楊志軍　白妙春　張業(yè)森　郭永坤　戴宜武

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·論著·

Tf-USPIO納米微粒的合成及TfR轉(zhuǎn)基因神經(jīng)干細(xì)胞過表達(dá)的研究

楊志軍白妙春張業(yè)森郭永坤戴宜武

目的合成Tf-USPIO納米微粒以及建立穩(wěn)定表達(dá)TfR的神經(jīng)干細(xì)胞。方法利用慢病毒轉(zhuǎn)染神經(jīng)干細(xì)胞，通過流式細(xì)胞儀篩選出穩(wěn)定表達(dá)TfR的神經(jīng)干細(xì)胞，運(yùn)用WB檢測(cè)其表達(dá)水平。將Tf與USPIO進(jìn)行偶聯(lián)，合成Tf-USPIO納米微粒，通過DLS方法測(cè)出USPIO和Tf-USPIO的直徑分別為(36±0.7)nm，(43.5±0.08)nm。結(jié)果慢病毒成功的轉(zhuǎn)染神經(jīng)干細(xì)胞，通過流式細(xì)胞儀器篩選出穩(wěn)定表達(dá)的神經(jīng)干細(xì)胞，并用WB證實(shí)了TfR的過表達(dá)；通過偶聯(lián)的方法合成了穩(wěn)定的Tf-USPIO微粒。結(jié)論成功構(gòu)建了TfR神經(jīng)干細(xì)胞系，合成出穩(wěn)定的Tf-USPIO納米微粒。

超小超順磁性氧化鐵；轉(zhuǎn)鐵蛋白受體；慢病毒載體；干細(xì)胞；磁共振成像

研究證實(shí)神經(jīng)干細(xì)胞移植可改善因神經(jīng)元損傷而出現(xiàn)的臨床癥狀[1]。但到目前為止，未能實(shí)現(xiàn)在活體內(nèi)長期動(dòng)態(tài)觀察干細(xì)胞的遷移和分化，因此需要一種能夠達(dá)到長期示蹤目的的干細(xì)胞。轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(transferring receptor,TfR)在內(nèi)皮細(xì)胞等大量存在，其主要作用是將細(xì)胞外的鐵向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)移，是鐵代謝的重要過程，其配體轉(zhuǎn)鐵蛋白(Tf)可透過血腦屏障(BBB)。同時(shí), 研究發(fā)現(xiàn)腦內(nèi)很多疾病的發(fā)生都和鐵代謝失調(diào)有關(guān)。TfR報(bào)告基因在磁共振(MR)分子成像中受到高度重視和廣泛關(guān)注。目前應(yīng)用較多的 TfR 探針有轉(zhuǎn)鐵蛋白-單晶體氧化鐵顆粒(Tf-MION)[2]和轉(zhuǎn)鐵蛋白-超順磁性氧化鐵納米粒(Tf-SPION)[3]兩種,其在體內(nèi)外均能MR成像。本文利用慢病毒(pLenti6.3-TfR-IRES-EGFP和pLenti6.3-MCS-IRES-EGFP)轉(zhuǎn)染神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)，通過流式細(xì)胞篩選出穩(wěn)定表達(dá)TfR的神經(jīng)干細(xì)胞系，并通過蛋白印記(Western blotting)證明其過表達(dá)；利用USPIO和Tf兩者EDC偶聯(lián)的方法，獲得Tf-USPIO螯合物，并通過DLS法測(cè)試偶聯(lián)前后的粒子直徑，證明其偶聯(lián)成功。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞和慢病毒載體系統(tǒng)：小鼠胚胎源性NSCs，本實(shí)驗(yàn)室凍存。慢病毒表達(dá)載體pLenti6.3-MCS-IRES-EGFP及pLenti6.3-TfR-IRES-EGFP包裝質(zhì)粒均購自于美國Invitrogen公司。

1.1.2主要試劑：USPIO購自北京萬德高科科技公司；Tf、DMEM/F12、bFGF、EGF、Neurobasal培養(yǎng)基、小鼠抗人轉(zhuǎn)鐵蛋白受體單克隆抗體、兔抗人轉(zhuǎn)鐵蛋白受體單克隆抗體等購自Sigma公司；Sulfo-NHS、EDC購自上海延長科技有限公司。

