楊志軍　白妙春　張業(yè)森　郭永坤　戴宜武

?

·論著·

Tf-USPIO納米微粒的合成及TfR轉基因神經(jīng)干細胞過表達的研究

楊志軍白妙春張業(yè)森郭永坤戴宜武

目的合成Tf-USPIO納米微粒以及建立穩(wěn)定表達TfR的神經(jīng)干細胞。方法利用慢病毒轉染神經(jīng)干細胞，通過流式細胞儀篩選出穩(wěn)定表達TfR的神經(jīng)干細胞，運用WB檢測其表達水平。將Tf與USPIO進行偶聯(lián)，合成Tf-USPIO納米微粒，通過DLS方法測出USPIO和Tf-USPIO的直徑分別為(36±0.7)nm，(43.5±0.08)nm。結果慢病毒成功的轉染神經(jīng)干細胞，通過流式細胞儀器篩選出穩(wěn)定表達的神經(jīng)干細胞，并用WB證實了TfR的過表達；通過偶聯(lián)的方法合成了穩(wěn)定的Tf-USPIO微粒。結論成功構建了TfR神經(jīng)干細胞系，合成出穩(wěn)定的Tf-USPIO納米微粒。

超小超順磁性氧化鐵；轉鐵蛋白受體；慢病毒載體；干細胞；磁共振成像

研究證實神經(jīng)干細胞移植可改善因神經(jīng)元損傷而出現(xiàn)的臨床癥狀[1]。但到目前為止，未能實現(xiàn)在活體內長期動態(tài)觀察干細胞的遷移和分化，因此需要一種能夠達到長期示蹤目的的干細胞。轉鐵蛋白受體(transferring receptor,TfR)在內皮細胞等大量存在，其主要作用是將細胞外的鐵向細胞內轉移，是鐵代謝的重要過程，其配體轉鐵蛋白(Tf)可透過血腦屏障(BBB)。同時, 研究發(fā)現(xiàn)腦內很多疾病的發(fā)生都和鐵代謝失調有關。TfR報告基因在磁共振(MR)分子成像中受到高度重視和廣泛關注。目前應用較多的 TfR 探針有轉鐵蛋白-單晶體氧化鐵顆粒(Tf-MION)[2]和轉鐵蛋白-超順磁性氧化鐵納米粒(Tf-SPION)[3]兩種,其在體內外均能MR成像。本文利用慢病毒(pLenti6.3-TfR-IRES-EGFP和pLenti6.3-MCS-IRES-EGFP)轉染神經(jīng)干細胞(NSCs)，通過流式細胞篩選出穩(wěn)定表達TfR的神經(jīng)干細胞系，并通過蛋白印記(Western blotting)證明其過表達；利用USPIO和Tf兩者EDC偶聯(lián)的方法，獲得Tf-USPIO螯合物，并通過DLS法測試偶聯(lián)前后的粒子直徑，證明其偶聯(lián)成功。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞和慢病毒載體系統(tǒng)：小鼠胚胎源性NSCs，本實驗室凍存。慢病毒表達載體pLenti6.3-MCS-IRES-EGFP及pLenti6.3-TfR-IRES-EGFP包裝質粒均購自于美國Invitrogen公司。

1.1.2主要試劑：USPIO購自北京萬德高科科技公司；Tf、DMEM/F12、bFGF、EGF、Neurobasal培養(yǎng)基、小鼠抗人轉鐵蛋白受體單克隆抗體、兔抗人轉鐵蛋白受體單克隆抗體等購自Sigma公司；Sulfo-NHS、EDC購自上海延長科技有限公司。

