陸繼爽，黃天鵬，吳　咪，賀海燕，格日勒圖

(內蒙古農(nóng)業(yè)大學獸醫(yī)學院，內蒙古呼和浩特 010018)

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多型FMDV VP1表位嵌入型載體pMG-SLPMultiVP1的構建及其表達產(chǎn)物鑒定

陸繼爽，黃天鵬，吳咪，賀海燕，格日勒圖*

(內蒙古農(nóng)業(yè)大學獸醫(yī)學院，內蒙古呼和浩特 010018)

構建出表達載體pMG-SLPMulti VP1，并對其進行雙酶切鑒定及PCR鑒定。將陽性重組質粒轉入到發(fā)酵乳桿菌中進行表達，并對表達產(chǎn)物進行SDS-PAGE、Western blot和IFAT鑒定。多型FMDV VP1表位嵌入的SLPMulti VP1融合基因成功克隆入穿梭質粒pMG36e中，其表達產(chǎn)物大小約為35 ku,部分表達產(chǎn)物位于發(fā)酵乳桿菌表面。成功構建了一個乳桿菌嵌入型表達載體pMG-SLPMulti VP1,為以發(fā)酵乳桿菌為活菌載體的表位疫苗研究奠定了基礎。

多型口蹄疫病毒；VP1表位；S-層蛋白；發(fā)酵乳桿菌；表位疫苗

口蹄疫(Foot-and-mouth disease，F(xiàn)MD)是一種高度接觸性傳染病，危害豬、牛、羊和鹿等包括野生動物在內的70多種偶蹄動物[1]。FMD的病原是口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus，F(xiàn)MDV )，屬于小RNA病毒科口蹄疫病毒屬成員。該病毒衣殼由VP1、VP2、VP3和VP4共4種結構蛋白組成，其中VP1蛋白主導病毒與細胞的吸附，還是誘導宿主產(chǎn)生中和抗體的主導抗原[2-5]，所以VP1蛋白是研究FMDV表位疫苗的首選[6]。

在發(fā)展中國家，預防FMD一直以來都應用滅活疫苗[7]。由于FMDV各型之間沒有交叉保護，所以在疫苗使用的實踐中發(fā)現(xiàn)，用滅活疫苗難以完全應對FMD的挑戰(zhàn)。加之滅活疫苗對病毒純度和生產(chǎn)條件要求極高(如滅活不完全，甚至有引發(fā)疫情的潛在風險)[8-9]，所以研制新型疫苗已經(jīng)成為FMD疫苗研究的熱點。尤其是表位疫苗，由于其分子結構小、操作簡單并且可以研制多價苗、聯(lián)苗等特點而受到國內外研究者廣泛的關注[10]。

S-層蛋白(S-layer protein，SLP)已在400多種細菌及古細菌細胞壁表面發(fā)現(xiàn)，它是一種由單分子蛋白亞基構成的疏水性堿性蛋白[11]，而且還是使細菌黏附到細胞表面的關鍵[12]。它能在菌體表面自主形成納米級規(guī)則晶格的單分子表面保護層，且通過非共價鍵形式與細胞壁相連[13-14]。S-層蛋白這種黏附性和形成納米級晶格的特點被應用到許多研究當中[15-16]，在分子納米技術、仿生學和醫(yī)學等領域都具有廣泛的應用前景。

本研究將A型、O型和Asia 1型FMDV的VP1特定表位基因嵌入到發(fā)酵乳桿菌S-層蛋白當中，構建出乳桿菌表達載體pMG-SLPMultiVP1，并轉化到發(fā)酵乳桿菌中進行表達，應用SDS-PAGE、Western blot以及IFAT鑒定其表達產(chǎn)物。本研究為進一步研究各型FMDV VP1表位基因嵌入型多價表位疫苗奠定基礎。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株與質粒大腸埃希菌DH5α、表達載體pMG36e、發(fā)酵乳桿菌(Lactobacillusfermentum)；鼠源多型FMDV(A、O和Asia 1型)高免血清；重組質粒pMD-SLPM ultiVP1，均由內蒙古農(nóng)業(yè)大學獸醫(yī)學院分子生物平臺工程菌實驗室制備或保存。

