中國人民解放軍第211醫(yī)院（150080）張怡 張倩

肺癌是一種常見的惡性腫瘤，每年世界范圍內(nèi)因?yàn)榉伟┧廊サ幕颊叱^數(shù)百萬，它無時無刻不在危害著人們的健康，因此對于肺癌的診治一直是醫(yī)學(xué)界不斷關(guān)注的焦點(diǎn)[1]。肺癌患者中約有75%～85%屬于非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）。傳統(tǒng)治療方法多為化療和放療，雖然取得了一定的治療效果，但是同時也會給患者帶來一定的副作用[2]。近年來隨著細(xì)胞生物學(xué)的深入研究，醫(yī)學(xué)界出現(xiàn)了繼手術(shù)、化療、放療三大傳統(tǒng)治療又一重大的治療方式，即分子生物靶向治療[3]。因其針對各靶點(diǎn)的特異性進(jìn)行精確地治療，所以顯著提高了腫瘤治療的有效性，并且降低了治療的不良反應(yīng)，從而為NSCLC治療帶來了希望。

表皮生長因子受體EGFR是一種廣泛分布于人體各組織細(xì)胞膜上的功能蛋白，臨床上通常采用小分子EGFR細(xì)胞內(nèi)酪氨酸激酶抑制劑（tyrosin kinase inhibitors，TKIs）來選擇性抑制細(xì)胞內(nèi)酪氨酸激酶的活化，它能夠中斷其下游的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而阻止腫瘤的發(fā)生[4]。代表藥物有吉非替尼（Gefitinib）、厄洛替尼（Erlotinib）等，它們在晚期NSCLC的治療中發(fā)揮了重要的作用。K-ras是EGFR信號傳導(dǎo)通路中一個重要的下游調(diào)控基因，突變型的K-ras無需EGFR接受信號，能夠自動活化該通路并啟動下游信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)。因此，只有野生型K-ras基因的患者對EGFR-TKIs的治療有效，而對于突變型K-ras基因的患者來說無效[5]。不僅如此，突變型的K-ras基因可以使患者對吉非替尼產(chǎn)生耐藥性。在靶向治療的過程中，由于使用的藥物價(jià)格較昂貴，所以在用藥前有效判斷NSCLC患者對該藥的敏感性就顯得尤為重要[6]。

在本研究中，我們檢測和分析我院非小細(xì)胞肺癌患者的EGFR、K-ras基因突變的情況，為臨床的靶向用藥治療提供了重要的依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 標(biāo)本來源

收集我院2012～2015年間在我院腫瘤科、呼吸科和胸外科被診治為非小細(xì)胞肺癌患者的血液標(biāo)本，共計(jì)154例。選取154例非小細(xì)胞肺癌患者為研究對象。其中，男性患者84例（54.5%），女性患者70例（45.5%）。年齡為33～89歲，中位年齡為61歲。有吸煙史患者67例（43.5%），無吸煙史患者87例（56.5%）。患者病理類型為腺癌90例（58.4%），非腺癌64例（41.6%）。分別記錄好患者的性別、年齡、吸煙史、病理類型等臨床信息等。

1.2 基因組DNA的提取 對NSCLC患者標(biāo)本采集后，進(jìn)行標(biāo)本的DNA提取。將患者的新鮮血液放置EDTA抗凝管中6h，待血漿析出后，將血漿吸至EP管中，連續(xù)離心3次，吸取上清液。按照說明，采用DNA提取試劑盒進(jìn)行操作。DNA提取之后，對DNA進(jìn)行濃度檢測，將提取好的DNA樣本于-20℃保存。

1.3 基因突變檢測 基因突變檢測采用實(shí)時熒光定量PCR法，檢測試劑盒由蘇州為真生物醫(yī)藥科技有限公司提供。檢測EGFR基因第18、19、20、21外顯子及K-ras基因第2號外顯子的突變情況。按照使用說明書進(jìn)行操作，Real-time PCR儀為Roche LightCyclerTM480。PCR反應(yīng)共計(jì)4個階段。第一階段為酶激活階段：95℃ 5min；第二階段為PCR擴(kuò)增階段：95℃ 10s，60℃15s，72℃ 25s（熒光）共計(jì)50個循環(huán)；第三階段為熔解過程：95℃ 1min，40℃1min，65℃ 1s，95℃ (檢測熒光40次）；第四階段為冷卻過程：40℃ 10s。反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)反應(yīng)曲線判讀反應(yīng)結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。統(tǒng)計(jì)患者性別、年齡、吸煙史和組織學(xué)分型中EGFR和K-ras基因突變例數(shù)，及其它們所占的百分比。采用確切概率法對計(jì)數(shù)資料進(jìn)行檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05（雙側(cè)），以P＜0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 EGFR和K-ras基因突變檢測情況 對154例非小細(xì)胞肺癌患者血清進(jìn)行EGFR和K-ras基因突變檢測，其中共有52例（33.8%）患者檢測出EGFR基因突變，20例（13.0%）患者檢測出K-ras基因突變，EGFR和K-ras共同發(fā)生突變的有4例（2.6%）。

