廖忠意（貴州警官職業(yè)學(xué)院 司法鑒定中心，貴州 貴陽(yáng) 550005）

對(duì)腐敗血液DNA三種提取方法的比較

廖忠意（貴州警官職業(yè)學(xué)院 司法鑒定中心，貴州 貴陽(yáng) 550005）

對(duì)新鮮的血液或者血痕，采用直接擴(kuò)增和chelex-100直接處理提取DNA，一般都能獲得完整、均衡的DNA分型，但在日常檢案過程中，陳舊血痕、載體潮濕、委托方送檢的樣本由于保存不當(dāng)導(dǎo)致血液和少量血痕檢材腐敗的情況也比較常見。這類檢材DNA采用普通的chelex-100直接提取很難獲得比較完整的DNA分型。結(jié)合一列檢案，分別用chelex-100、磁珠法、微量DNA提取試劑盒三種方法專門針對(duì)腐敗血液進(jìn)行比較分析。

chelex-100；磁珠法；微量DNA提取試劑盒；純化柱

一、材料與方法

（一）材料

取自本實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)的親子鑒定一案例中腐敗血液一份。

（二）主要儀器與試劑

9700型PCR擴(kuò)增儀（美國(guó)ABI公司），3500遺傳分析儀（美國(guó)ABI公司），案件專用磁珠法DNA提取試劑盒（長(zhǎng)春市博坤生物科技有限公司），Simgen微量DNA提取試劑盒（杭州新景生物試劑開發(fā)有限公司），Goldeneye20A試劑盒（北京基點(diǎn)認(rèn)知技術(shù)有限公司）。

（三）DNA提取

1. chelex-100

分別取100μL、200μL血液置0.5ml離心管中，加入300μL超純水浸泡10min，適當(dāng)振蕩；13000rpm離心3min，去上清液，用超純水重復(fù)洗滌2次，最后僅剩50μL液體。剩余液體中加入chelex-100100μL、蛋白酶K10μL，56℃育2h，適當(dāng)振蕩，100℃8min，13000rpm離心3min，上清用于PCR擴(kuò)增和檢驗(yàn)。

2. 磁珠法

分別取100μL、200μL血液置1.5ml離心管中，加入300μL超純水浸泡10min，適當(dāng)振蕩，13000rpm離心3min，去上清液，用超純水重復(fù)洗滌2次，最后僅剩50μL液體。剩余液體中加入150μL裂解液，漩渦振蕩混勻后，95℃溫育30min后漩渦振蕩混勻，加入10μL磁珠，漩渦振蕩混勻，室溫吸附10min，吸附后液體漩渦振蕩混勻立即將離心管放于磁力架上，磁吸10秒，然后吸棄所有液體再加150μL裂解液洗滌1次，配置的洗滌液洗滌3次，放置在磁力架上室溫5min，加25μL超純水，65℃溶解5min，置磁力架上，磁吸10秒，上清轉(zhuǎn)移另一管中備用。

3. Simgen微量DNA提取試劑盒

分別取100μL、200μL血液置1.5ml離心管中，加入300μL超純水浸泡10min，適當(dāng)振蕩；13000rpm離心3min，去上清液，用超純水重復(fù)洗滌2次，最后僅剩50μL液體。剩余液體中加入180μLBufferAT、20μL蛋白酶K，漩渦振蕩混勻，金屬浴56℃，900rpm溫育1h，加入5μLCarrierRNA和250μL BufferSL，漩渦振蕩混勻，金屬浴70℃，900rpm溫育10min，14000rpm離心1min，吸取上清到另一個(gè)1.5ml離心管中，加入320無水乙醇，混勻后加入到核酸純化柱中，12000rpm離心30秒，分別用BufferWA和BufferWB洗滌一次，加25μLBufferTE洗脫DNA。

4. SRT分型檢測(cè)按Goldeneye20A試劑盒說明書操作進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物在3500遺傳分析儀上進(jìn)行毛細(xì)管電泳，用GeneMapper·ID-X軟件進(jìn)行基因分析。