1.1.2試劑T4 DNA連接酶，New England Biolabs公司產(chǎn)品；DNA Marker DL 5 000、限制性內切酶SacⅠ、Hind Ⅲ、蛋白分子質量標準及PCR相關試劑，寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；AxyPrep質粒小量提取試劑盒、AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒，康寧生命科學有限公司產(chǎn)品；紅霉素，Sigma公司產(chǎn)品；牛源多型FMDV(A、O和Asia 1型)疫苗株陽性血清，中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所提供；兔抗牛IgG-HRP，北京博奧森生物技術有限公司產(chǎn)品；Alexa Fluor 488標記驢抗鼠IgG，Jackson Immuno Research產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1引物及其合成引物序列如下：PF：5′ -CCGAGCTCGTGAAAAAAAAGATTATCTCAGCTA-3′;PR：5′- ATGAAGCTTTTATAGTTCGCGACGA-3′。引物由上海桑尼生物工程有限公司合成。

1.2.2重組表達載體pMG-SLPMultiVP1的構建應用PF和PR引物，以含有Usp45-SLP-VP1基因的重組質粒pMD-SLPMultiVP1為模板，進行PCR擴增。PCR反應條件為：94℃ 5 min；94℃ 1 min，56℃ 1 min，72℃ 1 min，共30個循環(huán)；72℃ 10 min。

將PCR產(chǎn)物SLPMultiVP1及表達載體pMG36e分別用限制性內切酶SacⅠ、Hind Ⅲ酶切，10 g/L瓊脂糖凝膠電泳。用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒純化SLPMultiVP1 DNA片段和pMG36e酶切產(chǎn)物，用T4連接酶將兩膠回收產(chǎn)物進行黏性末端連接。連接體系(10 μL)：SLPMultiVP1基因3.0 μL，pMG36e載體1.0 μL，T4 DNA連接酶1.0 μL ，10×T4 DNA連接酶buffer 1.0 μL，ddH2O 4.0 μL。4℃連接過夜。連接產(chǎn)物轉化至大腸埃希菌DH5α中，并在含200 μg/mL紅霉素的普通LB固體培養(yǎng)基上進行陽性克隆篩選。

1.2.3重組質粒pMG-SLPMultiVP1的鑒定挑取陽性克隆菌落，接種至含紅霉素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，用AxyPrep質粒小量提取試劑盒提取重組質粒pMG-SLPMultiVP1。隨后對重組質粒進行PCR和雙酶切鑒定，各取5 μL PCR產(chǎn)物和酶切產(chǎn)物，10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.4重組質粒pMG-SLPMultiVP1的電轉化

1.2.4.1發(fā)酵乳桿菌感受態(tài)細胞的制備將發(fā)酵乳桿菌單菌落接到5 mL MRS液體培養(yǎng)基中，37℃靜置培養(yǎng)過夜后，接種2 mL于100 mL含25 g/L甘氨酸的SMRS(含0.5 mol/L蔗糖)培養(yǎng)基中，37℃靜置培養(yǎng)，每隔2 h取樣，監(jiān)測其OD 600 nm，直至達到0.4～0.6。隨后將菌液冰浴20 min，6 000 r/min離心10 min，用預冷的PB(0.5 mol/L蔗糖、100 mL/L甘油)緩沖液洗滌3次后，再用8 mL PB緩沖液重懸，200 μL分裝至1.5 mL離心管，用液氮速凍，置于-80℃冰箱保存。

