北京同仁堂科技發(fā)展股份有限公司制藥廠（100079）王海 姚璐 魏弘宜 遲玉明

葛根為豆科植物野葛P u e r a r i a lobata(Willd.)Ohwi的干燥根，習(xí)稱野葛，在中國大部分地區(qū)均有分布[1]。葛根主要有效成分為黃酮類物質(zhì)[2]，主要有大豆苷元（daidzein）、大豆苷（daidzin）、葛根素（puerarin）、大豆苷元4’,7-二葡萄糖苷、7-木糖苷葛根素（7-xyloside puerarin）等[3]。中醫(yī)認(rèn)為葛根味甘辛，性平，具有解肌退熱，生津止渴，透疹，升陽止瀉，通經(jīng)活絡(luò)，解酒毒等作用[4]?，F(xiàn)代藥理研究表明，葛根能改善實(shí)驗(yàn)性心肌梗塞犬的心肌代謝，能改善高血壓病人的項(xiàng)強(qiáng)、頭暈、頭痛、耳鳴等癥狀[5]。臨床用于外感發(fā)熱頭痛、項(xiàng)背強(qiáng)痛，口渴，消渴，麻疹不透，熱痢，泄瀉，眩暈頭痛，中風(fēng)偏癱，胸壁心痛等癥[6]。

中國藥材公司曾進(jìn)行全國中藥資源普查，結(jié)果表明我國葛根資源分布廣泛[7]，其中川產(chǎn)葛根[8]、貴州產(chǎn)葛根[4]、云南產(chǎn)葛根[9]的HPLC指紋圖譜研究均有報(bào)道，陜西省是葛根藥材的重要產(chǎn)地之一，然而陜西產(chǎn)葛根的質(zhì)量研究較少見于報(bào)道[10][11]。本實(shí)驗(yàn)選用陜西省產(chǎn)葛根藥材，建立原藥材的高效液相指紋圖譜，以對(duì)葛根原藥材及制劑進(jìn)行質(zhì)量控制。

1 實(shí)驗(yàn)部分

儀器與試藥：Waters 2695-2996高效液相色譜儀，Em-power色譜工作站，2996二極管陣列檢測(cè)器。葛根干燥浸提物HRS（Code：Y0001200；Id：0038E9）由European Directorate for the Quality of Medicines & HealthCare提供。葛根對(duì)照品購于中國食品藥品檢定研究院（批號(hào)：110752-200912）。16批葛根樣品由北京同仁堂科技發(fā)展股份有限公司制藥廠提供，均采自陜西安康葛根基地。乙腈為色譜純，由Burdick & Jackson提供，其余為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品溶液的制備 精密稱取葛根藥材粉末0.1g，置錐形瓶中，精密加入30%乙醇50mL，稱定重量，加熱回流30min，放冷，再稱定重量，用30%乙醇補(bǔ)足減失的重量，濾過，取續(xù)濾液，用微孔濾膜（孔徑為0.45μm）濾過，濾液作為供試品。

2.2 對(duì)照品溶液的制備 稱取相當(dāng)于3.0mg葛根素的葛根干燥浸提物HRS于250mL錐形瓶中，加入30%乙醇50.0mL，稱重。加熱回流30min，溫度降至室溫后再次稱重，用30%乙醇補(bǔ)足失重，混合搖勻，過濾。

2.3 色譜條件 ①色譜柱：phenomenex Onyx Monolithic C18 100×4.6mm。②色譜條件：2根同系列色譜柱，長(zhǎng)度0.10m，直徑4.6mm，固定相為十八烷基硅烷鍵合硅膠；流速3.0mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)260nm；柱溫30℃；梯度洗脫（見附表1）。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 測(cè)定>方法 分別精密吸取葛根干燥浸提物HRS 10μL和供試品溶液3μL，注入液相色譜儀，測(cè)定，記錄色譜圖，即得。

2.4.2 峰識(shí)別 用葛根干燥浸提物HRS提供的色譜圖和對(duì)照藥材色譜庫獲得的色譜圖來歸屬異黃酮類成分的7個(gè)共有峰。（3’-羥基葛根素，葛根素，3’-甲氧基葛根素，6-O＂-D-木糖-葛根素，大豆苷等）。葛根素保留時(shí)間約為7.0min，其他特征峰的保留時(shí)間、峰面積與葛根素峰比較的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積（見附表2）。