1.2方法

1.2.1小鼠胚胎源性NSCs的傳代培養(yǎng)：①將原代培養(yǎng)細(xì)胞懸浮生長至細(xì)胞球，體積擴(kuò)增約4～5倍時(shí)，將培養(yǎng)液和懸浮細(xì)胞吸入5 ml離心管中，離心機(jī)中800 r/min，離心5 min；②棄去培養(yǎng)基后，加入Accuase酶溶液約1 ml，溫箱靜置10～15 min，加入等體積的培養(yǎng)液終止消化；然后用吸管反復(fù)輕柔吹打約20～30次，使細(xì)胞球變成單個(gè)細(xì)胞；③再次將消化的細(xì)胞懸液移室溫下，轉(zhuǎn)速1 000 r/min，離心5 min，去掉上清，以培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，輕柔吹打成單細(xì)胞懸液，玻片上大概計(jì)數(shù)后，調(diào)整細(xì)胞密度至1×106個(gè)/ml，接種于25 cm2培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板中；置于37℃，5%的CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2小鼠神經(jīng)干細(xì)胞的凍存及復(fù)蘇：①凍存細(xì)胞時(shí)將神經(jīng)干細(xì)胞按上述方法消化為單細(xì)胞懸液后，離心后收集神經(jīng)干細(xì)胞，棄去培養(yǎng)液，加入約1 ml神經(jīng)干細(xì)胞(90%培養(yǎng)基+10%DMSO)重懸，計(jì)數(shù)約1×106個(gè)/ml，放入凍存管中，再次加入凍存液，使凍存管中凍存液體積約為1 ml，裝入預(yù)先解凍(室溫下)的凍存盒，放入-80℃冰箱中緩慢降溫，24 h后可放入液氮灌中長期保存；②復(fù)蘇細(xì)胞時(shí)將凍存管從液氮中取出，快速轉(zhuǎn)入37℃水浴中，一邊解凍，一邊振蕩，待細(xì)胞快速解凍；然后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到含有2倍體積神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)液的離心管中，1 000 r/min，離心4 min，棄上清；離心后用培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，計(jì)數(shù)細(xì)胞，按1×106cells,5 ml/瓶，接種于25 cm2的培養(yǎng)瓶(一般1個(gè)凍存管接種于1個(gè)25 cm2的培養(yǎng)瓶)，37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.3TfR基因轉(zhuǎn)染神經(jīng)干細(xì)胞：①將代數(shù)為第6～8代的神經(jīng)干細(xì)胞消化吹打?yàn)閱蝹€(gè)細(xì)胞后，計(jì)數(shù)細(xì)胞，以4×105細(xì)胞/2 ml接種至12孔培養(yǎng)板中，37℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；②培養(yǎng)4 h后，觀察細(xì)胞狀態(tài)，取細(xì)胞生長狀態(tài)良好的孔，每孔加入預(yù)先解凍含有MOI=10病毒液(TfR組)和MOI=10空載體組(EGFP組)的神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)液300 μl，再次放回溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)，并設(shè)置空白細(xì)胞為對(duì)照；③12 h后觀察細(xì)胞狀態(tài)，半量換液，48 h后再次半量換液。48～72 h后熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞熒光表達(dá)情況，并拍照。

1.2.4細(xì)胞流式篩選穩(wěn)定表達(dá)TfR的神經(jīng)干細(xì)胞系：①細(xì)胞加入感染病毒48～72 h后，收集神經(jīng)球、消化輕輕吹打成單個(gè)細(xì)胞。然后用高壓滅菌的PBS輕洗1次，1 ml滅菌PBS重懸細(xì)胞；②用300目的細(xì)胞篩過濾細(xì)胞，收集濾過的細(xì)胞懸液移入2 ml上樣管，送去細(xì)胞流式儀分選出含有EGFP的神經(jīng)干細(xì)胞；③篩選后的神經(jīng)干細(xì)胞在離心機(jī)上離心，1 000 r/min,離心4 min，去掉上清；加入含有青霉素-鏈霉素溶液(100×)的神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)液重懸，接種于培養(yǎng)瓶中，并在熒光顯微鏡下拍片。