1.2.4.2重組質粒以及pMG36e質粒的電轉化將發(fā)酵乳桿菌感受態(tài)細胞從-80℃冰箱中取出置于冰上，待融化后分別加入1 μL 重組質粒pMG-SLPMultiVP1和pMG36e質粒，混勻后冰浴20 min，將其分別加入預冷的電轉化杯中。電轉化條件為：電壓2.4 kV，時間4 ms。電擊完畢后迅速將電轉化產(chǎn)物加入到1 mL SMRS(含MgCl2和CaCl2)復蘇培養(yǎng)基中，37℃溫浴2 h～3 h。4 000 r/ min離心5 min，取200 μL上清，其余上清棄掉，懸浮沉淀菌體，涂布于含10 μg/mL紅霉素的MRS固體平板上，在37℃恒溫培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)36 h～48 h。

1.2.5發(fā)酵乳桿菌中pMG-SLPMultiVP1表達及其鑒定

1.2.5.1SDS-PAGE及Western blot鑒定挑取含重組質粒pMG-SLPMultiVP1以及pMG36e質粒的發(fā)酵乳桿菌可疑菌落，接種于含紅霉素的MRS液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)36 h～48 h。12 000 r/min離心3 min收集菌體，加入1×SDS上樣緩沖液懸浮混勻，煮沸5 min，冰浴5 min，12 000 r/min離心5 min，取上清進行SDS-PAGE電泳。以牛源多型FMDV疫苗株陽性血清作為一抗，兔抗牛IgG-HRP為二抗，ECL顯色法對表達產(chǎn)物進行Western blot檢測。

1.2.5.2IFAT鑒定將培養(yǎng)好的發(fā)酵乳桿菌4℃ 5 000 r/min離心5 min，棄凈培養(yǎng)基，用PBS清洗2次菌體后，反復稀釋，調節(jié)菌濁度OD 600 nm至1.0。取干凈的載玻片(鏡檢無雜物)，加30 μL多聚賴氨酸，常溫靜置30 min，吸去多余液體后，加入40 μL調好的菌液，靜置20 min，再吸去多余菌液，加40 g/L多聚甲醛20 μL，常溫靜置15 min，PBS洗1次，加1∶100(V/V)稀釋的一抗(鼠源多型FMDV高免血清)20 μL，常溫避光作用45 min，PBS洗2次，之后再加20 μL 1∶100(V/V)稀釋的熒光標記二抗(Alexa Fluor 488標記驢抗鼠IgG)，常溫避光作用30 min，PBS洗3次，最后用熒光顯微鏡觀察菌體發(fā)光情況，拍照留存。

2　結果

2.1SLPMultiVP1設計

該融合基因SLPMultiVP1包含信號肽、SLP、VP1型特異性表位基因(A、O、Asia Ⅰ)以及葡萄球菌A蛋白(Staphylococcalprotein A，SPA)的細胞膜上錨定部分，簡稱LPXTG。該嵌入基因組成結果如圖1所示。

2.2重組質粒pMG-SLPMultiVP1的PCR及雙酶切鑒定

PCR擴增出約900 bp特異性SLPMultiVP1基因片段，與預期結果一致(圖2)，這也進一步證明了目的基因插入方向是正確的。

用限制性內切酶SacⅠ和Hind Ⅲ雙酶切重組質粒得到2個片段，大小分別約為3 600 bp和900 bp，大片段為載體片段，小片段為目的基因片段。這表明目的基因已正確插入到表達載體pMG36e中。

圖1　pMG-SLPMultiVP1設計結果

M.DNA 標準DL 5 000;1.重組質粒pMG-SLPMultiVP1；2.重組質粒PCR產(chǎn)物；3.重組質粒酶切(SacⅠ/Hind Ⅲ)產(chǎn)物

M.DNA Marker DL 5 000;1.Recombinant plasmid pMG-SLPMultiVP1；2.PCR products of recombinant plasmid pMG-SLPMultiVP1；3.Products of recombinant plasmid pMG-SLPMultiVP1 digested bySacⅠandHind Ⅲ

圖2重組質粒PCR及雙酶切鑒定

Fig.2Identification of recombinant plasmid pMG-SLPMultiVP1 by PCR and double enzyme digestion

