谷洋洋, 劉 冰, 杜 虹, 張?jiān)试? 秦 松

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高純度藻膽蛋白的分離純化研究進(jìn)展

谷洋洋1, 劉 冰2, 杜 虹1, 張?jiān)试?, 秦 松2

(1. 汕頭大學(xué)理學(xué)院生物系, 廣東汕頭 515041; 2. 中國(guó)科學(xué)院煙臺(tái)海岸帶研究所, 山東煙臺(tái) 264003)

藻膽蛋白在食品、化妝品等領(lǐng)域中具有廣泛的應(yīng)用前景, 同時(shí)也可以作為醫(yī)學(xué)研究中的熒光標(biāo)記物和氧化應(yīng)激疾病的潛在治療藥物。高純度藻膽蛋白的分離純化一直是國(guó)內(nèi)外的研究熱點(diǎn)。目前, 藍(lán)藻中的螺旋藻和紅藻中的微藻紫球藻是研究較多的材料, 龍須菜近年來的廣泛種植, 擴(kuò)大了原材料的來源。藻膽蛋白的粗提主要是由物理破碎和化學(xué)沉淀組成, 破碎的方法因原料的不同而具有一定的差異。高純度的藻膽蛋白獲取主要是通過離子交換, 疏水層析等方法, 這些方法耗時(shí)長(zhǎng), 回收率低; 雙水相萃取, 利凡諾沉淀, 殼聚糖和活性碳吸附沉淀為人們分離純化藻膽蛋白提供了新的思路。

藻膽蛋白; 提取原料; 粗提; 分離純化

藻膽蛋白(phycobiliprotein, PBP)是除葉綠素a之外的另一類光合色素蛋白, 存在于藍(lán)藻、紅藻、隱藻和少數(shù)甲藻中。根據(jù)藻膽蛋白紫外吸收光譜的特點(diǎn)藻膽蛋白可以分為三類: 藻藍(lán)蛋白(phycocyanin, PC, λmax610~620 nm), 別藻藍(lán)蛋白(allophycocyanin, APC, λmax650~655 nm)和藻紅蛋白(phycoerythrin, PE, λmax540~570 nm); 通常PE根據(jù)來源和光譜特性的不同又可分為B-PE, R-PE和C-PE[1]。藻膽蛋白是由脫輔基蛋白和以四毗咯為基本結(jié)構(gòu)的幾種色基組成, 其蛋白部分是一類寡聚蛋白, 基本構(gòu)建單位是和亞基, 在PE中還存在少量的亞基[2]。藻膽蛋白在光合作用中作為捕光色素系統(tǒng)進(jìn)行吸收和傳遞能量, 在藻體細(xì)胞中還作為儲(chǔ)存蛋白能夠使藻類在氮源缺乏的季節(jié)得以生存[3]。

藻膽蛋白作為一種水溶性的色素蛋白, 用途極為廣泛。一般合成的著色劑具有毒性和致癌等不安全因素, 因此藻膽蛋白做為天然色素可以廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)(糖果、口香糖、冰激凌、乳制品、軟飲料、芥末醬等), 在亞洲一些國(guó)家藻膽蛋白也被用于化妝品行業(yè)(眼臉膏、眼線膏、口紅); 藻膽蛋白尤其是PE具有吸收系數(shù)大, 熒光量子產(chǎn)率高, 斯托克位移寬, 穩(wěn)定性強(qiáng)等特性常做為熒光試劑應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)分析(流式細(xì)胞儀、熒光活細(xì)胞分選、熒光免疫分析、熒光顯微鏡等)[4-6]; 同時(shí)藻膽蛋白還是一種重要的生理活性物質(zhì), 如抗氧化, 抗腫瘤, 抗病毒, 提高人體免疫力等[7-14](如表1), 可制成食品和藥品用于醫(yī)療保健上; 此外, 藻膽蛋白也是一種最具有開發(fā)潛力的光敏劑, 可介導(dǎo)腫瘤光動(dòng)力學(xué)治療等[15]。

