宋永利，尹柏雙，付連軍，劉立明，沙萬理，王 奔，李靜姬

(吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院，吉林吉林 132101)

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吉林地區(qū)豬鏈球菌的分離及快速檢測(cè)方法的建立

宋永利，尹柏雙，付連軍，劉立明，沙萬理，王 奔，李靜姬

(吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院，吉林吉林 132101)

從吉林市周邊地區(qū)8個(gè)豬場(chǎng)收集病料，采集疑似豬鏈球菌的豬樣品，進(jìn)行病原菌的分離、生化試驗(yàn)、動(dòng)物致病性試驗(yàn)和毒力因子的PCR檢測(cè)。共分離到8株分離株，其中3株有致病性，5株無致病性。PCR能夠高效、快速診斷出該病菌是否有致病性。該試驗(yàn)結(jié)果可為正確及時(shí)診斷治療鏈球菌病提供理論依據(jù)。

豬鏈球菌；分離；生化試驗(yàn)；動(dòng)物致病性試驗(yàn)；PCR檢測(cè)

豬鏈球菌病是我國常見的豬傳染病，危害嚴(yán)重，并且出現(xiàn)人感染豬鏈球菌的報(bào)道，引起人們的極大關(guān)注。豬鏈球菌血清型較多，防治較為困難。針對(duì)豬鏈球菌病的防治，國內(nèi)外大多采用藥物治療和免疫相結(jié)合的方法。在發(fā)病初期一般采用抗生素治療，但由于沒有進(jìn)行有效的藥敏試驗(yàn)，導(dǎo)致抗生素的濫用，延誤了最佳的治療時(shí)間，并且有畜產(chǎn)品抗生素殘留的隱患[1]。因此，應(yīng)致力于篩選廣譜、高效、低殘留的抗菌藥物，在疾病發(fā)生早期及時(shí)控制疫情的蔓延。豬溶血素使細(xì)菌產(chǎn)生致病力，是許多細(xì)菌產(chǎn)生的重要毒力因子[2-3]。研究表明，GAPDH與豬鏈球菌對(duì)宿主細(xì)胞的黏附有關(guān)[4]。GAPDH具有結(jié)合白蛋白的能力，并且豬鏈球菌結(jié)合白蛋白后能增強(qiáng)菌株的毒力。Chen C等[5]研究表明在我國豬鏈球菌流行株中存在1個(gè)86 kb大小的基因組毒力島，含有2個(gè)雙組分信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，通過調(diào)控多種毒力因子的表達(dá)參與致病過程。李干武等[6]利用PCR技術(shù)首次從我國江蘇分離株HA9801中檢測(cè)到渾濁因子(orf2)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)orf2還存在于其他血清型的鏈球菌豬源分離株中。豬鏈球菌在血清肉湯和THB液體培養(yǎng)基中有白色絮狀沉淀產(chǎn)生[7]。生化試驗(yàn)可用于豬鏈球菌的鑒定，但是不同血清型的豬鏈球菌或同一血清型不同菌株間的生化結(jié)果差異較大，因此生化鑒定只能作為補(bǔ)充性鑒定方法[8]。徐敏等[9]利用純化的原核表達(dá)豬鏈球菌高保守的GDH蛋白的表位區(qū)域作為抗原，建立間接ELISA方法，該方法特異、敏感，能夠準(zhǔn)確檢測(cè)出所有亞血清型豬鏈球菌的抗體，為流行病學(xué)調(diào)查提供了一個(gè)有效的診斷方法。倪艷秀等[10]根據(jù)豬鏈球菌2型的莢膜多糖基因cps2J設(shè)計(jì)合成了1對(duì)引物，建立了檢測(cè)豬鏈球菌2型的PCR法，該方法不需要進(jìn)行細(xì)菌的分離純化，檢測(cè)時(shí)間短，適合實(shí)驗(yàn)室對(duì)大批樣本進(jìn)行檢測(cè)診斷，為流行病學(xué)調(diào)查提供依據(jù)。筆者從吉林市周邊地區(qū)8個(gè)豬場(chǎng)收集病料，進(jìn)行病原菌的分離，并進(jìn)行生化試驗(yàn)、動(dòng)物致病性試驗(yàn)和毒力因子的PCR檢測(cè)，對(duì)當(dāng)?shù)仞B(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展和鏈球菌病的預(yù)防具有積極意義。

