑充分乳化后, 按每只200μg來(lái)免疫小鼠, 第3周開(kāi)始每隔一周加強(qiáng)免疫一次, 3次加強(qiáng)免疫后眼球取血, 分離血清得到融合蛋白的多克隆抗體。

為了檢測(cè)抗體的特異性, 我們用所制備的抗體與鈍頂螺旋藻的總蛋白進(jìn)行了Western blotting, 以BL21轉(zhuǎn)化菌的純化蛋白為陽(yáng)性對(duì)照, 抗體工作濃度為1︰1000。雜交結(jié)果顯示(圖3), 制備的抗體能與轉(zhuǎn)化菌中融合表達(dá)的GST-MreB蛋白產(chǎn)生特異性反應(yīng), 同時(shí)也能與鈍頂螺旋藻總蛋白產(chǎn)生雜交信號(hào), 雜交帶的大小約為36ku, 符合MreB的大小, 且雜交信號(hào)基本單一, 背景干凈, 沒(méi)有其他非特異性雜交信號(hào)干擾。這說(shuō)明, 我們以在BL21中表達(dá)的融合蛋白GST-MreB為抗原所制備的抗MreB抗體的特異性較好, 效價(jià)較高, 可用于鈍頂螺旋藻中MreB的表達(dá)檢測(cè)。

1: pGEX-6P-1-轉(zhuǎn)化菌誘導(dǎo)前總蛋白; 2: pGEX-6P-1-轉(zhuǎn)化菌誘導(dǎo)后總蛋白

1: Total protein fromtransformed with pGEX-6P-1-without IPTG induction; 2: Total protein fromtransformed with pGEX-6P-1-with IPTG induction

2.5 不同形態(tài)螺旋藻藻絲體中MreB蛋白的表達(dá)檢測(cè)

為了研究螺旋藻不同形態(tài)藻絲體的細(xì)胞骨架蛋白是否存在表達(dá)差異, 我們用所制備的鈍頂螺旋藻MreB抗體與鈍頂螺旋藻FACHB 869和882的螺旋形和直線(xiàn)形藻絲體的全蛋白進(jìn)行了Western blot。采用篩絹過(guò)濾收集藻絲體, 以藻泥質(zhì)量作為粗略的定量, 提取全蛋白后, 根據(jù)紫外吸收法測(cè)定蛋白濃度和SDS-PAGE的跑膠結(jié)果, 用緩沖液調(diào)整各蛋白樣品的濃度。為了更為準(zhǔn)確的分析, 在Western blot檢測(cè)的過(guò)程中, 我們以生物鐘蛋白KaiC作為內(nèi)參, 4種螺旋藻處于光暗(Dark 12h/Light 12h)周期誘導(dǎo)3d, 以便同步生物鐘蛋白KaiC的節(jié)律[9]。通過(guò)Image-Pro Plus軟件分析兩者的豐度比值, 對(duì)比目標(biāo)蛋白在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)情況。

在不同形態(tài)螺旋藻藻絲體中均能檢測(cè)到MreB特異性條帶, 大小約為36ku, 背景干凈(圖4)。從Image-Pro Plus 軟件分析結(jié)果可以看出(圖5), MreB的表達(dá)量在螺旋藻Spirulina platensis FACHB 882中直線(xiàn)形藻絲體比螺旋形稍高; 對(duì)于螺旋藻Spirulina platensis FACHB 869, 螺旋形藻絲體的MreB表達(dá)量比直線(xiàn)形稍高, 總體來(lái)看, MreB表達(dá)量在螺旋形和直線(xiàn)形兩種藻絲體中差異不明顯。

2.6 MreB在螺旋藻中的免疫熒光定位研究

按照方法1.3.7, 用帶熒光素FITC的熒光二抗免疫雜交檢測(cè)螺旋藻FACHB 869L和869S MreB蛋白的分布。因?yàn)槁菪逵泻芎竦募?xì)胞壁, 且細(xì)胞壁外有膠質(zhì)鞘覆蓋, 抗體很難直接進(jìn)入胞內(nèi), 所以參照文獻(xiàn)[10]先用較高濃度的鹽處理可快速去除螺旋藻細(xì)胞外膠質(zhì)鞘, 再用溶菌酶處理更有利于抗體進(jìn)入胞內(nèi)。但是溶菌酶也會(huì)作用于藻絲體中單個(gè)藻細(xì)胞之間相連的細(xì)胞壁, 藻絲體變成一個(gè)個(gè)藻細(xì)胞。可能是FACHB 869S的細(xì)胞壁比FACHB 869L更厚更堅(jiān)實(shí), 所以FACHB 869S的免疫熒光檢測(cè)效果不好(圖6B), 只有869L可以明顯的觀察到細(xì)胞內(nèi)部熒光信號(hào)。在有熒光信號(hào)的藻細(xì)胞中, 熒光主要分布于細(xì)胞膜下一圈, 緊貼著細(xì)胞膜(圖6A白色箭頭所示); 藻細(xì)胞是扁圓柱狀, 側(cè)面可觀察到熒光呈雙股螺旋狀分布(圖6A白色箭頭所示)。