表1 藻膽蛋白生理特性和機(jī)制

Tab.1 Physiological property and mechanisms of phycobiliprotein

注: 此表是根據(jù)Eriksen等[7]修改后的表

藻膽蛋白在不同領(lǐng)域應(yīng)用時(shí)對(duì)其純度(Aλmax/ A280)要求不同[16-17], 一般純度大于0.7是食品級(jí), 大于3.0是醫(yī)藥級(jí), 大于3.9是反應(yīng)級(jí), 試劑級(jí)大于4.0。藻膽蛋白在不同領(lǐng)域中應(yīng)用時(shí), 因其純度要求不同, 所以藻膽蛋白的價(jià)格也不盡相同。2014年Sigma公司生產(chǎn)的試劑級(jí)R-PE的價(jià)格為1572.48元/mg, APC的價(jià)格為1233.76元/mg; C-PC(A620/A280>3.5)的價(jià)格為1590.03元/mg?；谠迥懙鞍纵^強(qiáng)的生理活性和熒光特性, 以及在其強(qiáng)大的經(jīng)濟(jì)利益驅(qū)動(dòng)下, 使藻膽蛋白尤其高純度的藻膽蛋白分離純化方法成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。

本文主要基于近年來已發(fā)表的文獻(xiàn)對(duì)高純度藻膽蛋白的分離純化方法的研究進(jìn)行了綜述, 以期為讀者提供一個(gè)完整的有關(guān)藻膽蛋白分離純化發(fā)展趨勢(shì)的構(gòu)架。

1 高純度藻膽蛋白的制備

用于分離純化藻膽蛋白的材料很多, 它們?cè)诩?xì)胞結(jié)構(gòu), 藻膽蛋白種類和含量等方面差別很大, 以至今日都沒有形成一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的方法來分離純化藻膽蛋白[5]。一般藻膽蛋白的分離純化流程為三步(圖1), 首先是植物組織體的破碎, 浸提獲得粗提液; 其次是粗提, 此步主要為進(jìn)一步的分離純化做準(zhǔn)備; 最后就是分離純化制備出高純度的藻膽蛋白。

1.1 提取原料

目前, 分離純化比較多的藻膽蛋白主要為來自于藍(lán)藻中的PC, APC及來自紅藻中R-PE和B-PE; 藍(lán)藻中的螺旋藻和紅藻中的微藻紫球藻是研究較多的材料[1, 18]。

螺旋藻自20世紀(jì)80年代初引入我國(guó), 經(jīng)過近30年的快速發(fā)展, 在我國(guó)螺旋藻養(yǎng)殖業(yè)已占據(jù)重要地位; 我國(guó)的沿海大部分地區(qū)和部分內(nèi)陸地區(qū)都有大規(guī)模的螺旋藻養(yǎng)殖基地。張學(xué)成等[19]統(tǒng)計(jì)我國(guó)螺旋藻養(yǎng)殖面積約750萬(wàn)m3, 養(yǎng)殖基地多達(dá)60余家, 年產(chǎn)量高達(dá)9600 t, 經(jīng)濟(jì)價(jià)值約40億元。螺旋藻當(dāng)中生物活性物質(zhì)含量多且比較豐富, 干細(xì)胞中蛋白質(zhì)的含量達(dá)到50%以上, 其中藻藍(lán)蛋白占10%~15%, 這為人們提取PC提供了充足的原材料。除此之外, Miyamoto等[20-23]利用,,,等來分離純化藻藍(lán)蛋白; Parmar等[24-27]從sp.A32DM,sp. KC45,和sp.中分別分離純化得到了高純度的C-PE。紅藻作為提取PE的主要原材料, 在我國(guó)也有廣泛的種植。紫球藻是我們分離純化PE的理想材料, 但其目前在我國(guó)還沒有取得大規(guī)模的種植; 而紅藻中的龍須菜在我國(guó)具有廣泛的種植。自2000年, 張學(xué)成等[28]選育的國(guó)家水產(chǎn)新品種“龍須菜良種981”在廣東汕頭南澳島示范栽培獲得成功以來, 龍須菜栽培面積不斷擴(kuò)大, 目前南澳龍須菜養(yǎng)殖已形成規(guī)?；? 平均達(dá)到5kg/m2, 養(yǎng)殖周期從原產(chǎn)地春秋兩季各45天延長(zhǎng)至5個(gè)月以上。全國(guó)龍須菜的栽培面積超過1.3萬(wàn)hm2, 年產(chǎn)量15萬(wàn)t干品, 成為繼海帶和紫菜之后第三大海藻栽培業(yè), 這為大規(guī)模分離純化PE提供了可能。Rossano等[29-31]從和等紅藻中也分離純化得到高純度的R-PE。

Zhao等[32]利用裂解酶(PecE和PecF)催化體外重組的藻藍(lán)蛋白亞基與藻藍(lán)膽素結(jié)合, 獲得了具有熒光特性的重組亞基。這使得轉(zhuǎn)基因和酶催化相結(jié)合的方法生產(chǎn)具有熒光活性的藻膽蛋白成為可能, 此方法為獲取藻膽蛋白提供了新的來源。