二、結(jié)果

chelex-100、磁珠法、Simgen微量DNA提取試劑盒分別提取100μL的血液樣本沒有得到STR分型，圖如下：

圖1　chelex-100提取100μL血液STR分型圖譜：

圖2　磁珠法提取100μL血液STR分型圖譜

圖3　Simgen微量DNA提取試劑盒提取100μL血液STR分型圖譜

從圖1～3可以看出血液樣本腐敗嚴(yán)重，大部分DNA都被降解掉，只有增加提取樣本量，從腐敗的樣本里獲得更多的DNA片段，從而才能擴(kuò)增出目標(biāo)基因片段，得到完整的STR分型。

增加樣本到200μL用chelex-100、磁珠法、Simgen微量DNA提取試劑盒分別提取得到STR分型圖譜如下：

圖4　chelex-100提取200μL血液STR分型圖譜

圖5　磁珠法提取200μL血液STR分型圖譜

圖6　Simgen微量DNA提取試劑盒提取200μL血液STR分型圖譜

三、討論

用chelex-100法對(duì)不同體積的血液樣本都沒有獲得可分析的DNA分型；磁珠法提取得到的DNA分型由于峰值太低，雜峰較多，導(dǎo)致多個(gè)分型不正確；用Simgen微量DNA提取試劑盒得到的DNA分型比較完整，檢出全部基因座，除D19S433有雜峰和D12S391有拔起峰外，其他基因座的都比較干凈平衡。

腐敗血液中的DNA隨著時(shí)間的延長(zhǎng)將持續(xù)地被降解，片段變得越來越小，DNA濃度也會(huì)持續(xù)降低，同時(shí)由于腐敗所產(chǎn)生的PCR抑制物則會(huì)持續(xù)增加。要獲取可分析的DNA分型，需要滿足以下兩個(gè)條件：1.高效地回收降解成小片段的DNA；2.高效地去除PCR抑制物。［1］

不同的DNA提取方法所產(chǎn)生差異可能的原因如下：

1. chelex-100法無法去除腐敗血液中的PCR抑制物，目標(biāo)片段無法擴(kuò)增，無法獲得DNA分型。［2］

2. 磁珠法更適合濃度高、長(zhǎng)片段DNA的分離純化，對(duì)于小片段、低濃度的DNA回收率較低，并且磁珠法與純化柱相比較，其去除PCR抑制物的效率也更差一些，因?yàn)榇胖榫奂谝黄鸬臅r(shí)候非常緊密，在磁珠間隙之間的抑制物常常清除不干凈，而過柱法的濾網(wǎng)膜是穩(wěn)定的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，抑制物可以有效地被清洗掉。

3. DNA濃度低于ng級(jí)別時(shí)，無論是磁珠法還是過柱法，DNA的回收效率都會(huì)大大降低。

DNA濃度低時(shí)，DNA和介質(zhì)的結(jié)合幾率就會(huì)降低，只有盡可能地讓目標(biāo)DNA結(jié)合到磁珠或者硅膠膜介質(zhì)上才有可能提取到更多的DNA。兩種介質(zhì)相比較，過濾柱的網(wǎng)格則比單點(diǎn)的磁珠有天然的優(yōu)勢(shì)。單點(diǎn)的磁珠與DNA的結(jié)合是點(diǎn)對(duì)點(diǎn)的結(jié)合，而過濾柱則是一個(gè)平面篩網(wǎng)，可以盡可能的兜住DNA。［3］

4. 在解決了介質(zhì)的問題后，還需要提高目標(biāo)DNA和介質(zhì)的結(jié)合效率，同時(shí)減少在去除鹽和蛋白的過程中DNA的損失。