A. 869LMreB免疫熒光定位; B. 869S MreB免疫熒光定位

A. Immunofluorescence analysis for MreB location in linear filaments; B. Immunofluorescence analysis for MreB location in spiral filaments

3 討論

關(guān)于螺旋藻的直線(xiàn)突變株早就有報(bào)道, 我們實(shí)驗(yàn)室從中科院武漢水生所購(gòu)買(mǎi)的藻種里也含有兩種形態(tài)的藻絲體, 作者將其分離出來(lái), 各自培養(yǎng), 它們能長(zhǎng)期保持其形態(tài)(至少在我們分離后的這四年里保持其形態(tài)), 未發(fā)生形態(tài)突變。生產(chǎn)上, 變直的螺旋藻不能適應(yīng)高光強(qiáng)的生長(zhǎng)環(huán)境、產(chǎn)量急劇下降、質(zhì)量變差、藻絲體難以采收等一系列嚴(yán)重問(wèn)題, 而帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失[11-12]。因此, 迫切需要研究螺旋形態(tài)建成的外界影響因子及內(nèi)在調(diào)控機(jī)理, 以指導(dǎo)生產(chǎn)實(shí)踐, 并進(jìn)一步探索原核生物形態(tài)建成這一重要課題。根據(jù)我們實(shí)驗(yàn)室之前所做的兩種螺旋藻蛋白表達(dá)差異分析, 對(duì)這些差異點(diǎn)的MALDI-TOF質(zhì)譜鑒定, 數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)分析, 選擇了細(xì)胞骨架蛋白MreB進(jìn)行深入研究[13]。真核細(xì)胞骨架早已研究得較清楚了, 它們?cè)诩?xì)胞形態(tài)決定上起著重要的作用[14]。原核細(xì)胞形態(tài)更加多樣, 如球狀、桿狀、螺旋狀、月牙狀等, 而原核生物細(xì)胞骨架是近十年才發(fā)現(xiàn)的, 其機(jī)理尚不是很清楚, 目前普遍認(rèn)同的觀點(diǎn)是細(xì)胞的形狀是由細(xì)胞骨架決定的, 并且通過(guò)結(jié)實(shí)的細(xì)胞壁的形成固定的。

本論文從原核細(xì)胞骨架蛋白MreB的角度出發(fā), 探討螺旋藻形態(tài)建成與原核細(xì)胞骨架蛋白MreB之間的關(guān)系。利用免疫印跡(Western blot)技術(shù)檢測(cè)MreB 蛋白在鈍頂螺旋藻不同形態(tài)藻絲體中的表達(dá)情況, 發(fā)現(xiàn)MreB表達(dá)量在直線(xiàn)形藻絲體和螺旋形藻絲體中沒(méi)有明顯差異。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明螺旋藻由螺旋形突變成直線(xiàn)形, MreB的含量改變不明顯, MreB含量不是導(dǎo)致螺旋藻形態(tài)改變的因素。

