趙印泉　張啟翔

摘要：以梅花的花朵為材料，采用RT-PCR與RACE相結(jié)合的方法，從“三輪玉蝶”梅花的花朵中克隆到1個全長1 322 bp的氧-甲基轉(zhuǎn)移酶cDNA，命名為PmOMT，該基因編碼377個氨基酸的開放性閱讀框，具有植物氧-甲基轉(zhuǎn)移酶基因典型的3個保守基序，與月季（R. chinensis var. spontanea）的甲基（異）丁香酚轉(zhuǎn)移酶基因RcOMT1具有較高的同源性。構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹結(jié)果表明，PmOMT與RcOMT1親緣關(guān)系最近，同屬COMTs類基因。熒光定量PCR分析發(fā)現(xiàn)，PmOMT基因的相對表達(dá)量與甲基丁香酚色譜峰面積的變化趨勢相似，推測該基因可能參與甲基丁子香酚的生物合成。

關(guān)鍵詞：梅花；氧-甲基轉(zhuǎn)移酶；基因克??；器官；丁子香酚

中圖分類號： S685.170.1 文獻標(biāo)志碼： A 文章編號：1002-1302（2016）07-0022-04

梅花（Prunus mume）是我國的傳統(tǒng)名花，具有怡人香氣，釋放大量包括（異）丁香酚和甲基（異）丁香酚在內(nèi)的苯基/苯丙烷類芳香族化合物[1]，這些芳香族化合物是植物花香的重要成分，并作為信號因子引誘蛾類完成授粉[2]。氧-甲基轉(zhuǎn)移酶（O-methyltransferases，OMTs）是植物酚類衍生物形成過程中重要的一類酶，會將腺苷甲硫氨酸（S-adenosyl-l-methionine）的甲基轉(zhuǎn)移到酚類化合物的羥基上，形成類黃酮化合物、木質(zhì)素和花香化合物等3類酚類衍生物[3-5]，這些酚類衍生物在植物生長發(fā)育以及與環(huán)境的信息交流方面發(fā)揮著重要作用。本研究在前期梅花花香成分研究的基礎(chǔ)上，以“三輪玉蝶”梅花的花朵為材料，對梅花氧-甲基轉(zhuǎn)移酶全長基因進行克隆，應(yīng)用熒光定量PCR技術(shù)分析該基因在梅花不同器官中的表達(dá)，旨在為進一步研究梅花花香基因功能及其形成的分子機制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

三輪玉蝶梅花種植于北京林業(yè)大學(xué)校園內(nèi)，取梅花開花指數(shù)2～3級的花朵[1]、根、莖、葉片、花瓣、雄蕊、雌蕊、花萼，用錫箔紙包好，液氮速凍，保存于-80 ℃超低溫冰箱，備用。RNA Easy Kit試劑盒，購自北京蓋寧公司；普通cDNA第一鏈的合成試劑盒，購自MBI公司；pGM-T克隆試劑盒、DNA瓊脂糖凝膠回收試劑盒、DNA Marker、Escherichia coli TOP10感受態(tài)細(xì)胞，均購自北京天根生物公司；Go Taq Flexi DNA Polymerase、Pfu DNA Polymerase、DNaseⅠ，購自Promega公司；3′-Full RACE Core Set Ver.2.0、SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit，購自TaKaRa公司；擴增引物，由北京奧科生物公司合成；SYBR Green I 染料，Invitrogen公司生產(chǎn)；分析純級的其他試劑，均為國產(chǎn)。用于提取RNA的溶液，均用0.1% DEPC處理的水配制；離心管、槍頭等塑料制品，均用0.1% DEPC浸泡過夜，高壓滅菌，備用。