1.2.5蛋白印記鑒定TfR細(xì)胞：①將5×106個(gè)篩選后的神經(jīng)干細(xì)胞用1×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液煮沸5～10 min直接裂解，提取總蛋白，設(shè)置空載體和空白細(xì)胞作為對(duì)照組，煮好后可用流水降溫后放入-80℃保存；②按產(chǎn)品說明書配置10%分離膠，5%濃縮膠，各組取15 μl蛋白上樣，初始電壓為100 V，大約半小時(shí)后當(dāng)染料邊緣進(jìn)入分離膠后，電壓提高到150 V，直至染料遷移至凝膠下端附近；③轉(zhuǎn)膜前將膜置于甲醇中活化20 s，再放入去離子水中洗滌5 min，最后放入轉(zhuǎn)膜中浸泡 20 min，使用半干轉(zhuǎn)移儀在30 V恒壓條件下電轉(zhuǎn)40 min，將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。將轉(zhuǎn)完蛋白的PVDF膜置于含5%脫脂奶粉的TBST溶液中，搖床上室溫下?lián)u晃孵育2 h；④將一抗兔抗人轉(zhuǎn)鐵蛋白受體單克隆抗體以1∶1 000稀釋于TBST溶液中，密封袋中4℃過夜。第2天TBST液洗膜10 min/次，洗3次；⑤辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗,1∶5 000稀釋于含5%脫脂奶粉/TBST溶液中，室溫孵育2 h，TBST液洗膜10 min/次，洗3次；⑥將膜置于平鋪好的保鮮膜上,加入預(yù)先以1∶1的比例混合A液和B液，并避光反應(yīng)5 min；⑦將膜取出后封存在透明薄膜中放入暗盒,開始攝像。

1.2.6Tf-USPIO的合成：在中科院化學(xué)所合成。① 將含有8 mg Fe/ml的USPIO約11 mg Fe加入1.91 mg EDC(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl carbodiimide conjugation)及5.42 mg sulf-NHS(N-hydroxysulfos uccinimide sodium salt)，室溫下反應(yīng)15 min；②采用PD-10交換柱對(duì)活化后的USPIO進(jìn)行緩沖液交換，洗脫液體采用NaHCO3(0.1 mol/L)，然后取其中9 mg 加入3 mg轉(zhuǎn)鐵蛋白(Tf)在室溫下進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)，4 h后采用PBS緩沖液進(jìn)行透析；③動(dòng)態(tài)光散射(dynamic light scattering，DLS)測(cè)定,將0.1 mg/ml的Tf-USPIO和USPIO樣品超聲分散10 min，在粒度儀上測(cè)定水化半徑位。

2　結(jié)果

2.1光鏡下觀察剛消化后的細(xì)胞，見細(xì)胞呈懸浮狀態(tài)，形態(tài)為圓形，大小均一，邊緣光滑、完整，折光性強(qiáng)。約12 h后部分細(xì)胞開始成球，隨時(shí)間的增加，細(xì)胞球逐漸增大，約3～4 d后細(xì)胞球中央成暗黃色，提示細(xì)胞需要傳代。見圖1。

2.2在加入慢病毒感染8 h后可見部分細(xì)胞開始有綠色熒光出現(xiàn)，且綠色熒光和轉(zhuǎn)染的效率隨時(shí)間逐漸增強(qiáng)，36 h可見神經(jīng)球綠色熒光占據(jù)整個(gè)球體。見圖2。

ABC

圖1細(xì)胞傳代培養(yǎng)(×10);A為細(xì)胞剛消化，B為培養(yǎng)12 h，C為培養(yǎng)3 d

AB

圖2熒光顯微鏡下的慢病毒轉(zhuǎn)染神經(jīng)干細(xì)胞×200;A為轉(zhuǎn)染8 h，B為轉(zhuǎn)染36 h

2.3使用細(xì)胞流式儀篩選出EGFP陽性細(xì)胞傳代培養(yǎng)，經(jīng)5次篩選，最終得到陽性率為98.9%神經(jīng)干細(xì)胞,在熒光顯微鏡下可發(fā)現(xiàn)神經(jīng)球呈強(qiáng)綠色熒光，明視野下可見神經(jīng)球生長良好，未轉(zhuǎn)染的神經(jīng)干細(xì)胞都無綠色熒光。見圖3、4。

圖3　流式細(xì)胞分選圖

圖4轉(zhuǎn)染細(xì)胞(上)和未轉(zhuǎn)染細(xì)胞(下)熒光顯微鏡下圖片(左側(cè)為熒光光源，右側(cè)為普通光源，標(biāo)尺為200 μm)

2.4蛋白印記法鑒定后TfR條帶出現(xiàn)在相對(duì)分子量為90 kDa附近，與TfR的理論值相似，轉(zhuǎn)染TfR細(xì)胞組蛋白表達(dá)量明顯高于空載體EGFP組和未轉(zhuǎn)染組，對(duì)照組的表達(dá)量很低，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞TfR的表達(dá)水平明顯增加，表明成功建立表達(dá)TfR的神經(jīng)干細(xì)胞系。見圖5。

圖5　Western blotting 檢測(cè)TfR蛋白的表達(dá)

