董　林，王艷萍，呂素芳,2，王金良,2，唐　娜,2，沈志強*

(1.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東濱州 256600；2.山東綠都生物科技有限公司，山東濱州 256600)

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豬恒定鏈的原核表達及其分子結(jié)構(gòu)與功能分析

董林1，2，王艷萍1，呂素芳1,2，王金良1,2，唐娜1,2，沈志強1，2*

(1.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東濱州 256600；2.山東綠都生物科技有限公司，山東濱州 256600)

為研究豬恒定鏈(Ii)分子結(jié)構(gòu)與功能，通過PCR擴增編碼完整Ii及其異構(gòu)體的基因片段，克隆至T pMD18-T載體，在對目的基因進行測序及分析其基因與編碼蛋白分子結(jié)構(gòu)，確定功能域及其分子遺傳變異的基礎(chǔ)上，構(gòu)建pET-32a-Ii重組載體，轉(zhuǎn)化BL21進行誘導表達，并分析表達產(chǎn)物的免疫活性。結(jié)果顯示，PCR擴增了645 bp和837 bp的Ii及其異構(gòu)體編碼基因，DNA序列分析其編碼氨基酸分別為215個和279個，異構(gòu)體Ii多出了64個氨基酸構(gòu)成的Tg區(qū)；分子結(jié)構(gòu)分析顯示，豬Ii分子由胞內(nèi)區(qū)、跨膜區(qū)和胞外區(qū)3部分組成，包含有內(nèi)體定位基元、Ii-key、CLIP、TRIM等功能域，其中內(nèi)體定位基元含有特征性L7I和PML17雙亮氨酸基序，Ii-key、CLIP、TRIM氨基酸序列與人和小鼠Ii具有高度一致性。遺傳變異分析表明，豬Ii分子與人、小鼠等哺乳動物的Ii同源性為62.7%～95.6%，與雞、鴨、鴿、鵝等禽類Ii的同源性為48.7%～49.5%；空間結(jié)構(gòu)分析顯示，豬Ii有3個相似的α-helix構(gòu)成，其間間隔由相似氨基酸構(gòu)成的2個轉(zhuǎn)角，轉(zhuǎn)角關(guān)鍵位點氨基酸具有高度一致性；Ii編碼基因在BL21細胞獲得了有效表達，目的蛋白大小約41 ku，Western blot和免疫熒光檢測顯示，表達產(chǎn)物具有良好的反應原性。試驗成功獲得了豬Ii及其異構(gòu)體編碼基因，明確了其功能區(qū)、分子遺傳變異等特征，誘導表達獲得了具有良好免疫活性的Ii重組蛋白，為進一步研究豬Ii分子結(jié)構(gòu)與功能奠定了基礎(chǔ)。

豬；恒定鏈；原核表達；分子結(jié)構(gòu)；功能分析

恒定鏈(invariant chain,Ii)在不同物種間表現(xiàn)為非多態(tài)性，屬Ⅱ型跨膜糖蛋白，其結(jié)構(gòu)由胞漿區(qū)、跨膜區(qū)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)區(qū)3部分構(gòu)成，包含內(nèi)體定位基元、CLIP、Ii-key、三聚體區(qū)、Tg區(qū)等功能結(jié)構(gòu)域[1-3]。作為MHCⅡ類分子重要的分子伴侶蛋白，Ii在確保MHCⅡ類分子正確折疊、組裝、維持空間結(jié)構(gòu)、內(nèi)體靶向轉(zhuǎn)運、抗原肽遞呈及B淋巴細胞成熟中發(fā)揮重要作用[4]。研究顯示，Ii作為多種免疫活性分子的相關(guān)受體，在機體免疫應答和免疫調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮多種作用[5]。近年來，對Ii作為MIF、幽門螺旋桿菌及CD74抗體的受體功能的相關(guān)研究逐年增加[6]。