1.2 梅花PmOMT基因cDNA全長的獲得

按照RNA Easy spin kit試劑盒的說明提取花朵總RNA，用DNase Ⅰ酶去除RNA中的痕量DNA；用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶對1 μg總RNA進行反轉(zhuǎn)錄，獲得第一鏈cDNA；根據(jù)GenBank中檢索到的仙女扇（異）甲基丁香酚（登錄號：U86760）和月季花氧位甲基轉(zhuǎn)移酶基因（登錄號：AB086103）核苷酸和氨基酸保守序列，設(shè)計1對兼并引物為OMT1：5′-STTGTKGATGTTGGGGGBGGGCTAGG-3′和OMT2：5′ -ACAACWATBACYTTBCCATTRTCVGG-3′，以cDNA第一鏈作為模板進行PCR擴增；根據(jù)獲得的保守序列，設(shè)計3′-RACE特異引物為OMT3：5′-AGGGTATCAATTTCGACTTGCC-3′，按3′-Full RACE Core Set Ver.2.0說明書進行操作，獲得3′端序列；將保守區(qū)序列和3′-RACE序列進行拼接，按SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit說明書設(shè)計2個特異引物為OMT4：5′-GCTTTAGGCAGTGCTCATCGCTC-3′和OMT5：5′-CACTCCAGGATAGGAAGGGGCAT-3′，分別與試劑盒中的引物進行擴增，獲得5′端序列；所有擴增產(chǎn)物經(jīng)回收、純化，連接pGM-T載體，轉(zhuǎn)化Escherichia coli TOP10感受態(tài)細(xì)胞，藍(lán)白斑篩選陽性克隆，送北京奧科公司進行測序。根據(jù)3′端和5′端拼接序列設(shè)計2條特異引物為OMT6：5′-GAACGTAAACATAGACAGTCCA-3′和OMT7：5′-AGTGTGTAAGTTTTCATATGCCT-3′，PCR擴增、克隆、測序，獲得梅花氧-甲基轉(zhuǎn)移酶基因cDNA全長編碼序列。將測序得到的核苷酸序列和推導(dǎo)的氨基酸序列分別在NCBI上用Blast軟件進行同源性檢索，序列拼接、分析和同源性比較用DNAMAN軟件完成；采用Mega 4.0軟件構(gòu)建植物OMTs類似基因蛋白的分子系統(tǒng)進化樹。

1.3 熒光定量PCR表達(dá)分析

通過Blast（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast）軟件獲得與OMTs基因的相似序列，在基因的編碼序列中跨內(nèi)含子設(shè)計2條OMTs基因特異引物分別為OMT8：5′-TTCCCTCCCGGATTTTGAG-3′和OMT9：5′-TCGACTTGCCCCATGTTGTA-3′，目標(biāo)片段為294 bp；以GAPDH作為內(nèi)參基因設(shè)計引物GAPDH gsp1：5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3和GAPDH gsp2：5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′，目標(biāo)片段為 440 bp。對PCR擴增產(chǎn)物凝膠檢測和測序，進一步驗證引物設(shè)計的特異性，同時根據(jù)CT值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線?？偭繛?0 μL 的熒光PCR反應(yīng)體系為：H2O 12.1 μL；10 pmol/L上游引物 0.2 μL，10 pmol/L 下游引物0.2 μL；20×SYBR染料05 μL；2.5 mmol/L dNTP 0.4 μL；25 mmol/L MgCl2 24 μL；10×buffer 2.0 μL，5 U/μL Taq酶 0.2 μL，模板 2.0 μL。利用Applied Biosystems 7500 Real-time PCR System熒光定量PCR儀進行擴增，反應(yīng)程序為：95 ℃ 120 s，1個循環(huán)；95 ℃ 10 s，57 ℃ 10 s，72 ℃ 45 s，40個循環(huán)，72 ℃讀取熒光值；循環(huán)結(jié)束，60 ℃保溫60 s，進行熔解曲線分析，檢測每份樣品的OMTs基因和內(nèi)參基因CT值。每份樣品重復(fù)3次。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算定量結(jié)果平均值、校正值、標(biāo)準(zhǔn)差，使用Microsoft Excel 2007軟件進行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 梅花PmOMT基因cDNA全長的獲得及序列分析