1.2方法

1.2.1小鼠胚胎源性NSCs的傳代培養(yǎng)：①將原代培養(yǎng)細胞懸浮生長至細胞球，體積擴增約4～5倍時，將培養(yǎng)液和懸浮細胞吸入5 ml離心管中，離心機中800 r/min，離心5 min；②棄去培養(yǎng)基后，加入Accuase酶溶液約1 ml，溫箱靜置10～15 min，加入等體積的培養(yǎng)液終止消化；然后用吸管反復輕柔吹打約20～30次，使細胞球變成單個細胞；③再次將消化的細胞懸液移室溫下，轉速1 000 r/min，離心5 min，去掉上清，以培養(yǎng)基重懸細胞，輕柔吹打成單細胞懸液，玻片上大概計數(shù)后，調整細胞密度至1×106個/ml，接種于25 cm2培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板中；置于37℃，5%的CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2小鼠神經(jīng)干細胞的凍存及復蘇：①凍存細胞時將神經(jīng)干細胞按上述方法消化為單細胞懸液后，離心后收集神經(jīng)干細胞，棄去培養(yǎng)液，加入約1 ml神經(jīng)干細胞(90%培養(yǎng)基+10%DMSO)重懸，計數(shù)約1×106個/ml，放入凍存管中，再次加入凍存液，使凍存管中凍存液體積約為1 ml，裝入預先解凍(室溫下)的凍存盒，放入-80℃冰箱中緩慢降溫，24 h后可放入液氮灌中長期保存；②復蘇細胞時將凍存管從液氮中取出，快速轉入37℃水浴中，一邊解凍，一邊振蕩，待細胞快速解凍；然后將細胞轉移到含有2倍體積神經(jīng)干細胞培養(yǎng)液的離心管中，1 000 r/min，離心4 min，棄上清；離心后用培養(yǎng)液重懸細胞，計數(shù)細胞，按1×106cells,5 ml/瓶，接種于25 cm2的培養(yǎng)瓶(一般1個凍存管接種于1個25 cm2的培養(yǎng)瓶)，37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.3TfR基因轉染神經(jīng)干細胞：①將代數(shù)為第6～8代的神經(jīng)干細胞消化吹打為單個細胞后，計數(shù)細胞，以4×105細胞/2 ml接種至12孔培養(yǎng)板中，37℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；②培養(yǎng)4 h后，觀察細胞狀態(tài)，取細胞生長狀態(tài)良好的孔，每孔加入預先解凍含有MOI=10病毒液(TfR組)和MOI=10空載體組(EGFP組)的神經(jīng)干細胞培養(yǎng)液300 μl，再次放回溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)，并設置空白細胞為對照；③12 h后觀察細胞狀態(tài)，半量換液，48 h后再次半量換液。48～72 h后熒光顯微鏡下觀察細胞熒光表達情況，并拍照。

1.2.4細胞流式篩選穩(wěn)定表達TfR的神經(jīng)干細胞系：①細胞加入感染病毒48～72 h后，收集神經(jīng)球、消化輕輕吹打成單個細胞。然后用高壓滅菌的PBS輕洗1次，1 ml滅菌PBS重懸細胞；②用300目的細胞篩過濾細胞，收集濾過的細胞懸液移入2 ml上樣管，送去細胞流式儀分選出含有EGFP的神經(jīng)干細胞；③篩選后的神經(jīng)干細胞在離心機上離心，1 000 r/min,離心4 min，去掉上清；加入含有青霉素-鏈霉素溶液(100×)的神經(jīng)干細胞培養(yǎng)液重懸，接種于培養(yǎng)瓶中，并在熒光顯微鏡下拍片。

1.2.5蛋白印記鑒定TfR細胞：①將5×106個篩選后的神經(jīng)干細胞用1×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液煮沸5～10 min直接裂解，提取總蛋白，設置空載體和空白細胞作為對照組，煮好后可用流水降溫后放入-80℃保存；②按產(chǎn)品說明書配置10%分離膠，5%濃縮膠，各組取15 μl蛋白上樣，初始電壓為100 V，大約半小時后當染料邊緣進入分離膠后，電壓提高到150 V，直至染料遷移至凝膠下端附近；③轉膜前將膜置于甲醇中活化20 s，再放入去離子水中洗滌5 min，最后放入轉膜中浸泡 20 min，使用半干轉移儀在30 V恒壓條件下電轉40 min，將蛋白轉移到PVDF膜上。將轉完蛋白的PVDF膜置于含5%脫脂奶粉的TBST溶液中，搖床上室溫下?lián)u晃孵育2 h；④將一抗兔抗人轉鐵蛋白受體單克隆抗體以1∶1 000稀釋于TBST溶液中，密封袋中4℃過夜。第2天TBST液洗膜10 min/次，洗3次；⑤辣根過氧化物酶標記的二抗,1∶5 000稀釋于含5%脫脂奶粉/TBST溶液中，室溫孵育2 h，TBST液洗膜10 min/次，洗3次；⑥將膜置于平鋪好的保鮮膜上,加入預先以1∶1的比例混合A液和B液，并避光反應5 min；⑦將膜取出后封存在透明薄膜中放入暗盒,開始攝像。