Ii基因為單拷貝結(jié)構(gòu)，與MHCⅡ類分子組成型表達于多種細胞表面，包括T、B淋巴細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞和胸腺上皮細胞等，在腸道腫瘤細胞和乳腺上皮細胞表面也有表達[7]。由于mRNA轉(zhuǎn)錄和剪接方式不同，Ii在人類、小鼠、禽類等物種中均存在不同的異構(gòu)體，其中人類Ii存在p33、p41、p35和p43 4種異構(gòu)體，p33是主要的存在形式，由216個氨基酸殘基組成，p41、p43較p33和p35多出由外顯子6b編碼的Tg區(qū)，具有蛋白酶抑制功能，對確保外源性抗原的穩(wěn)定遞呈具有積極意義[8]。小鼠Ii存在p31和p41兩種形式異構(gòu)體。國內(nèi)學者研究確定，雞、鴨、鴿等物種的Ii也存在異構(gòu)體[9-10]。

基于Ii的DNA疫苗與多肽疫苗已成為近年疫苗研究的熱點。構(gòu)建以Ii為載體的靶向基因疫苗，能明顯增強疫苗的抗原遞呈效率。“C-末端添加”和“CLIP 替換”是現(xiàn)階段設(shè)計靶向性DNA疫苗的主要手段[11]。設(shè)計、構(gòu)建Ii-Key修飾的多肽疫苗可以為人類自身免疫性疾病、腫瘤和傳染病的免疫治療和預防提供新的思路。本試驗對豬Ii基因進行克隆、表達及分子結(jié)構(gòu)與功能分析，為深入研究豬Ii結(jié)構(gòu)、功能及新型疫苗設(shè)計奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

PyrobestTMDNA Polymerase、pMD T-18 Vector Cloning kit、DNA Marker DL 2 000、限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、XhoⅠ、DH5α、BL21感受態(tài)細胞,寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；高純度質(zhì)粒小量提取試劑盒、多功能DNA回收試劑盒，北京百泰克生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；NC膜、DAB顯色劑，北京天根生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；預染蛋白Marker，Thermo Scientific公司產(chǎn)品；pET-32a載體,山東省濱州獸醫(yī)生物技術(shù)實驗室保存。

1.2方法

1.2.1引物設(shè)計與合成根據(jù)山東省濱州獸醫(yī)生物技術(shù)實驗室克隆擴增Ii全基因序列和GenBank已知基因序列保守區(qū)，設(shè)計1對擴增豬Ii完整ORF的引物Ii-F1、Ii-R1；根據(jù)pET-32a酶切位點和Ii序列特性，設(shè)計1對表達Ii用引物Ii-F2、Ii-R2。具體引物序列見表1。

1.2.2目的基因PCR擴增以實驗室保存的T-Ii-1337 nt和Ii-1145 nt重組質(zhì)粒為模板，用合成的Ii-F1、Ii-R1，PCR擴增豬Ii不同異構(gòu)體基因完整編碼區(qū)基因片段。PCR反應體系：10×Pyrobest buffer Ⅱ 2.5 μL、dNTP Mixture 1.0 μL、Ii-F1/Ii-R1各1.0 μL，T-Ii-1337/1145 nt分別2.0 μL，ddH2O 17.0 μL，Pyrobest DNA Polymerase 0.5 μL，總體積25.0 μL。PCR擴增程序：94 ℃ 4 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 40 s，72 ℃ 40 s，35個循環(huán)；72 ℃ 10 min，4 ℃ 終止反應。PCR產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測分析結(jié)果。

表1　特異性擴增Ii基因PCR引物Table 1　The specific PCR primers for Ii gene amplification

1.2.3Ii編碼基因序列測定與分析用多功能DNA回收試劑盒分別回收Ii不同異構(gòu)體編碼基因PCR產(chǎn)物，16℃連接pMD T-18 Vector 3 h，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞，經(jīng)Amp+抗性篩選，重組質(zhì)粒酶切鑒定后，取陽性克隆提取質(zhì)粒，送上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司進行測序。測序結(jié)果用NCBI Blast在線進行同源性分析，用Clustalx v1.83、MEGA5.10軟件進行不同物種間Ii編碼蛋白遺傳進化分析。