2.3SLPMultiVP1蛋白在發(fā)酵乳桿菌中的表達及鑒定

2.3.1SDS-PAGE和Western blot試驗結果SDS-PAGE結果表明，重組發(fā)酵乳桿菌在35 ku處未出現(xiàn)明顯的可疑條帶，可能是因為該重組蛋白與發(fā)酵乳桿菌的某個菌體蛋白大小接近，條帶與其重合(圖3)或重組蛋白分子質量大小發(fā)生變化。

應用ECL顯色法，將發(fā)酵乳桿菌表達產(chǎn)物與多型FMDV疫苗株血清進行Western blot檢測，顯色結果顯示，F(xiàn)MDV陽性血清識別的蛋白條帶有2條，分子質量分別為70 ku和35 ku，70 ku的條帶恰好為理論值的2倍，而對照組則未出現(xiàn)任何可疑條帶(圖3)。

2.3.2IFAT結果將按1.2.5.2方法處理好的2個載玻片(一個樣品含pMG-SLPMultiVP1質粒，另一樣品含pMG36e)分別置于熒光顯微鏡下觀察，結果發(fā)現(xiàn)，重組發(fā)酵乳桿菌(含pMG-SLPMultiVP1質粒)出現(xiàn)了較強的綠色熒光(圖4A)，但對照的發(fā)酵乳桿菌(含pMG36e質粒)則沒有相應的熒光(圖4C)。此外，不激發(fā)熒光觀察時發(fā)現(xiàn)，重組發(fā)酵乳桿菌與對照組比較黏附性明顯增強，菌體相互黏附在一起(圖4B和圖4D)。

M.蛋白分子質量標準；1.SLPMultiVP1蛋白表達；2.pMG36e空載體;3～4.SLPMultiVP1蛋白表達；5～6.PMG36e空載體

M.Protein molecular weight Marker;1.SLPMultiVP1 protein expression；2.pMG36e empty vector;3-4.SLPMultiVP1 protein expression；5-6.pMG36e empty vector

圖3表達產(chǎn)物的SDS-PAGE(左)和Western blot(右)分析結果

Fig.3SDS-PAGE(Left) and Western blot(Right) analysis results of the expressed products

A.重組乳桿菌激發(fā)熒光；B.重組乳桿菌未激發(fā)熒光；C.對照組激發(fā)熒光；D.對照組未激發(fā)熒光

A.Fluorescent recombinantLactobacillus;B.Non-fluorescent recombinantLactobacillus; C.Fluorescent control group;D.Non-fluorescent control group

圖4IFAT結果

Fig.4The results of IFAT

3　討論

目前，正在使用和研究的FMD疫苗主要有滅活疫苗和新型基因疫苗(表位肽疫苗等)兩類。FMD滅活疫苗主要是把田間毒株經(jīng)病毒培養(yǎng)擴增和滅活劑處理后再添加佐劑制成的[17]。隨著生產(chǎn)技術不斷發(fā)展，人們用超濾法濃縮抗原，取代氯仿處理或氫氧化鋁凝膠吸附[18]；用二乙酰亞胺(BEI)取代甲醛對FMDV進行滅活[19]。雖然提高了FMD滅活疫苗的生產(chǎn)效率和安全性，但是FMD滅活疫苗還存在熱穩(wěn)定性差、免疫周期短、滅活不徹底可能會使病毒擴散等危險。為了克服這些問題，表位肽疫苗等新型基因疫苗應運而生。根據(jù)諸多報道，VP1蛋白是誘導機體產(chǎn)生免疫反應的主要蛋白之一，而許多表位疫苗的免疫原性就是基于其能遞呈VP1蛋白G-H環(huán)上關鍵抗原表位[5]。Hua B等[20]把在霍亂毒素B亞單位(CT-B)的桿狀細菌(Bacillussubtilis)插入并表達了Asia 1型FMDV 的抗原表位，構建成功1A751/CTB-TepiAs重組菌可飼疫苗。結果顯示，對豚鼠加強免疫后能夠保護豚鼠抵抗FMDV的攻擊。本研究成功構建pMG-SLPMultiVP1載體，將FMDV多型表位嵌入到S-層蛋白質中，利用發(fā)酵乳桿菌作為活菌載體，分泌表達的靶基因產(chǎn)物SLPMultiVP1融合蛋白則能錨定在乳桿菌表面。其主要特點為表達產(chǎn)物不需要進行純化，乳桿菌活菌攜帶這些表位，經(jīng)口服后直接到達胃腸道淋巴細胞產(chǎn)生有效的免疫應答，其中S-層蛋白具有加強黏附作用和潛在的佐劑效應。