1.2.6Tf-USPIO的合成：在中科院化學所合成。① 將含有8 mg Fe/ml的USPIO約11 mg Fe加入1.91 mg EDC(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl carbodiimide conjugation)及5.42 mg sulf-NHS(N-hydroxysulfos uccinimide sodium salt)，室溫下反應15 min；②采用PD-10交換柱對活化后的USPIO進行緩沖液交換，洗脫液體采用NaHCO3(0.1 mol/L)，然后取其中9 mg 加入3 mg轉鐵蛋白(Tf)在室溫下進行偶聯(lián)反應，4 h后采用PBS緩沖液進行透析；③動態(tài)光散射(dynamic light scattering，DLS)測定,將0.1 mg/ml的Tf-USPIO和USPIO樣品超聲分散10 min，在粒度儀上測定水化半徑位。

2　結果

2.1光鏡下觀察剛消化后的細胞，見細胞呈懸浮狀態(tài)，形態(tài)為圓形，大小均一，邊緣光滑、完整，折光性強。約12 h后部分細胞開始成球，隨時間的增加，細胞球逐漸增大，約3～4 d后細胞球中央成暗黃色，提示細胞需要傳代。見圖1。

2.2在加入慢病毒感染8 h后可見部分細胞開始有綠色熒光出現(xiàn)，且綠色熒光和轉染的效率隨時間逐漸增強，36 h可見神經(jīng)球綠色熒光占據(jù)整個球體。見圖2。

ABC

圖1細胞傳代培養(yǎng)(×10);A為細胞剛消化，B為培養(yǎng)12 h，C為培養(yǎng)3 d

AB

圖2熒光顯微鏡下的慢病毒轉染神經(jīng)干細胞×200;A為轉染8 h，B為轉染36 h

2.3使用細胞流式儀篩選出EGFP陽性細胞傳代培養(yǎng)，經(jīng)5次篩選，最終得到陽性率為98.9%神經(jīng)干細胞,在熒光顯微鏡下可發(fā)現(xiàn)神經(jīng)球呈強綠色熒光，明視野下可見神經(jīng)球生長良好，未轉染的神經(jīng)干細胞都無綠色熒光。見圖3、4。

圖3　流式細胞分選圖

圖4轉染細胞(上)和未轉染細胞(下)熒光顯微鏡下圖片(左側為熒光光源，右側為普通光源，標尺為200 μm)

2.4蛋白印記法鑒定后TfR條帶出現(xiàn)在相對分子量為90 kDa附近，與TfR的理論值相似，轉染TfR細胞組蛋白表達量明顯高于空載體EGFP組和未轉染組，對照組的表達量很低，實驗組細胞TfR的表達水平明顯增加，表明成功建立表達TfR的神經(jīng)干細胞系。見圖5。

圖5　Western blotting 檢測TfR蛋白的表達

2.5DLS是通過測量樣本散射光強度起伏的變化計算出樣品顆粒大小信息，該技術利用激光照射測量樣品顆粒并分析散射光的波動強度(Stokes-Einstein 方程)推導出粒子大小。本實驗經(jīng)統(tǒng)計可得USPIO 的直徑為(36±0.7)nm，而 Tf-USPIO 的直徑為(43.5±0.08)nm。見圖6。

圖6　USPIO和Tf-USPIO動態(tài)光散射圖(DLS)

3　討論

研究神經(jīng)干細胞移植效果，需要對移植細胞在動物體內的遷移、分布、存活及增殖和分化進行監(jiān)測。為了區(qū)分供體和自體細胞，需要一種有效的標記方法標記這些細胞。常見的方法包括：免疫組織化學技術、同位素或者熒光標記、MRI成像技術等[4-6]。MRI成像技術因其可以實現(xiàn)無創(chuàng)、動態(tài)、長期的示蹤，受到越來越多的關注。MRI成像一般先將移植物在體外利用MR增強劑標記后，然后在體外利用磁共振示蹤。常見的MR增強劑包括釓類和氧化鐵。報告基因技術也可以產(chǎn)生順磁性物質或吸收順磁性物質，常見的包括酪氨酸激酶、鐵蛋白、轉鐵蛋白受體等。科學家們已根據(jù)腫瘤過表達TfR，設計出了Tf-SPION磁共振探針，并且成功地在磁共振上顯像。