1.2.4Ii分子功能區(qū)定位分析與結(jié)構(gòu)預測用Simple Modular Architecture Research Tool (http://smart.embl-heidelberg.de )、the Scan Prosite programs in the PROSITE database (http://ca.expasy.org/prosite)、Motif Scan (http://hits.isb-sib.ch/cgi-bin/PFSCAN) 等對功能區(qū)、信號肽及基序等進行推測，用Expasys translate tool ( http://www.expasy.org/ )進行結(jié)構(gòu)預測，與其他物種Ii 結(jié)構(gòu)進行同源性比對，理論模型由RasMol software (http://www.RasMol.org)演示和分析。

1.2.5表達Ii重組載體構(gòu)建與誘導表達以Ii-1145 nt重組質(zhì)粒為模板，用Ii-F2、Ii-R2引物PCR擴增，回收純化目的基因，BamHⅠ、XhoⅠ對目的基因和pET-32a同時進行雙酶切，回收純化后，T4 DNA Ligase連接4 h，轉(zhuǎn)化BL21(DM3)感受態(tài)細胞。經(jīng)Amp+、PCR和酶切鑒定篩選陽性菌落，接種LB培養(yǎng)基培養(yǎng)，添加IPTG進行目的基因誘導表達，SDS-PAGE電泳檢測蛋白表達情況。

1.2.6Ii重組蛋白純化及活性鑒定收集誘導后菌體，超聲破碎收集上清，His-Trap親和層析純化目的蛋白，SDS-PAGE分析純化效果。以純化的目的蛋白為抗原,采用Abnova公司的鼠抗豬Ii單抗為一抗，山羊抗鼠-HRP為二抗，Western blot分析表達的Ii蛋白的反應活性。以純化的Ii蛋白為抗原，免疫Balb/c小鼠，制備抗血清，收集、分離脾淋巴細胞，培養(yǎng)至48 h后，鋪制單層細胞，以小鼠抗Ii血清為一抗，山羊抗鼠-FITC為二抗，免疫熒光分析結(jié)果，鑒定制備的Ii抗體與脾淋巴細胞表達的Ii蛋白的反應活性。

由于出庫含沙量較建庫前相比偏小，可能將引起沿程懸沙和床沙的粗化現(xiàn)象發(fā)生。以武漢河段漢口站為例分析三峽蓄水運用前后懸移質(zhì)泥沙特征值變化情況，見表1。

2　結(jié)果

2.1Ii基因PCR擴增

用合成的Ii-F1、Ii-R1以T-Ii-1337 nt和T-Ii-1145 nt重組質(zhì)粒為模板，進行PCR擴增，瓊脂糖凝膠檢測顯示，分別在約645 bp和837 bp出現(xiàn)特異性目的條帶，說明成功擴增到Ii及其異構(gòu)體編碼基因(圖1和圖2)。

2.2陽性克隆篩選鑒定

回收Ii及其異構(gòu)體編碼基因PCR產(chǎn)物，連接T載體，挑取單菌落，菌液PCR鑒定顯示，分別擴增到約645 bp和837 bp特異性條帶(圖3)。提取PCR陽性質(zhì)粒DNA，BamHⅠ、XhoⅠ酶切鑒定顯示，分別獲得約645 bp和837 bp的條帶(圖4)。說明成功構(gòu)建了Ii及其異構(gòu)體編碼基因重組T克隆載體。

M.DNA標準DL 2 000;1.陰性對照;2～4.Ii基因PCR產(chǎn)物

M.DNA Marker DL 2 000;1.Negative control;2-4.PCR products of Ii gene

圖1豬Ii編碼基因PCR擴增

Fig.1PCR amplification of porcine Ii gene

1～3.Ii異構(gòu)體基因PCR擴增產(chǎn)物；4.陰性對照；M.DNA標準DL 2 000

1-3.PCR products of Ii isomer gene;4.Negative control;M.DNA Marker DL 2 000

圖2豬Ii異構(gòu)體編碼基因PCR擴增

Fig.2PCR amplification of porcine Ii isomer gene

M.DNA標準DL 2 000;1～3.Ii-645 nt PCR擴增;4～5.Ii-837 nt PCR產(chǎn)物;6.陰性對照

M.DNA Marker DL 2 000;1-3.PCR products of 645 nt;4-5.PCR products of 837 nt;6.Negative control