1.2 藻膽蛋白的粗提

藻膽蛋白是水溶性的胞內(nèi)蛋白, 要獲得高純度、高回收率的藻膽蛋白, 對(duì)藻體的破碎顯得尤為重要。目前用于藻體破碎的方法主要是物理法破碎。Gantar等[21-22, 33-36]將藻體在–20℃和4℃到30℃之間進(jìn)行反復(fù)凍融, 此方法利于蛋白溶出并且易于放大。Liao等[37-41]利用超聲波破碎的方法對(duì)藻體進(jìn)行破碎, 發(fā)現(xiàn)可以大大提高藻膽蛋白的溶出率, 但此方法不利于大規(guī)模制備藻膽蛋白, 并且生產(chǎn)的過程會(huì)產(chǎn)生熱量, 這對(duì)藻膽蛋白活性有很大影響, 應(yīng)用范圍有限。Patil等[42]利用從滲透壓破碎法破碎, 該操作簡(jiǎn)單, 是比較理想的細(xì)胞破碎法, 但該方法對(duì)處理的樣品有要求, 一般大型藻類很難直接運(yùn)用此方法對(duì)藻體進(jìn)行破碎。除此之外, 還有液氮研磨破碎等方法。上述方法都有一定的局限性, 實(shí)際生產(chǎn)中, 常常幾種方法經(jīng)常混合使用, 以最大的限度破碎使藻膽蛋白溶出。

破碎后的藻體按一定的物料比與不同的提取液混合浸提獲得藻膽蛋白的粗提液。由于此粗提液里常含有其他蛋白和多糖等成分, 一般在傳統(tǒng)的藻膽蛋白分離純化前多先經(jīng)過粗提, 傳統(tǒng)的粗提方法有(NH4)2SO4鹽析, 丙酮沉淀等[26], 進(jìn)年還來出現(xiàn)了利凡諾沉淀, 殼聚糖和活性碳吸附等新方法處理粗提液[33, 41-49], 為下進(jìn)一步的分離純化做準(zhǔn)備。

1.3 藻膽蛋白的分離純化

1.3.1 傳統(tǒng)分離純化藻膽蛋白的方法

對(duì)于不同藻類藻膽蛋白的分離純化方法有很多種(表2), 傳統(tǒng)上都是通過數(shù)次的羥基磷灰石柱層析結(jié)合離子交換層析或凝膠過濾層析來進(jìn)行的。

表2 不同藻類的藻膽蛋白分離純化方法比較

注: 1、細(xì)胞破碎(Cell disruption, CD): 液氮研磨(CD1), 超聲波破碎(CD2), 反復(fù)凍融(CD3), 滲透壓破碎法(CD4); 2、抽提(Extraction, E): 緩沖液(E1), 雙水相萃取(E2), 水抽提(E3); 3、沉淀(Precipitation, P): (NH4)2S04鹽析(P1), 利凡諾沉淀(P2), 丙酮沉淀(P3); 4、雜質(zhì)吸附(Impurity adsorption, A): 活性碳吸附(A1), 殼聚糖吸附(A2); 5、濃縮(Concentration, C): 透析(C1), 膜超濾(C2); 6、色譜層析(Chromatography, CH): 離子交換色譜(CH1), 凝膠層析(CH2), 膨脹床吸附層析(CH3), 羥基磷灰石層析(CH4), 疏水層析(CH5)

Miyamoto等[20]通過硫酸銨鹽析并結(jié)合羥基磷灰石柱層析對(duì)中的PC進(jìn)行純化, 獲得了純度超過大于4.0的PC; Liu等[31]用DEAE-Sepharose FF進(jìn)行PH梯度洗脫(pH 5.6~4.0), 最終獲得藻紅蛋白的純度達(dá)到5.6, 回收率達(dá)到67.33%。Mishra等[27]利用兩步色譜技術(shù)分離純化假魚腥藻中的C-PE, 首先將粗提液用硫酸銨分級(jí)鹽析(25%~60%); 然后用Sephadex G-150層析柱(35cm× 1 cm, 柱床高25cm)分離, 收集樣品; 最后用DEAE- cellulose層析柱進(jìn)行NaCl(0~0.5 mol/L)梯度洗脫, 洗脫速度為0.5 ml/min獲得的藻紅蛋白純度為6.8, 回收率為46%。膨脹床吸附技術(shù)也常常被用于分離純化藻紅蛋白, Bermejo等[49]探究了膨脹床結(jié)合離子交換技術(shù)對(duì)螺旋藻藻藍(lán)蛋白分離純化的效果, 并在不同水平上進(jìn)行了研究; 在實(shí)驗(yàn)室水平上, 其能夠獲得純度大于4.0, 回收率為69%的藻藍(lán)蛋白, 在中試水平上, 生產(chǎn)出來的藻藍(lán)蛋白純度大于4.0, 回收率為59%。