2.4.3 精密度試驗(yàn) 取同一批次供試品，按照2.3色譜條件及2.4.1測(cè)定方法檢測(cè)指紋圖譜，連續(xù)進(jìn)樣6次，在同一臺(tái)儀器上測(cè)定指紋圖譜（見附表3），結(jié)果表明，各色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間基本一致，其中各共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD值均小于1.0%，峰面積RSD值小于4.42%，表明該方法進(jìn)樣精密度好。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批次供試品溶液，分別于制樣后0h，2h，16h后按照2.3色譜條件及2.4.1測(cè)定方法檢測(cè)指紋圖譜（見附表4），結(jié)果表明，各共有峰的保留時(shí)間RSD小于1.01%，除7號(hào)峰外，其余共有峰峰面積RSD均小于2.0%。因此，認(rèn)為供試品溶液至少在16h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.5 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同一批次葛根藥材，平行制樣6份，按照2.3色譜條件及2.4.1測(cè)定方法檢測(cè)指紋圖譜（見附表5），結(jié)果表明，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD值均小于1.02%，峰面積RSD值均小于4.07%，表明該方法具有較好的重復(fù)性。

2.5 指紋圖譜及技術(shù)參數(shù)

2.5.1 指紋圖譜及共有峰的標(biāo)定 按照對(duì)照品及供試品溶液的制備及檢測(cè)方法制備樣品溶液，分析比對(duì)葛根干燥浸提物HRS提供的色譜圖及16批次陜西產(chǎn)葛根藥材供試品的HPLC檢測(cè)結(jié)果，總結(jié)共有7個(gè)共有峰（見附圖1）包括：3’-羥基葛根素、葛根素、3’-甲氧基葛根素、6-O＂-D-木糖-葛根素、大豆苷等。其中，葛根素保留時(shí)間約為7.0min，其他特征峰的保留時(shí)間、峰面積與葛根素峰比較的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積（見附表3），通過計(jì)算中藥材供試品的圖譜及指紋圖譜比較，非公有峰面積為總峰面積的8.2%。

2.5.2 不同批次陜西產(chǎn)葛根藥材指紋圖譜的相似度評(píng)價(jià) 以16批次不同陜西產(chǎn)葛根藥材的HPLC指紋圖譜（見附圖2）進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，并建立共有模式，取共有模式作為這批樣品的對(duì)照譜，采用《中藥指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2004A版》軟件，進(jìn)行相似性分析，相似度均不低于0.9（見附表6）。

附表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序

附表2 指紋圖譜分析結(jié)果

附表3 精密度試驗(yàn)結(jié)果

附表4 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

附表5重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

附表6 16批葛根藥材相似度計(jì)算結(jié)果

附圖1 葛根干燥浸提物圖譜。峰2：3’-羥基葛根素；峰3：葛根素；峰4：3’-甲氧基葛根素；峰5：6-O＂-D-木糖-葛根素；峰6：大豆苷

附圖2 16批葛根藥材指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)結(jié)果圖

3 討論

利用中藥材指紋圖譜進(jìn)行定性或定量分析是當(dāng)前中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)的主流，通過指紋圖譜主要特征峰的面積或比例的制定，能有效控制樣品的質(zhì)量，確保質(zhì)量的相對(duì)穩(wěn)定。陜西省是葛根藥材的重要產(chǎn)地之一，而關(guān)于陜西產(chǎn)葛根藥材的指紋圖譜研究鮮見于報(bào)道，故本次試驗(yàn)重點(diǎn)研究了陜西產(chǎn)葛根藥材指紋圖譜的建立。

在選擇供試品溶液的制備方法時(shí)，本次試驗(yàn)對(duì)提取溶劑、提取方法及提取溶劑濃度進(jìn)行了考察，以葛根素含量及總異黃酮含量為考察指標(biāo)進(jìn)行評(píng)價(jià)。提取溶劑的考察涉及30%甲醇及30%乙醇，對(duì)比考察結(jié)果，認(rèn)為乙醇作為提取溶劑效果較好。提取方法的考察中對(duì)比了超聲及回流的方法，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明回流方法較好。最后對(duì)比了20%乙醇、30%乙醇、60%乙醇、80%乙醇的提取結(jié)果，認(rèn)為30%乙醇作為提取溶劑，葛根素及總異黃酮含量較高。最終確定以30%乙醇加熱回流30分鐘作為提取方法。

葛根的主要化學(xué)成分為異黃酮類成分為黃酮類化合物、三萜類、香豆素類等，其中黃酮類化合物的含量達(dá)12% 。葛根主要有效成分為葛根素，葛根素為異黃酮類化合物，其色譜峰無明顯干擾，故本次實(shí)驗(yàn)選葛根素為參照峰，即S峰，以S峰面積作為1，計(jì)算其他各共有指紋峰面積的比值[12][13]。

通過分析本次試驗(yàn)的精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果、穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果、重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以及植物圖譜的相似度，認(rèn)為該16批樣品具有較好的相似性，因此認(rèn)為此次建立的葛根藥材指紋圖譜適用于陜西產(chǎn)地的葛根藥材。