MreB作為主要原核細(xì)胞骨架蛋白之一, 其在細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)形成一個(gè)螺旋形的結(jié)構(gòu), 從細(xì)胞內(nèi)部起到剛性的支撐作用, 而其更重要的作用在于, 作為一個(gè)平臺(tái), 在其上招募一些肽聚糖合成相關(guān)酶, 指導(dǎo)肽聚糖的合成[5, 7, 15]。如果形成螺旋形藻絲體, 則每個(gè)細(xì)胞兩側(cè)的細(xì)胞壁是不對(duì)稱(chēng)生長(zhǎng)的, 而直線(xiàn)形突變株兩側(cè)的細(xì)胞壁是平衡生長(zhǎng)的。Vats P等[16]報(bào)道, 在中GFP-標(biāo)記的MreB蛋白在熒光顯微鏡下, 有雙螺旋、雙環(huán)、單環(huán)三種主要的定位方式。螺旋狀分布與環(huán)狀分布是相互轉(zhuǎn)換的, MreB相關(guān)細(xì)胞骨架隨著細(xì)胞周期改變其結(jié)構(gòu)模式[17]。細(xì)胞分裂時(shí), MreB纖維由原來(lái)擴(kuò)展的螺旋狀態(tài)縊縮為環(huán)狀定位于細(xì)胞未來(lái)分裂位點(diǎn)附近, 單環(huán)隨后轉(zhuǎn)變?yōu)殡p環(huán)位于Z環(huán)(又稱(chēng)為細(xì)胞分裂環(huán))的兩側(cè), 雙環(huán)逐漸分開(kāi), 環(huán)分配到每個(gè)細(xì)胞的一極[18-19]。用間接免疫熒光技術(shù)檢測(cè)螺旋藻MreB分布, 因?yàn)槁菪寰哂袌?jiān)實(shí)的細(xì)胞壁, 如果不用溶菌酶對(duì)細(xì)胞壁進(jìn)行部分降解, 一抗和二抗無(wú)法進(jìn)入胞內(nèi), 我們能夠觀察到二抗熒光信號(hào)的都是細(xì)胞壁部分降解而形成的單個(gè)藻細(xì)胞。從藻細(xì)胞的橫截面, 可以看到熒光主要分布于細(xì)胞膜下一圈, 這與細(xì)菌中MreB細(xì)胞骨架沿細(xì)胞長(zhǎng)軸螺旋狀環(huán)繞于細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)是一致的[17]; 藻細(xì)胞是扁圓柱狀, 長(zhǎng)度很短直徑很大, 從側(cè)面可看到熒光的雙股螺旋狀分布。這些說(shuō)明螺旋藻中MreB的分布與菌中類(lèi)似, 但是螺旋藻細(xì)胞的MreB雙螺旋比菌的螺距短、螺旋度大, 這是因?yàn)樵寮?xì)胞是扁圓柱狀, 大腸桿菌比藻細(xì)胞長(zhǎng), 而直徑則比藻細(xì)胞小, 這類(lèi)似于將一根螺旋絲拉長(zhǎng)了, 螺距就變大了, 螺旋度就變小了, 這也反映了MreB對(duì)細(xì)胞寬度及長(zhǎng)度的調(diào)控作用[6, 20]。

[1] 彭衛(wèi)民, 李祥書(shū). 螺旋藻直線(xiàn)形變異藻株(Sp.—Dz) 研究初報(bào)[J]. 水產(chǎn)科學(xué), 2000, 19(5): 1-5. Peng Weimin, Li Xiangshu. A preliminary study on a linear variety of(Sp.—Dz)[J]. Fisheries Science, 2000, 19(5): 1-5.

[2] 李晉楠. 螺旋藻種質(zhì)與形態(tài)重建的分子遺傳學(xué)研究[D].杭州: 浙江大學(xué), 2002. Li Jinnan. Studies on molecular genetics of germplasm and morphological reformation in[D]. Hangzhou: Zhejiang University, 2002.

[3] van den Ent F, Amos L A, L?we J. Prokaryotic origin of the actin cytoskeleton[J]. Nature, 2001, 413(6851): 39-44.

[4] Jones L J F, Carballido-López R, Errington J. Control of cell shape in bacteria: helical, actin-like filaments in[J]. Cell, 2001, 104(6): 913-922.

[5] Carballido-López R. The bacterial actin-like cytoskeleton[J]. Microbiology and Molecular Biology Reviews, 2006, 70(4): 888-909.

[6] Bean G J, Flickinger S T, Westler W M, et al. A22 disrupts the bacterial actin cytoskeleton by directly binding and inducing a low-affinity state in MreB[J]. Biochemistry, 2009, 48(22): 4852-4857.

[7] Daniel R A, Errington J. Control of cell morphogenesis in bacteria: two distinct ways to make a rod-shaped cell[J]. Cell, 2003, 113(6): 767-776.

[8] 李善策, 李勇勇, 夏金蘭, 等. 純培養(yǎng)節(jié)旋藻全基因組提取方法的比較研究[J]. 海洋科學(xué), 2013, 37(9): 28-36. Li Shance, Li Yongyong, Xia Jinlan, et al. Comparative investigation on whole genome DNA extraction of axenic strains of Athrospira platensis[J]. Marine Sciences, 2013, 37(9): 28-36.

[9] 徐虹, 章軍. 藍(lán)藻生物鐘分子機(jī)制研究進(jìn)展[J]. 海洋科學(xué), 2004, 28(7): 61-66. Xu Hong, Zhang Jun. Research developments on molecular mechanism of circadian clock in cyanobacteria[J]. Marine Sciences, 2004, 28(7): 61-66.

[10] 銀紅梅, 張學(xué)成, 王志剛. 用改進(jìn)的超聲波-溶菌酶法制備鈍頂螺旋藻原生質(zhì)球[J]. 海洋科學(xué), 2007, 31(2): 44-47. Yin Hongmei, Zhang Xuecheng, Wang Zhigang. Preparation of spheroplasts fromby ultrasonic lysozyme method[J]. Marine Sciences, 2007, 31(2): 44-47.