本文利用轉鐵受體蛋白基因慢病毒轉染神經(jīng)干細胞，通過慢病毒感染細胞，其優(yōu)點是可以轉染任何時期的細胞、容納外源性基因的片段大、長期穩(wěn)定表達等，其他病毒轉染方式包括腺病毒和逆轉錄病毒。它們與慢病毒相比，腺病毒只能瞬時轉染、不能整合到染色體中。逆轉錄病毒只能感染分裂期細胞、容量有限。本文證實轉染后的神經(jīng)干細胞在熒光顯微鏡下為綠色，根據(jù)其EGFP-TfR基因共表達，證明TfR基因已轉入神經(jīng)干細胞，并根據(jù)它們共表達的特性，利用流式篩選的方法篩選出96%以上的穩(wěn)定表達EGFP的神經(jīng)干細胞，并將未表達EGFP的細胞棄去，將表達EGFP的細胞裂解，并通過蛋白印記的方法證實了TfR蛋白的過表達，結合先前的實驗結果證實了TfR在神經(jīng)干細胞中的持續(xù)表達[7]。

磁共振探針一般都具有順磁性，理想的磁共振探針應具備以下條件：對靶體具有高度的特異性和親和力、能夠透過生物屏障如細胞膜、血管內皮甚至是血腦屏障、在機體內不會引起排斥反應、與靶體結合后產(chǎn)物不會對機體有不良反應、能與磁共振信號分子偶聯(lián)?，F(xiàn)研究較多的是納米氧化鐵類，因其直徑小(納米級，一般1～100 nm)、且較穩(wěn)定，特別適合活體磁共振成像。常用的納米氧化鐵顆粒有超順磁性氧化鐵納米微粒(SPION)、超微順磁性氧化鐵(USPIO)、單晶體氧化鐵納米粒子(MION)等[8-10]，它們各有優(yōu)缺點。USPIO直徑約為4～30 nm，也已經(jīng)得到商品化，它的體積較小，半衰期長，很少被肝臟代謝，大部分會分布到全身的淋巴結，是MR造影及功能成像的優(yōu)良新材料，良好的生物相容性，這也是選用USPIO作為轉基因神經(jīng)干細胞探針的重要原因[11]。

DLS是動態(tài)光散射的意思，它是利用激光照射運動顆粒，其散射光強度也產(chǎn)生隨機的波動，并且它的波動頻率與顆粒的大小有關，正是利用這種變化來測量和分析顆粒的大小。它是測量納米顆粒的有效方法，具有以下優(yōu)點：測量速度快、范圍大、樣品量小、不影響原有狀態(tài)，EDC是一種活化COOH的，然后可以和蛋白或者氨基酸反應，但是EDC反應的中間產(chǎn)物往往不穩(wěn)定，最好用sulfo-NHS活化，本部分通過EDC偶聯(lián)的方法將Tf和USPIO聯(lián)合在一起，預先應用PEG包被的USPIO表面含有大量羧基，并且其在血液內較穩(wěn)定，使其極易和Tf發(fā)生反應而形成復合物。DLS實驗顯示USPIO 的直徑為(36±0.7)nm，而 Tf-USPIO 的直徑為(43.5±0.08)nm，顯示偶聯(lián)后的直徑變大，說明一種可能即Tf和USPIO成功偶聯(lián)，從以下幾方面考慮：(1)他們有沒有發(fā)生靜電吸附的條件，即轉鐵蛋白和uspio的表面電荷是否相反；(2)從極性方面考慮，他們之間的親和力也并不強；(3)化學耦聯(lián)效率高，結構穩(wěn)定，在耦聯(lián)反應試劑過量時，幾乎都耦聯(lián)上了。然后，如果是非特異性吸附上的，他們的結合力是很弱的，在細胞實驗過程中很可能就脫離了，不會對特異性攝取有什么貢獻。而在攝取實驗中，特異性攝取那么多，從側面也證明了耦聯(lián)是有效的。

我們成功地利用慢病毒轉染的方法轉染神經(jīng)干細胞，并使細胞過表達TfR，且能傳代下去。利用流式細胞儀篩選了穩(wěn)定表達TfR的神經(jīng)干細胞系，成功的利用EDC藕聯(lián)的方法合成了Tf-USPIO，并證實其在體外具有良好水溶性和穩(wěn)定性，為下一步轉基因干細胞的體外探針成像提供了實驗基礎。

1Takagi Y.History of Neural Stem Cell Research and Its Clinical Application.Neurol Med Chir (Tokyo),2016,56:110-124.