結(jié)果表明，以梅花的花朵cDNA為模板，OMT1、OMT2為引物進行PCR擴增，獲得1個300 bp大小的片段，經(jīng)Blast比對，該片段與其他植物OMTs基因有較高的同源性；3′-RACE獲得含Poly（A）尾大小為581 bp的3′端序列，5′-RACE獲得1個829 bp的5′端序列；用DNAMAN軟件進行拼接，設(shè)計1對特異引物PCP擴增，最終獲得1條長為1 322 bp的基因全長cDNA序列，GenBank登錄號為GU339212，命名為PmOMT，該基因完整的開放閱讀框長1 134 bp，編碼377個氨基酸（圖1），5′端非編碼區(qū)長23 bp，3′端非編碼區(qū)長 165 bp。

2.2 PmOMT編碼氨基酸的同源性分析

由圖2可見，PmOMT基因編碼的氨基酸序列與其他物種的氧-甲基轉(zhuǎn)移酶具有較高的同源性，其中，與催化形成甲基（異）丁香酚的月季花氧-甲基轉(zhuǎn)移酶基因RcOMT1、RcOMT3同源性分別為67.6%、67.8%；PmOMT具有植物OMTs典型的3個保守基序。

2.3 PmOMT蛋白系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建

由圖3可見，OMT基因編碼的氨基酸序列明顯分為2個類群，COMTs是氧-甲基轉(zhuǎn)移酶蛋白序列，OMTs是類黃酮蛋白序列；PmOMT與RcOMT1遺傳距離相對最近，同屬氧-甲基轉(zhuǎn)移酶基因類。

2.4 PmOMT在梅花不同組織中的特異性表達(dá)

以GAPDH基因作為內(nèi)參照，采用熒光定量PCR 方法對梅花不同組織中PmOMT的表達(dá)進行檢測。由圖4可見，PmOMT基因在所有組織均有表達(dá)，相對表達(dá)量由高到低依次為雄蕊、花瓣、雌蕊、萼片、葉片、莖、根，生殖器官組織的PmOMT基因相對表達(dá)量高于營養(yǎng)器官組織。

3 結(jié)論與討論

從梅花的花朵中克隆得到的PmOMT基因具有植物OMTs基因典型的3個保守基序，與大多數(shù)植物的OMTs基因具有較高的同源性，其中，與同屬薔薇科的月季花甲基（異）丁香酚氧-甲基轉(zhuǎn)移酶RcOMT1和未知功能的RcOMT3基因同源性相對最高。將PmOMT與部分已知功能的植物OMTs作氨基酸序列分子進化樹發(fā)現(xiàn)，PmOMT屬于咖啡酸氧-甲基轉(zhuǎn)移酶（COMTs）1類，且在選取的梅花組織中均有表達(dá)。有研究表明，COMTs亞家族基因?qū)Ρ江h(huán)上含有2個鄰位羥基的底物具有優(yōu)先催化的特性，香草蘭（Vanilla planifolia）COMTs基因優(yōu)先以3，4-二羥基-苯甲醛為底物形成香草

醛[6]，以3，4-二羥基-5-甲氧基苯甲醛為底物形成丁香醛[7]，這種特性在金腰屬（Chrysosplenium americanum）、楊樹（Populus deltoids）、月季花、草莓（Fragaria×ananassa）等植物[8-11]上都有表現(xiàn)。

梅花PmOMT基因參照月季花RcOMT1基因采用同源克隆法克隆，與RcOMT1具有最高的同源性和親緣關(guān)系，且PmOMT基因在三輪玉蝶梅生殖器官的表達(dá)量高于營養(yǎng)器官。（異）丁香酚和甲基（異）丁香酚都是梅花的花香產(chǎn)物，（異）丁香酚在苯基上含有2個鄰位羥基，鑒于COMTs亞家族基因?qū)Ρ江h(huán)上含有2個鄰位羥基的底物具有優(yōu)先催化的特性，因此初步認(rèn)為PmOMT基因?qū)儆贑OMTs基因，但是否能直接決定花香的形成仍須進一步探究。

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