[11] 趙振坤, 徐虹, 林重陽(yáng), 等. 鈍頂螺旋藻不同形態(tài)藻絲體的蛋白質(zhì)表達(dá)和生理差異的比較研究[J]. 廈門(mén)大學(xué)學(xué)報(bào), 2009, 48(1): 119-123. Zhao Zhengkun, Xu Hong, Lin Chongyang, et al. Study on protein expression and physiological differences among four morphologic filaments of[J]. Journal of Xiamen University, 2009, 48(1): 119-123.

[12] 胡天賜, 楊世杰, 毛炎麟. γ 射線(xiàn)對(duì)鈍頂螺旋藻 () 的生物學(xué)效應(yīng)[J]. 核農(nóng)學(xué)報(bào), 1990, 4(2): 120-124. Hu Tianci, Yang Shijie, Mao Yanlin. The effect of γ-irradiation on[J]. Acta Agriculturae Nucleatae Sinica, 1990, 4(2): 120-124.

[13] 林重陽(yáng), 沈曉文, 趙振坤, 等. 鈍頂螺旋藻兩種不同形態(tài)藻絲體的光合作用和蛋白質(zhì)差異表達(dá)分析[J]. 高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報(bào), 2009, 30(6): 1152-1157. Lin Chongyang, Shen Xiaowen, Zhao Zhengkun, et al. Studies on photosynthesis and differentially expressed proteins in two morphologic filaments of[J]. Chemical Journal of Chinese University, 2009, 30(6): 1152-1157.

[14] Esue O, Cordero M, Wirtz D, et al. The assembly of MreB, a prokaryotic homolog of actin[J]. Journal of Biological Chemistry, 2005, 280(4): 2628-2635.

[15] Leaver M, Errington J. Roles for MreC and MreD proteins in helical growth of the cylindrical cell wall in[J]. Molecular microbiology, 2005, 57(5): 1196-1209.

[16] Vats P, Rothfield L. Duplication and segregation of the actin (MreB) cytoskeleton during the prokaryotic cell cycle[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2007, 104(45): 17795-17800.

[17] Michie K A, L?we J. Dynamic filaments of the bacterial cytoskeleton[J]. Annu. Rev. Biochem., 2006, 75: 467-492.

[18] Gitai Z, Dye NA, Reisenauer A, et al. MreB actin-mediated segregation of a specific region of a bacterial chromosome[J]. Cell, 2005, 120(3): 329-341.

[19] Fenton AK, Gerdes K. Direct interaction of FtsZ and MreB is required for septum synthesis and cell division in[J]. The EMBO journal, 2013, 32(13): 1953-1965.

[20] Reimold C, Soufo HJD, Dempwolff F, et al. Motion of variable-length MreB filaments at the bacterial cell membrane influences cell morphology[J]. Molecular biology of the cell, 2013, 24(15): 2340-2349.

Expression and Localization of MreB in

WU Juan1, 2, JIN Chen-zhong1, HU Yi-hong1, HU Jun-he1, ZHU Xi-wu1, XU Hong2

(1. Institute of Agriculture and Biotechnology, Hunan University of Humanities, Science and Technology, Loudi 417000, China; 2. School of Life Sciences, Xiamen University, Xiamen 361102, China)Received：Oct. 9, 2015

spiral filament; linear filament;; cytoskeletal protein

To explore the function of MreB in morphogenesis of, we clonedgene into expression vector pGEX-6P-1 and expressed GST-tagged MreB in. The purified MreB protein was used to immunize mice to prepare polyclonal antibodies. No obvious differential expression of MreB was detectedby western blot analysis between the spiral filaments and linear forms of. Immunofluorescence analysis showed that MreB was distributed as a ring or double helix under the cell membrane. These results showed that MreB might not directly regulate the shapes of the cell. The helical MreB cytoskeletal protein directs the synthesis of lateral peptidoglycan by providing a track, therefore, it may affect the morphogenesis ofby the asymmetric distribution.

Q942.3

A

1000-3096(2016)07-0017-06

10.11759/hykx20140323003

2015-10-09;

2016-03-22;

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(40306024, 31301978); 湖南農(nóng)田雜草防控協(xié)同創(chuàng)新中心資助項(xiàng)目

[Foundation: National Natural Science Foundation of China, No.40306024, No.31301978; Hunan Provincial Collaborative Innovation Center for Farmland Weeds Control]

吳娟(1984-), 女, 湖南婁底人, 講師, 研究方向: 植物分子生物學(xué), E-mail: wujuan20022499@126.com;徐虹,通信作者, 電話(huà): 18959282580, E-mail: hxu@xmu.edu.cn

(本文編輯: 梁德海)