1　材料與方法

1.1樣品采集從吉林市周邊地區(qū)8個(gè)豬場(chǎng)收集病料，采集疑似感染豬鏈球菌病豬的樣品。

1.2試劑與儀器PCR mix購自Tiangen公司；DNA Marker購自中科瑞泰(北京)生物科技有限公司；常用培養(yǎng)基購自O(shè)xoid公司。試驗(yàn)儀器有PCR儀(ABI9700)。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1致病原分離。無菌采集疑似鏈球菌感染的病死豬肝、腎、脾，淋巴結(jié)，接種于馬丁肉湯培養(yǎng)基中，在37 ℃下培養(yǎng)1 d后，在培養(yǎng)基中挑選生長(zhǎng)出的可疑菌落，將可疑菌落用記號(hào)筆進(jìn)行標(biāo)記，在低倍鏡下觀察，挑取每一個(gè)菌落少許，革蘭氏染色。將革蘭氏陽性、成雙或短鏈狀球菌的肉湯培養(yǎng)物接種于血清平板上，經(jīng)過培養(yǎng)、鏡檢確定為鏈球菌后，接種于含有血清的馬丁肉湯、普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基THB培養(yǎng)基中，無菌檢驗(yàn)合格者，加入甘油于-20 ℃下保存。如果是可疑菌落，經(jīng)過純培養(yǎng)后，進(jìn)一步進(jìn)行其他試驗(yàn)鑒定。

1.3.2生化試驗(yàn)。將上述純化的肉湯培養(yǎng)物接種于馬丁瓊脂斜面，培養(yǎng)后用滅菌鹽水沖洗，將菌液收集于滅菌試管，供生化試驗(yàn)用。待測(cè)菌株分別用接種針接種到生化編碼鑒定管。將接種后的生化鑒定管置于37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h后，觀察并記錄結(jié)果。重復(fù)3次?；旌希?7 ℃下作用18～24 h后觀察結(jié)果。

1.3.3動(dòng)物致病性試驗(yàn)。取每個(gè)菌株18 h血清馬丁肉湯培養(yǎng)物稀釋成1∶15勻漿懸液，對(duì)3只小鼠進(jìn)行腹腔注射，0.3 mL/只，同時(shí)取3只小鼠腹腔注射同劑量的血清馬丁肉湯，作為對(duì)照。將注射后的小鼠單獨(dú)飼養(yǎng)，觀察發(fā)病及死亡情況，對(duì)死亡的小鼠進(jìn)行解剖，條件下摘取無菌肝臟和脾臟，革蘭氏染色，并在鮮血瓊脂平板上分離培養(yǎng)。

1.3.4豬鏈球菌分離株毒力因子的PCR檢測(cè)。參照朱子潔[11]的方法設(shè)計(jì)1對(duì)引物F(GCTACGACCTCAGGCTGAAAC)和R(TGGATCCAAGTGTCACTGTAC)，對(duì)ef進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系如下：引物各1 μL、mix 6 μL、模板1 μL、水3 μL。PCR反應(yīng)條件如下：95 ℃ 30 s；95 ℃4 min，52 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min；72 ℃延伸7 min,35個(gè)循環(huán)。

2　結(jié)果與分析

2.1分離菌的培養(yǎng)特性通過鏡檢發(fā)現(xiàn)，致病原為革蘭氏陽性球菌，多數(shù)為圓形，少數(shù)呈短鏈狀，有莢膜。在血清肉湯中先均勻混濁，后在試管底部形成沉淀，血清肉湯培養(yǎng)物涂片，可見革蘭氏染色陽性，多呈長(zhǎng)鏈狀的球菌。致病菌的培養(yǎng)特性如表1所示，符合鏈球菌的培養(yǎng)特性。

表1　致病原的培養(yǎng)特性觀察

注：-表示生長(zhǎng)不好；+表示生長(zhǎng)良好。

Note：- indicated poor growth;and + indicated good growth.