2Moore A,Josephson L,Bhorade B,et al.Human transferrin receptor gene as a marker gene for MR imaging.Radiology,2001,221:244-250.

3Jiang W, Xie H,Ghoorah D,et al.Conjugation of functionalized SPIONs with transferrin for targeting and imaging brain glial tumors in rat model.Plo S one,2012,7:e37376.

4Bhattacharya S,Jackson JD,Das AV,et al.Direct identification and enrichment of retinal stem cells/progenitors by Hoechst dye efflux assay.Invest Ophthalmol Vis Sci,2003,44:2764-2773.

5Ntziachristos V,Ripoll J,Wang LV,et al．Looking and listening to light：the evolution of whole-body photonic imaging．Nat Biotech，2005，23：313-320．

6文明，李少林.磁共振成像用于分子影像學研究.中國醫(yī)學影像技術，2007,23:147-150.

7郭永坤,張業(yè)森,楊志軍,等.hTfR報告基因慢病毒載體的構建及其在神經(jīng)干細胞的表達研究.中華神經(jīng)醫(yī)學雜志,2013,12:433-437.

8Harisinghani MG,Barentsz J,Hahn PF,et al.Noninvasive detection of clinically occult lymph-node metastases in prostate cancer.N Engl J Med,2003,348:2491-2495.

9Yang J,Wadghiri YZ,Hoang DM,et al.Detection of amyloid plaques targeted by USPIO-Aβ1-42 in Alzheimer’s disease transgenic mice using magnetic resonance microimaging.Neuroimage,2011,55:1600-1609.

10Smolensky ED,Park HY,Berquó TS,et al.Surface functionalization of magnetic iron oxide nanoparticles for MRI applications-effect of anchoring group and ligand exchange protocol.Contrast Media Mol Imaging,2011,6:189-199.

11Parsa H,Shamsasenjan K,Movassaghpour A,et al.Effect of Superparamagnetic Iron Oxide Nanoparticles-Labeling on Mouse Embryonic Stem Cells.Cell J,2015,17:221-230.

Study on the synthesis of Tf-USPIO nanometer particle and overexpression of TfR transgenic neural stem cells

YANGZhijun,BAIMiaochun,ZHANGYesen,etal.Bayi

HospitalforEncephalopathyAffiliatedtoPLAArmyGeneralHospital,Beijing100700,China

ObjectiveTo synthesize Tf-USPIO nanometer particle and establish the neural stem cells system that can express transferrin receptors (TfR) stably. MethodsThe neural stem cells were transfected by lentivirus,then the neural stem cells that could express TfR stably were selected out by flow cytometry.The expression levels of TfR were detected by Western Blotting.The TF was coupled with USPIO to synthesize Tf-USPIO nanometer particle,which were measured by DLS method,with the diameters of USPIO and Tf-USPIO being (36±0.7)nm,(43.5±0.08)nm, respectively.ResultsThe neural stem cells were transfected by lentivirus successfully,and the neural stem cells that could express TfR stably were selected out by flow cytometry successfully,moreover, the overexpression of TfR was identified by Western Blotting. The stable Tf-USPIO nanometer particles were synthesized by link-coupled method.ConclusionThe TfR neural stem cells line is successfully established,which can synthesize stable Tf-USPIO nanometer particles.

ultra-small superparamagnetic iron oxide; transferrin receptors; lentivirus vector; stem cell; magnetic resonance imaging

10.3969/j.issn.1002-7386.2016.20.001

100700北京市，中國人民解放軍陸軍總醫(yī)院附屬八一腦科醫(yī)院

R 622.3

A

1002-7386(2016)20-3045-04

2016-04-25)

項目來源：國家自然科學基金項目(編號：81271316)