圖3菌液PCR鑒定結(jié)果

Fig.3Results of PCR identification of bacterial fluid

1.Ii-837 nt重組質(zhì)粒；2.空質(zhì)粒;3.Ii-645 nt重組質(zhì)粒;4.空質(zhì)粒:M.DNA標準 DL 15 000

1.pMDTM-T18-Ii-837 plasmid;2.T18-vectot;3.pMDTM-T18-Ii-645 plasmid;4.T18-vectot;M.DNA Marker DL 15 000

圖4酶切鑒定結(jié)果

Fig.4Results of enzyme digestion identification

2.3編碼Ii DNA測序結(jié)果

DNA測序獲得645 nt和837 nt兩種基因序列，分別編碼215個和279個氨基酸序列，其中Ii-837較Ii-645多出192個堿基序列，編碼64個氨基酸，構(gòu)成Ii異構(gòu)體Tg區(qū)(圖5)。同源性分析顯示，Ii在不同物種間表現(xiàn)出高保守性，其中豬Ii與人、小鼠和牛等哺乳類物種的Ii間有62.7%～95.6%的同源性，與雞、鴨、鴿、鵝等禽類Ii的同源性為48.7%～49.5%，與樹蛙、斑馬魚等低等物種Ii的同源性較低，僅為25.8%～3.04%。用Clustalx v1.83、MEGA5.10分析結(jié)果顯示，不同物種Ii基因及其編碼氨基酸具有同源性，其中編碼內(nèi)體定位基元、Ii-key區(qū)、CLIP區(qū)和三聚體區(qū)等關(guān)鍵功能區(qū)氨基酸高度保守，同源性越接近的物種，其Ii越具有相似的特征性編碼氨基酸序列，保證了Ii在免疫遞呈通路穩(wěn)定發(fā)揮作用。

2.4豬Ii分子功能區(qū)分析

Smart軟件在線分析顯示，豬Ii胞內(nèi)區(qū)由1-30位氨基酸組成，含有L7I和PML172個內(nèi)體定位基元；跨膜區(qū)由31-56位氨基酸組成，為Ii保守性最強區(qū)域；胞外區(qū)由57-214位氨基酸組成，包含L77RMK80構(gòu)成的Ii-key區(qū)、81-104位氨基酸構(gòu)成的CLIP區(qū)，118-192位氨基酸構(gòu)成的TRIM區(qū)，其中Ii異構(gòu)體在TRIM區(qū)多出Tg區(qū)。ScanProsite (Applied Biosystems)軟件分析發(fā)現(xiàn)，在122-125位點有1個N-糖基化位點，Motif Scan software 未發(fā)現(xiàn)信號肽序列。

圖5　豬Ii及其異構(gòu)體主要結(jié)構(gòu)域氨基酸序列

2.5Ii分子結(jié)構(gòu)預測

應用SWISS-MODLR在線數(shù)據(jù)庫，對人、小鼠、豬、雞、鴨等5個物種Ii部分氨基酸序列進行3-D結(jié)構(gòu)建模結(jié)果顯示，不同物種間Ii的空間構(gòu)型具有高相似度，其中人、小鼠、豬、雞、鴨等物種的都有3個相似的α-helix構(gòu)成，其間間隔由相似氨基酸構(gòu)成的2個轉(zhuǎn)角，轉(zhuǎn)角關(guān)鍵位點氨基酸具有高度一致性(圖6)。

A.雞；B.鴨；C.豬；D.小鼠；E.人類

2.6Ii重組蛋白表達與純化

從Ii-1145 nt重組質(zhì)粒亞克隆獲得了約645 bp特異性目的基因片段(圖7)。菌液PCR鑒定，PCR產(chǎn)物在約645 bp出現(xiàn)特異性目的條帶(圖8)。重組質(zhì)粒經(jīng)酶切鑒定出現(xiàn)約5 900 bp和645 bp特異性條帶(圖9)。DNA序列測定證實，成功構(gòu)建了表達載體pET-32a-Ii，無堿基缺失或突變發(fā)生。轉(zhuǎn)化BL21(DM3)感受態(tài)細胞，進行體外誘導表達，SDS-PAGE電泳顯示，在約41 ku處有特異性目的條帶，與預期大小相符，表明目的基因獲得有效表達(圖10)。His-Trap親和層析純化后，重組Ii蛋白純度可達90%以上，滿足免疫抗原純度要求(圖11)。