目前, 使用羥基磷灰石柱層析分離時(shí)間長(zhǎng), 易使蛋白變性; 而離子交換柱雖然成本高, 但有處理量大, 分離時(shí)間短, 效果好等特點(diǎn); 膨脹床吸附層析技術(shù)兼有流化床和填充床層析的優(yōu)點(diǎn), 不需預(yù)先除去料液中的顆粒而可以直接從料液中吸附目標(biāo)產(chǎn)物?，F(xiàn)多采用一步離子交換層析法, 并且常常是其他分離方法與離子交換相結(jié)合。

文獻(xiàn)中報(bào)道的藻膽蛋白常用提純方法在實(shí)際工業(yè)化生產(chǎn)過程中存在操作步驟復(fù)雜, 動(dòng)力能耗高以及操作周期長(zhǎng)等缺點(diǎn); 據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道, 分離純化的成本占產(chǎn)品成本的50%~90%[43], 此外, 由于步驟過多而導(dǎo)致產(chǎn)量損失大, 通常每增加一步層析過程目標(biāo)蛋白就會(huì)減少20%, 這對(duì)工業(yè)化生產(chǎn)來說成本無(wú)疑是十分昂貴的。因此, 一種高效, 經(jīng)濟(jì), 易于放大的分離純化方法對(duì)于生產(chǎn)高純度和高回收率的藻膽蛋白來說是十分必要的。

1.3.2 新型分離純化藻膽蛋白的方法

隨著技術(shù)的進(jìn)步, 近年來出現(xiàn)了一些分離純化藻膽蛋白的新方法, 如: 雙水相萃取法分離純化藻膽蛋白具有操作步驟少, 時(shí)間短, 回收率高等優(yōu)點(diǎn), 分離純化的同時(shí)還能使藻膽蛋白在一相中濃縮, 因此, 近年該方法獲得了許多學(xué)者的青睞。

Patil等[16, 43]采用12.28%的聚乙二醇和11.63%的磷酸鉀緩沖液形成的雙水相體系對(duì)藻膽蛋白進(jìn)行分離, 研究發(fā)現(xiàn), 在PH 7.2時(shí)萃取C-PC, 一次萃取后, 其純度從3.96提高到5.22, 經(jīng)雙水相萃取的C-PC再經(jīng) DEAE-Sephadex 離子交換柱純化, 達(dá)到6.69。對(duì)雙水相萃取過程進(jìn)行放大, 提取的C-PC純度為5.22, 回收率為66%, 證實(shí)了該方法具有現(xiàn)實(shí)可行性。后來, Patil等[40]研究了雙水相結(jié)合膜超濾技術(shù)分離純化新鮮螺旋藻的藻藍(lán)蛋白, 在PEG4000/磷酸鉀雙水相體系中, 當(dāng)系線長(zhǎng)度為18.64%, 相比1.45時(shí), 藻藍(lán)蛋白的純度由起始是的1.18 達(dá)到3.23, 別藻藍(lán)蛋白純度由0.41 升到0.74; 在經(jīng)過三步萃取后藻藍(lán)蛋白的純度達(dá)到了4.02, 最后作者利用膜超濾技術(shù)除鹽, 不僅將鹽除去, 而且別藻藍(lán)蛋白的純度由0.74升到了1.5, 回收率分別達(dá)到78.58%和51.73%。劉楊等[50]利用磷酸鉀-PEG6000雙水相體系同時(shí)分離純化APC和PC, 在pH 7.0系線長(zhǎng)度為34%的時(shí)候, PC和APC的純化系數(shù)分別為10.64和0.57, 此方法可以同時(shí)達(dá)到分離PC和APC的目的。

雙水相萃取技術(shù)具有原料豐富廉價(jià)、溶劑黏度小、易回收、傳質(zhì)和分相速度快、操作簡(jiǎn)單、設(shè)備要求低、節(jié)約能耗等優(yōu)點(diǎn), 已經(jīng)在眾多領(lǐng)域展現(xiàn)出工業(yè)化前景。但目前該技術(shù)在藻膽蛋白提純的工業(yè)化中還沒有被廣泛利用, 阻礙雙水相萃取技術(shù)走向工業(yè)化的最大問題是構(gòu)成雙水相成相組分的價(jià)格昂貴。隨著對(duì)雙水相體系研究的不斷深入, 性能優(yōu)良的新型成相物質(zhì)不斷發(fā)現(xiàn)以及相關(guān)技術(shù)的發(fā)展, 雙水相萃取技術(shù)必將在生物下游產(chǎn)業(yè)中起到越來越重要的作用[51]。