在本試驗結果中，F(xiàn)MDV嵌入型蛋白SLPMultiVP1的理論值約為35 ku(含信號肽約為2 ku)。然而在SDS-PAGE結果中，相應位置未出現(xiàn)明顯目的條帶，可在Western blot結果中發(fā)現(xiàn)，約在70 ku和35 ku處出現(xiàn)特異性反應條帶，而對照組相應位置未出現(xiàn)反應條帶，其中70 ku恰好是理論值的2倍，可能為目的蛋白的二聚體。嵌入型蛋白SLPMultiVP1的二聚體形成的原因尚還不清楚，與S-蛋白的疏水性氨基酸殘基相互作用還是融合蛋白的特性所致的，需要進一步試驗來證實。而在IFAT中，含重組質粒的發(fā)酵乳桿菌與對照組(含有pMG36e)相比較，大多數(shù)乳桿菌明顯聚集在一起(圖4B)，表明發(fā)酵乳桿菌的黏附性加強，該結果提示，SLP蛋白可能部分表達在發(fā)酵乳桿菌表面上，相繼試驗中激發(fā)熒光后，試驗組一部分菌明顯發(fā)光，而對照組則不發(fā)光，但是試驗組發(fā)光者數(shù)量不多，其原因有以下三點：①pMG36e載體是非誘導型載體，表達水平有限；②pMG36e載體在發(fā)酵乳桿菌中表現(xiàn)為低拷貝；③SLP蛋白的折疊可能影響FMDV部分表位與疫苗株陽性血清的有效結合。

本試驗選擇穿梭質粒pMG36e為表達載體，構建了pMG-SLPMultiVP1，并成功在發(fā)酵乳桿菌中進行表達，為今后多型FMDV表位疫苗的研制奠定了基礎。

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Construction of Multi-type FMDV VP1 Epitope Embedded Vector pMG-SLPMultiVP1 and Identification of Its Expressed Products

LU Ji-shuang，HUANG Tian-peng，WU Mi，HE Hai-yan，Geriletu

(CollageofVeterinaryMedicine,InnerMongoliaAgricultureUniversity,Hohhot,InnerMongolia,010018,China)

In this paper,the expression vector pMG-SLPMultiVP1 was constructed and identified by method of double enzyme digestion and PCR.The positive recombinant plasmid was transformed intoLactobacillusfermentum and the expression of SLPMulti VP1 fusion protein was confirmed by SDS-PAGE,Western blot and IFAT respectively.Multi-type FMDV VP1 epitope embedded SLPMultiVP1 fusion gene was successfully cloned into shuttle plasmid pMG36e,whose expression product was about 35 ku,and part of which was located on the surface ofLactobacillusfermentum.ALactobacillusembedded expression vector pMG-SLPMulti VP1 was successfully constructed.This research laid the foundation for the research on epitope vaccine of which live carrier based onLactobacillusfermentum.

multi-type FMDV;VP1 epitope;S-layer protein;Lactobacillusfermentum;epitope vaccine

2016-03-09

國家自然科學基金項目(31360602)

陸繼爽(1989-)，男，山東東平人，碩士，主要從事獸醫(yī)微生物與免疫學研究。*通訊作者

S852.659.6；Q789

A

1007-5038(2016)10-0006-05