1.陰性對照;2.Ii基因PCR產(chǎn)物;M.DNA標準DL 2 000

1.Negative control;2.PCR products of Ii gene;M.DNA Marker DL 2 000

圖7Ii基因PCR擴增

Fig.7 PCR amplification of Ii gene

2.7Ii免疫活性鑒定

Western blot顯示，Ii重組蛋白與鼠抗豬Ii單抗，在約41 ku處出現(xiàn)特異性顯色條帶(圖12)，說明重組Ii蛋白與鼠Ii單抗具有良好的反應性。免疫熒光檢測顯示，脾淋巴細胞上出現(xiàn)清晰的綠色熒光信號，強熒光信號主要集中在脾淋巴細胞的細胞質(zhì)，說明以純化的Ii重組蛋白為抗原制備的抗體與脾淋巴細胞表達的Ii分子能發(fā)生良好的免疫反應(圖13)。

M.DNA標準DL 2 000;1.陰性對照;2～4.Ii基因PCR產(chǎn)物

M.DNA Marker DL 2 000;1.Negative control;2-4.PCR products of Ii gene

圖8菌液PCR鑒定

Fig.8Identification of bacteria liquid by PCR

1.pET-32a-Ii重組質(zhì)粒2.pET-32a質(zhì)粒;M.DNA標準 DL 15 000

1.pET-32a-Ii；2.pET-32a;M.DNA Marker DL 15 000

圖9pET-32a-Ii酶切鑒定

Fig.9Identification of pET-32a-Ii by enzyme digestion

1.未誘導pET-32a-Ii;2～3.誘導pET-32a-Ii;M.蛋白分子質(zhì)量標準(低);4.未誘導pET-32a;5.誘導pET-32a

1.Non induced pET-32a-Ii;2-3.Induced pET-32a-Ii;M.Protein molecular weight Maker(Low)；4.Non induced pET-32a;5.Induced pET-32a

圖10Ii重組蛋白的誘導表達

Fig.10Induced expression of Ii recombinant proteins

1.誘導的pET-32a-Ii;2～5.純化的Ii重組蛋白;M.蛋白分子質(zhì)量標準(低)

1.Induced pET-32a-Ii;2-5.Purified Ii recombinant proteins;M.Protein molecular weight Maker(Low)

圖11Ii重組蛋白純化

Fig.11Purification of Ii recombinant proteins

M.蛋白分子質(zhì)量標準(低);1.陰性對照;2.Ii重組蛋白

M.Protein molecular weight Maker(Low);1.Negative control;2.Ii recombinant protein

圖12Ii蛋白Western blot鑒定

Fig.12Identification of Ii protein by Western blot

A.單層淋巴細胞；B.單個淋巴細胞

A.Monolayer lymphocytes;B.Single lymphocyte

圖13脾淋巴細胞表達的Ii免疫熒光檢測

Fig.13Immunofluorescence assay of Ii expression by splenic lymphocytes

3　討論

研究表明，Ii作為MHCⅡ類分子的分子伴侶組成型表達于B淋巴細胞、單核-巨噬細胞和樹突狀細胞等多種抗原遞呈細胞，在免疫應答中發(fā)揮重要作用；同時，Ii作為一種新型免疫因子，在炎癥反應、抗菌機制中也起到一定作用[12]。關(guān)于Ii分子的研究主要集中在人和小鼠的Ii分子上，對豬Ii分子特征、功能及其結(jié)構(gòu)等國內(nèi)外研究不多[13]。我們獲得了豬Ii及其異構(gòu)體編碼基因，編碼215個和279個氨基酸殘基，其中異構(gòu)體Ii多了64個氨基酸殘基組成的Tg區(qū)，這與已報道的人、小鼠、雞、鴨等Ii異構(gòu)體基因結(jié)構(gòu)類似。結(jié)構(gòu)分析表明，豬Ii分子分為胞內(nèi)區(qū)、跨膜區(qū)和胞外區(qū)3個結(jié)構(gòu)域，包含內(nèi)體定位基元、Ii-key區(qū)、CLIP區(qū)和三聚體區(qū)等功能區(qū)，其中L7I和PML17內(nèi)體定位基元與已知其他物種的Ii存在2個Leu靶向基序高度一致，表明豬Ii也可能存在基于該基序的定位功能。