2.2生化試驗(yàn)結(jié)果菌株5、6、8可發(fā)酵乳糖，不發(fā)酵山梨醇；菌株1、2、3、4、7不產(chǎn)生H2S。生化試驗(yàn)結(jié)果表明，分離菌株符合豬鏈球菌的生化特性(表2)，證實(shí)了豬鏈球菌病的存在。

表2　致病原的生化試驗(yàn)結(jié)果

2.3致病性試驗(yàn)結(jié)果將分離培養(yǎng)的菌液經(jīng)純化培養(yǎng)后，接種于小鼠體內(nèi)，在不同時(shí)間內(nèi)小鼠的表現(xiàn)不同，在不同時(shí)間內(nèi)小鼠發(fā)生死亡，接種菌液5、6、8后在24 h內(nèi)小鼠死亡，接種1、2、3、4、7號(hào)菌液的小鼠沒有發(fā)生死亡。死亡小鼠經(jīng)剖檢發(fā)現(xiàn)腎臟腫大、關(guān)節(jié)腫大，肝臟、肺臟有出血點(diǎn)。

2.4分離株毒力因子的PCR檢測(cè)從圖1可以看出，5、6、8號(hào)菌液擴(kuò)增出606 bp大小的ef條帶，而1、2、3、4、7號(hào)菌液沒有擴(kuò)增出條帶，說明1、2、3、4、7號(hào)菌液無致病性。經(jīng)測(cè)序比對(duì)，與NCBI上的ef序列相一致,且5、6、8號(hào)菌液也符合鏈球菌的培養(yǎng)特性。這驗(yàn)證了PCR在鑒定致病性鏈球菌方面的準(zhǔn)確性。

圖1　分離株毒力因子ef的PCR檢測(cè)Fig.1　PCR detection of virulence factor ef in isolated strain

3　小結(jié)

豬鏈球菌的致病性與其毒力因子密切相關(guān)，鑒于毒力因子檢測(cè)在該病臨床診斷及流行病學(xué)監(jiān)測(cè)中的重要價(jià)值，筆者從吉林市周邊地區(qū)8個(gè)豬場(chǎng)收集病料，進(jìn)行病原菌的分離以及生化試驗(yàn)、動(dòng)物致病性試驗(yàn)和毒力因子的PCR檢測(cè)，旨在實(shí)現(xiàn)對(duì)吉林市地區(qū)豬鏈球菌分離菌株的毒力相關(guān)因子的檢測(cè)，以期為該地區(qū)快速診斷該疾病提供實(shí)驗(yàn)室診療方法，減少豬鏈球菌病給吉林周圍地區(qū)養(yǎng)豬業(yè)帶來的損失。

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Isolation and Rapid Detection of Streptococcus suis in Jilin District

SONG Yong-li,YIN Bai-shuang,FU Lian-jun et al

(College of Animal Science and Technology,JILin Agriculture Science and Technology College,Jilin,Jilin 132101)

Suspected samples of Streptococcus sui were collected from 8 pig farms in the surrounding areas of Jilin City.The isolation,biochemical test,animal pathogenicity test and the virulence factor PCR test of pathogenic bacteria were carried out.A total of eight strains were isolated.And among them,3 strains had pathogenicity,others were non-pathogenic.RCR could rapidly and efficiently diagnose whether the strain had pathogenicity.This research provided theoretical basis for the correct and timely treatment of Streptococcus suis.

Streptococcus suis;Isolation;Biochemical test;Animal pathogenicity test;PCR detection

吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院重點(diǎn)學(xué)科培育項(xiàng)目[吉農(nóng)院合字(2013)第X028號(hào)]。

宋永利(1983- )，男，內(nèi)蒙古呼和浩特人，講師，碩士，從事分子生物學(xué)與胚胎工程研究。

2016-07-03

S 851.34+7

A

0517-6611(2016)25-131-02