2.5DLS是通過測(cè)量樣本散射光強(qiáng)度起伏的變化計(jì)算出樣品顆粒大小信息，該技術(shù)利用激光照射測(cè)量樣品顆粒并分析散射光的波動(dòng)強(qiáng)度(Stokes-Einstein 方程)推導(dǎo)出粒子大小。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)統(tǒng)計(jì)可得USPIO 的直徑為(36±0.7)nm，而 Tf-USPIO 的直徑為(43.5±0.08)nm。見圖6。

圖6　USPIO和Tf-USPIO動(dòng)態(tài)光散射圖(DLS)

3　討論

研究神經(jīng)干細(xì)胞移植效果，需要對(duì)移植細(xì)胞在動(dòng)物體內(nèi)的遷移、分布、存活及增殖和分化進(jìn)行監(jiān)測(cè)。為了區(qū)分供體和自體細(xì)胞，需要一種有效的標(biāo)記方法標(biāo)記這些細(xì)胞。常見的方法包括：免疫組織化學(xué)技術(shù)、同位素或者熒光標(biāo)記、MRI成像技術(shù)等[4-6]。MRI成像技術(shù)因其可以實(shí)現(xiàn)無創(chuàng)、動(dòng)態(tài)、長期的示蹤，受到越來越多的關(guān)注。MRI成像一般先將移植物在體外利用MR增強(qiáng)劑標(biāo)記后，然后在體外利用磁共振示蹤。常見的MR增強(qiáng)劑包括釓類和氧化鐵。報(bào)告基因技術(shù)也可以產(chǎn)生順磁性物質(zhì)或吸收順磁性物質(zhì)，常見的包括酪氨酸激酶、鐵蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白受體等。科學(xué)家們已根據(jù)腫瘤過表達(dá)TfR，設(shè)計(jì)出了Tf-SPION磁共振探針，并且成功地在磁共振上顯像。

本文利用轉(zhuǎn)鐵受體蛋白基因慢病毒轉(zhuǎn)染神經(jīng)干細(xì)胞，通過慢病毒感染細(xì)胞，其優(yōu)點(diǎn)是可以轉(zhuǎn)染任何時(shí)期的細(xì)胞、容納外源性基因的片段大、長期穩(wěn)定表達(dá)等，其他病毒轉(zhuǎn)染方式包括腺病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒。它們與慢病毒相比，腺病毒只能瞬時(shí)轉(zhuǎn)染、不能整合到染色體中。逆轉(zhuǎn)錄病毒只能感染分裂期細(xì)胞、容量有限。本文證實(shí)轉(zhuǎn)染后的神經(jīng)干細(xì)胞在熒光顯微鏡下為綠色，根據(jù)其EGFP-TfR基因共表達(dá)，證明TfR基因已轉(zhuǎn)入神經(jīng)干細(xì)胞，并根據(jù)它們共表達(dá)的特性，利用流式篩選的方法篩選出96%以上的穩(wěn)定表達(dá)EGFP的神經(jīng)干細(xì)胞，并將未表達(dá)EGFP的細(xì)胞棄去，將表達(dá)EGFP的細(xì)胞裂解，并通過蛋白印記的方法證實(shí)了TfR蛋白的過表達(dá)，結(jié)合先前的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了TfR在神經(jīng)干細(xì)胞中的持續(xù)表達(dá)[7]。

磁共振探針一般都具有順磁性，理想的磁共振探針應(yīng)具備以下條件：對(duì)靶體具有高度的特異性和親和力、能夠透過生物屏障如細(xì)胞膜、血管內(nèi)皮甚至是血腦屏障、在機(jī)體內(nèi)不會(huì)引起排斥反應(yīng)、與靶體結(jié)合后產(chǎn)物不會(huì)對(duì)機(jī)體有不良反應(yīng)、能與磁共振信號(hào)分子偶聯(lián)。現(xiàn)研究較多的是納米氧化鐵類，因其直徑小(納米級(jí)，一般1～100 nm)、且較穩(wěn)定，特別適合活體磁共振成像。常用的納米氧化鐵顆粒有超順磁性氧化鐵納米微粒(SPION)、超微順磁性氧化鐵(USPIO)、單晶體氧化鐵納米粒子(MION)等[8-10]，它們各有優(yōu)缺點(diǎn)。USPIO直徑約為4～30 nm，也已經(jīng)得到商品化，它的體積較小，半衰期長，很少被肝臟代謝，大部分會(huì)分布到全身的淋巴結(jié)，是MR造影及功能成像的優(yōu)良新材料，良好的生物相容性，這也是選用USPIO作為轉(zhuǎn)基因神經(jīng)干細(xì)胞探針的重要原因[11]。