在DNA提取的過程中，當(dāng)DNA因?yàn)榭陀^原因已經(jīng)降解成小片段而必須改善提取方法，添加CarrierRNA已經(jīng)被證實(shí)是有效手段之一。CarrierRNA是片段在200-3000nt之間的RNA混合物，溶解于RNA保護(hù)劑中。CarrierRNA在核酸的提取過程中造成了魚群效應(yīng)，原本可能會(huì)穿過硅膠膜的小片段DNA由于硅膠膜已經(jīng)結(jié)合了大量的CarrierRNA，堵住了小片段DNA的通道，更加擁擠的核酸群更容易被硅膠膜捕獲。同樣，在除鹽和除蛋白的時(shí)候，CarrierRNA同樣承擔(dān)了被沖走和損失的份額。由于CarrierRNA的這種特點(diǎn)并且不影響下游的PCR擴(kuò)增檢測(cè)，在柱純化微量核酸的過程中（比如病毒RNA純化、病毒DNA純化及微量DNA提取等），CarrierRNA的應(yīng)用非常廣泛。在柱純化核酸純化體系中添加CarrierRNA，可提高10倍以上微量核酸的回收效率。

四、結(jié)論

筆者實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)有效改善提取方法可以有效提取腐敗血液中的DNA。腐敗血液、陳舊血痕、微量樣本是法醫(yī)微量DNA檢驗(yàn)中經(jīng)常遇到的樣本，是否能提取到足量后續(xù)檢驗(yàn)使用的DNA及清除PCR抑制物是影響檢驗(yàn)結(jié)果的關(guān)鍵本次實(shí)驗(yàn)檢材是送檢的親子鑒定檢材，使用的時(shí)候樣本量較容易控制，而在臨場(chǎng)的時(shí)候提取的檢材腐敗程度，摻雜砂石、細(xì)菌霉菌滋生等要比本次實(shí)驗(yàn)復(fù)雜得多。因此在案件偵破中應(yīng)及時(shí)盡早的提取樣本。

分子生物學(xué)技術(shù)在醫(yī)學(xué)和植物研究領(lǐng)域已經(jīng)獲得了巨大突破，而在刑偵檢測(cè)方面的進(jìn)展卻比其他領(lǐng)域要慢。由于各自領(lǐng)域的封閉性和我國(guó)國(guó)情的特殊性，只有打破這種行業(yè)之間的壁壘，開展跨領(lǐng)域合作才可以更好地將最新的分子生物學(xué)技術(shù)引進(jìn)到刑偵領(lǐng)域。只有獲得更為先進(jìn)的提取檢驗(yàn)方法，才可以在獲取的血斑、血痕等重要檢材中，充分挖掘出其利用價(jià)值。

［1］劉淑芳，呂曉革，王英元.高度腐敗組織不同DNA提取方法的比較［J］.中國(guó)法醫(yī)學(xué)雜志，2006（6）：408.［2］鄭秀芬.法醫(yī)DNA分析［M］.北京：中國(guó)人民公安大學(xué)出版社，2002（5）：15.

［3］胡平，聶勝杰，劉建興，等.3種提取高腐敗檢材DNA的方法比較［J］.中國(guó)法醫(yī)學(xué)雜志，2006（5）：299.

責(zé)任編輯：安國(guó)江

Comparisons of Three DNA Extraction Methods Applied to Decayed Blood

LIAO Zhong-yi
（Forensic Center， Guizhou Police Officer Vocational College， Guiyang 550005， China）

Usually， complete and balanced DNA typing can be extracted from fresh blood or bloodstains through direct amplification and chelex-100 . In case of daily inspection process， however， such circumstances are quiet common， like old blood stains， moist carriers， decayed blood and small amount of decayed bloodstain samples caused by improper preservation. For such samples， it is hard to extract complete DNA typing through the method of chelex-100. Combined with a case， this paper compares and analyses three DNA extraction methods applied to decayed blood： chelex-100，paramagnetic particle method and trace DNA extraction kit.

chelex-100； paramagnetic particle method ； trace DNA extraction kit ； purification column

D918.2

A

1671-5195（2016）04-0059-04］

10.13310/j.cnki.gzjy.2016.04.008

2016-01-29

廖忠意 （1985- ），男，貴州貴陽(yáng)人，貴州警官職業(yè)學(xué)院司法鑒定中心法醫(yī)。