除了雙水相萃取之外, 利凡諾沉淀, 殼聚糖和活性碳吸附沉淀也為人們分離純化藻膽蛋白提供了新的思路。Minkova等[41]在細(xì)胞破碎液中加入利凡諾試劑反復(fù)沉淀重復(fù)4次得純度為3.90的C-PC。Minkova等[21]后來對(duì)該方法還對(duì)該法進(jìn)行改良, C-PC最終純度達(dá)4.52, 回收率為55.00%。Gantar等[33]向獲得的粗提液中加入活性炭和殼聚糖, 離心獲得的C-PC溶液純度為3.60, 隨后對(duì)C-PC溶液進(jìn)行鹽析和超濾最終純度達(dá)到4.30, 含量占干重的8.00%。

利凡諾沉淀, 殼聚糖和活性碳吸附沉淀分離純化藻膽蛋白能避免層析純化過程中的繁雜步驟, 提高了純化效率, 而且產(chǎn)量高, 成本低, 易于擴(kuò)大。

2 展望

藻膽蛋白是一種具有廣泛用途的活性物質(zhì), 當(dāng)前藻膽蛋白的應(yīng)用正由食品, 化妝品行業(yè)逐漸延伸到醫(yī)學(xué)診斷, 光療和藥物領(lǐng)域中去?，F(xiàn)已有公司在從事與藻膽蛋白相關(guān)的生產(chǎn), 2008年, Sekar和Chandramohan兩家公司就已經(jīng)有了297項(xiàng)與藻膽蛋白有關(guān)的專利[52]。我國(guó)擁有豐富的螺旋藻和龍須菜等海藻植物資源, 這為藻膽蛋白的來源提供豐富的原材料。但藻膽蛋白的分離純化過程較為繁雜, 回收率低, 耗時(shí)長(zhǎng), 目前還沒有一種高效的分離純化方法應(yīng)用到高純度藻膽蛋白的純化中去, 這使得高純度藻膽蛋白的大范圍使用受到了很大的限制, 如何開發(fā)出短時(shí)高效, 純度高和回收率高的提取純化技術(shù)仍然是今后研究的重點(diǎn)。

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The research progress on isolation and purification of high- purified phycobiliprotein

GU Yang-yang1, LIU Bing2, DU Hong1, ZHANG Yun-yun2, QIN Song2

(1. College of science, Shantou University, Shantou 515041, China; 2. Yantai institute of Coastal Zone Research, Chinese Academy of Sciences, Yantai 264003, China)Received：Oct. 12, 2015

phycobiliprotein; raw material; crude extract; isolation and purification

Phycobiliprotein has promising applications in nutrient ingredient and natural color for food and cosmetics. It is also used as potential therapeutic agent in oxidative stress-induced diseases and as fluorescent markers in biomedical research. Recently, more and more reseachs are concentrated on isolation and purification of high-purified phycobiliprotein. Currently,andare used primarily to extract phycobiliprotein. The extensive cultivation ofexpanded the sources of raw materials. Crude extract of phycobiliprotein is used by physical fragmentation and chemical deposition. Several methods have been developed for purification of phycobiliprotein such as ion exchange chromatography and hydrophobic interaction chromatography. However, theses methods are time consuming and the recovery of phycobiliprotein is low. Aqueous two phase extraction, rivanol precipitation, chitosan-active carbon adsorption and precipitation are the potential purification techniques.

Q949.2

A

1000-3096(2016)07-0170-08

10.11759/hykx20121216001

2015-10-12;

2016-03-09;

海洋公益性行業(yè)科研專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)資助(200905021, 201105008-9, 201205027); 廣東省中國(guó)科學(xué)院全面戰(zhàn)略合作項(xiàng)目(2011A090100040)

[Foundation: Public Science and Technology Research Funds Projects of the Ocean, No.200905021, No.201105008-9, No.201205027; Guangdong province comprehensive strategic cooperation project of the Chinese Academy of Sciences, No. 2011A090100040]

谷洋洋(1986-), 男, 安徽阜陽(yáng)人, 碩士研究生, 主要從事海洋天然活性物質(zhì)研究, 電話: 15914795189, E-mail: yygu-1022@126.com; 秦松,通信作者, 山東萊州人, 研究員, 博士, 主要從事海岸帶生物技術(shù)研究, E-mail: sqin@yic.ac.cn.

(本文編輯: 梁德海)