空間結(jié)構(gòu)分析表明，豬Ii三聚體區(qū)具有3個相似的α-helix構(gòu)成，其間隔為由相似氨基酸構(gòu)成的2個轉(zhuǎn)角，這也與人Ii結(jié)構(gòu)高度相似，說明豬Ii三聚體區(qū)也具有通過自身三聚體化調(diào)節(jié)和維持MHCⅡ類分子結(jié)構(gòu)的功能[14-15]。遺傳進化分析顯示，不同物種Ii分子保持高度同源性，特別是維持Ii分子空間構(gòu)型和功能的關(guān)鍵氨基酸位點非常保守，這也說明在長期的物種進化過程中，作為免疫系統(tǒng)重要組成分子的Ii在免疫壓力下維持了結(jié)構(gòu)的一致性。

本研究構(gòu)建了表達豬Ii分子的表達載體pET-32a-Ii，目的蛋白在BL21細胞獲得了有效表達，大小約41 ku，經(jīng)Western blot和免疫熒光檢測，具有良好的反應原性，與國內(nèi)學者的報道一致[16]，說明表達的重組Ii蛋白具有免疫活性。免疫熒光檢測顯示，制備的抗豬Ii抗體與脾淋巴細胞內(nèi)天然表達的Ii蛋白能發(fā)生明顯反應，表明制備的Ii抗體具有良好的免疫活性。

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Prokaryotic Expression of Porcine Ii and Analysis of Its Molecular Structure and Function

DONG Lin1,2,WANG Yan-ping1,Lü Su-fang1,2,WANG Jin-liang1,2,TAN Na1,2,SHEN Zhi-qiang1,2

(1.BinzhouAnimalScienceandVeterinaryMedicineInstitudte,Binzhou,Shandong,256600,China;2.ShandongLvduBio-Sciences&TechnologyCo.Ltd,Binzhou,Shandong, 256600,China)

The molecular structure and function of porcine Ii were researched by PCR amplification of Ii and its isomers conding cDNA,which the gene fragment was cloned into T-Vector for DNA sequence.The gene and encoding protein molecular structure were analyzed and the functional domain and its molecular genetic variation were detemined.The expression vector of pET-32a-Ii was constructed and transformed into BL21 that was induced for protein expression, and the immune activity of protein was analyzed.The results showed that the complete genes of porcine invariant chain and its isomer were 645 nt and 837 nt respectively,each coding 215 aa and 279 aa.Compared to the invariant chain,the isomer had an extra Tg domain encoded by 64 aa.Molecular structure analysis predicted that the porcine invariant chain had intracellular, transmembrane and extracellular zones which included several function domains such as inner body positioning element,Ii-key,CLIP and TRIM.The inner body positioning element had distinctive dual leucine motifs L7I and PML17,and all the amino acid sequences of Ii-key,CLIP,TRIM showed high consistencies with human and mouse Ii.The genetic variation analysis illustrated that porcine invariant chain was 62.7%-95.6% homologous to human or mouse invariant chain,and 48.7%-49.5% to chicken,duck,dove,goose and other birds.The porcine invariant chain was composed of three similar α-helixes,spaced with two corners which had highly similar amino acids.The 41 ku recombinant protein was also effectually expressed in BL21 cells,showed good reactivity in Western blot and IFA tests.The present study will provide useful information for the further study of porcine invariant chain molecular structure and function.

pig;invariant chain;prokaryotic expression;molecular structure;function analysis

2016-01-29

山東省自然科學基金項目(ZR2013CQ006)

董林(1980-)，男，安徽阜陽人，助理研究員，博士，主要從事動物免疫學研究。*通訊作者

S852.42;Q513.2

A

1007-5038(2016)10-0064-06