DLS是動(dòng)態(tài)光散射的意思，它是利用激光照射運(yùn)動(dòng)顆粒，其散射光強(qiáng)度也產(chǎn)生隨機(jī)的波動(dòng)，并且它的波動(dòng)頻率與顆粒的大小有關(guān)，正是利用這種變化來測(cè)量和分析顆粒的大小。它是測(cè)量納米顆粒的有效方法，具有以下優(yōu)點(diǎn)：測(cè)量速度快、范圍大、樣品量小、不影響原有狀態(tài)，EDC是一種活化COOH的，然后可以和蛋白或者氨基酸反應(yīng)，但是EDC反應(yīng)的中間產(chǎn)物往往不穩(wěn)定，最好用sulfo-NHS活化，本部分通過EDC偶聯(lián)的方法將Tf和USPIO聯(lián)合在一起，預(yù)先應(yīng)用PEG包被的USPIO表面含有大量羧基，并且其在血液內(nèi)較穩(wěn)定，使其極易和Tf發(fā)生反應(yīng)而形成復(fù)合物。DLS實(shí)驗(yàn)顯示USPIO 的直徑為(36±0.7)nm，而 Tf-USPIO 的直徑為(43.5±0.08)nm，顯示偶聯(lián)后的直徑變大，說明一種可能即Tf和USPIO成功偶聯(lián)，從以下幾方面考慮：(1)他們有沒有發(fā)生靜電吸附的條件，即轉(zhuǎn)鐵蛋白和uspio的表面電荷是否相反；(2)從極性方面考慮，他們之間的親和力也并不強(qiáng)；(3)化學(xué)耦聯(lián)效率高，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，在耦聯(lián)反應(yīng)試劑過量時(shí)，幾乎都耦聯(lián)上了。然后，如果是非特異性吸附上的，他們的結(jié)合力是很弱的，在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)過程中很可能就脫離了，不會(huì)對(duì)特異性攝取有什么貢獻(xiàn)。而在攝取實(shí)驗(yàn)中，特異性攝取那么多，從側(cè)面也證明了耦聯(lián)是有效的。

我們成功地利用慢病毒轉(zhuǎn)染的方法轉(zhuǎn)染神經(jīng)干細(xì)胞，并使細(xì)胞過表達(dá)TfR，且能傳代下去。利用流式細(xì)胞儀篩選了穩(wěn)定表達(dá)TfR的神經(jīng)干細(xì)胞系，成功的利用EDC藕聯(lián)的方法合成了Tf-USPIO，并證實(shí)其在體外具有良好水溶性和穩(wěn)定性，為下一步轉(zhuǎn)基因干細(xì)胞的體外探針成像提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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Study on the synthesis of Tf-USPIO nanometer particle and overexpression of TfR transgenic neural stem cells

YANGZhijun,BAIMiaochun,ZHANGYesen,etal.Bayi

HospitalforEncephalopathyAffiliatedtoPLAArmyGeneralHospital,Beijing100700,China

ObjectiveTo synthesize Tf-USPIO nanometer particle and establish the neural stem cells system that can express transferrin receptors (TfR) stably. MethodsThe neural stem cells were transfected by lentivirus,then the neural stem cells that could express TfR stably were selected out by flow cytometry.The expression levels of TfR were detected by Western Blotting.The TF was coupled with USPIO to synthesize Tf-USPIO nanometer particle,which were measured by DLS method,with the diameters of USPIO and Tf-USPIO being (36±0.7)nm,(43.5±0.08)nm, respectively.ResultsThe neural stem cells were transfected by lentivirus successfully,and the neural stem cells that could express TfR stably were selected out by flow cytometry successfully,moreover, the overexpression of TfR was identified by Western Blotting. The stable Tf-USPIO nanometer particles were synthesized by link-coupled method.ConclusionThe TfR neural stem cells line is successfully established,which can synthesize stable Tf-USPIO nanometer particles.

ultra-small superparamagnetic iron oxide; transferrin receptors; lentivirus vector; stem cell; magnetic resonance imaging

10.3969/j.issn.1002-7386.2016.20.001

100700北京市，中國人民解放軍陸軍總醫(yī)院附屬八一腦科醫(yī)院

R 622.3

A

1002-7386(2016)20-3045-04

2016-04-25)

項(xiàng)目來源：國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號(hào)：81271316)