附表1 EGFR中各基因突變情況統(tǒng)計(jì)

附表2 非小細(xì)胞肺癌患者EGFR和K-ras基因突變與相關(guān)的病理特征的關(guān)系

EGFR中各基因突變?nèi)绺奖?所示：EGFR18號外顯子突變7例，突變檢出率為4.5%、19號外顯子突變15例，突變檢出率為9.8%、20號外顯子突變3例，突變檢出率為1.9%、21號外顯子突變21例，突變檢出率為13.7%、19和21外顯子共同發(fā)生突變?yōu)?例，檢出率為3.9%。

2.2 EGFR和K-ras基因突變與病理特征的關(guān)系 EGFR基因突變檢測中，如附表2所示：在154例檢驗(yàn)的樣本中，84例男性EGFR基因突變檢出21例，比例為25%；70例女性EGFR基因突變檢出31例，比例為44.3%，兩者相比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。67例吸煙患者檢出突變10例，比例為14.9%；87例不吸煙患者中檢出突變42例，比例為48.3%，兩者相比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。90例腺癌患者檢出突變45例，比例為50.0%；64例非腺癌患者中檢出突變7例，比例為10.9%，兩者相比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。比較EGFR基因突變與非小細(xì)胞肺癌各臨床特征的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)EGFR突變多發(fā)生在女性、不吸煙和腺癌的患者中，而EGFR與患者的年齡大小則不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。而在K-ras基因突變檢測中，K-ras與患者的年齡、性別、吸煙史和組織學(xué)分型等均不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

3 討論

近年來，肺癌已經(jīng)成為威脅人類健康的主要惡性腫瘤。早期有報(bào)道表明，EGFR基因的突變主要發(fā)生在女性、不吸煙和腺癌的人群中。而且主要是以19和21外顯子的突變最為常見[7]。本實(shí)驗(yàn)是對黑龍江地區(qū)的154例非小細(xì)胞肺癌樣本進(jìn)行檢測，我們通過對EGFR基因突變的檢測得到了與之前報(bào)道相似的結(jié)果。但是突變比例較其有不同。歸其原因可能是由于黑龍江地區(qū)較其它地區(qū)地域性的差異所造成的。對于K-ras基因突變的檢測，我們同樣發(fā)現(xiàn)男性患者突變率略高于女性，并且腺癌患者明顯高于非腺癌患者。由于我們病例有限，需要進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量以便得出統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

目前，靶向治療以其高效、低毒、不良反應(yīng)輕等優(yōu)點(diǎn)躋身于抗腫瘤治療的前列，但耐藥現(xiàn)象是其應(yīng)用受限的主要原因之一。在錯綜復(fù)雜的耐藥機(jī)制中，EGFR和K-ras基因突變是導(dǎo)致靶向治療TKI原發(fā)耐藥[8]的重要機(jī)制之一。

研究表明，EGFR基因發(fā)生突變會導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移等[9]。K-ras基因是EGPR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路下游的一個基因，在EGFR的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中有分子開關(guān)的作用，它的突變使得細(xì)胞不需要EGFR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)而直接激活下游的激酶系統(tǒng)，可直接導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生[10]。國內(nèi)外大量研究證實(shí)，肺癌患者EGFR基因突變狀態(tài)與吉非替尼、鹽酸厄洛替尼等靶向藥物的療效密切相關(guān)，EGFR基因突變的患者使用此類靶向藥物治療療效顯著，能夠延長患者的生存期，而K-ras基因的突變可以使患者對吉非替尼產(chǎn)生耐藥性。由于靶向治療的藥物價(jià)格昂貴，用藥前有效地檢測EGFR和K-ras的基因突變就顯得尤為重要。

晚期NSCLC患者無法獲得腫瘤組織時，可以使用外周血替代腫瘤組織進(jìn)行突變檢測。外周血循環(huán)DNA來自腫瘤細(xì)胞的壞死和脫落，相比正常人，腫瘤患者外周血循環(huán)DNA水平相對較高，其含量相當(dāng)于正常人的10倍，且其特征可以良好的反應(yīng)腫瘤遺傳基因的特征。患者血液樣本更易獲取，創(chuàng)傷小，風(fēng)險(xiǎn)低，方便快捷，較易被患者接受，可重復(fù)取樣進(jìn)行EGFR基因檢測，這可作為臨床分子靶向治療個體化預(yù)測的有效選擇之一。

EGFR和K-ras信號通路的成功表明了部分NSCLC發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制。然而目前大多數(shù)NSCLC信號通路仍不是很明確。因此尋求更加特異性的靶向分子和靶向藥物，依舊是目前醫(yī)學(xué)界不斷探求的新方向。