吳迎春，任傳清，郝 亮，王建偉，聶 峰

(陜西理工大學(xué)化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，陜西漢中 723001)

鼻炎康是人們?nèi)粘Ｉ钪械某Ｓ盟?，主要有效成分有馬來(lái)酸氯苯那敏(Chlorphemanie Maleate，Ch，商品名為撲爾敏)和鹽酸麻黃堿(Ephedrine Hydrochloride,Ep)。對(duì)于鼻炎康中Ch和Ep的分別測(cè)定，報(bào)道的檢測(cè)方法主要有色譜法、化學(xué)發(fā)光法、電分析法、毛細(xì)管電泳-方波極譜法、分光光度法、熒光法[1 - 8]等。對(duì)于鼻炎康復(fù)方制劑中Ch和Ep的同時(shí)測(cè)定，文獻(xiàn)報(bào)道的方法為高效液相色譜法[9,10]。毛細(xì)管電泳(CE)-電致化學(xué)發(fā)光(ECL)分析是一種高分離能力與高靈敏檢測(cè)技術(shù)相結(jié)合的分析方法，該技術(shù)能使復(fù)雜樣品中待測(cè)物的分析變得簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確，因而在藥物分析、食品檢測(cè)、生命科學(xué)研究、臨床醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用[11 - 13]。

本文利用CE-ECL技術(shù)研究了對(duì)鼻炎康片中Ch和Ep的同時(shí)測(cè)定，實(shí)驗(yàn)表明，Ch和Ep都能增強(qiáng)聯(lián)釕吡啶的電致化學(xué)發(fā)光信號(hào)，且發(fā)光時(shí)間基本相同，因此，要實(shí)現(xiàn)鼻炎康復(fù)方制劑中Ch和Ep含量的同時(shí)ECL測(cè)定是很難實(shí)現(xiàn)的。進(jìn)一步研究表明，利用Ch和Ep在毛細(xì)管電泳分離時(shí)保留時(shí)間的差異，可實(shí)現(xiàn)鼻炎康片中Ch和Ep含量的在線分離與檢測(cè)，據(jù)此建立了CE-ECL時(shí)間分辨電致化學(xué)發(fā)光同時(shí)在線檢測(cè)鼻炎康片中Ch和Ep含量的新方法，相關(guān)工作未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道，方法具有快速、簡(jiǎn)便、靈敏等特點(diǎn)。應(yīng)用新方法對(duì)鼻炎康片中的Ch和Ep進(jìn)行分析，可在6 min內(nèi)完成樣品的在線分離與檢測(cè)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

MPI-B型多參數(shù)化學(xué)發(fā)光分析測(cè)試系統(tǒng)(西安邁瑞分析儀器有限公司)，電化學(xué)檢測(cè)采用三電極系統(tǒng)：直徑300 μm鉑盤(pán)電極為工作電極，Ag/AgCl電極為參比電極，鉑電極為輔助電極；未涂層石英毛細(xì)管40 cm×25 μm(河北永年光導(dǎo)纖維廠)；pHS-3C精密酸度計(jì)(上海雷磁)；SB-5200DT超聲波清洗機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司)。

聯(lián)釕吡啶(Aldrich Chemical Co,美國(guó))，馬來(lái)酸氯苯那敏(Ch)、鹽酸麻黃堿(Ep)(中國(guó)藥品生物制品鑒定所714-8501)，NaH2PO4、Na2HPO4、乙腈、甲醇均為分析純(西安化學(xué)試劑總廠)，所用其它試劑均為分析純或優(yōu)級(jí)純，水為超純水并除有機(jī)殘留物，所有試液在進(jìn)入毛細(xì)管前均用0.45 μm乙酸纖維素膜過(guò)濾。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

預(yù)處理好的工作電極放置于正對(duì)毛細(xì)管出口末端處，調(diào)試兩者之間的距離為80～120 μm。每次實(shí)驗(yàn)前和檢測(cè)后，對(duì)工作電極施加-0.5～0 V電壓循環(huán)伏安處理2 min，以除去表面的氧化層，使電極活化。在電動(dòng)進(jìn)樣13 kV×10 s，分離電壓為15 kV，10 mmol/L pH=10.5磷酸鹽緩沖液(添加有10%乙腈和5%甲醇)作為電泳運(yùn)行緩沖液，發(fā)光池中加入適量的5 mmol/L聯(lián)釕吡啶和50 mmol/L pH=8.5的磷酸鹽緩沖液，檢測(cè)電位為1.2 V條件下進(jìn)行分析，計(jì)算機(jī)采集ECL發(fā)光信號(hào)，以相對(duì)峰高定量。

2 結(jié)果與討論

2.1 電泳分離條件的優(yōu)化

2.1.1電泳緩沖液pH值與濃度對(duì)分離的影響分別考察了H3PO4-Na2HPO4、NaH2PO4-Na2HPO4、檸檬酸-檸檬酸鈉、HAc-NaAc等幾種緩沖體系對(duì)馬來(lái)酸氯苯那敏和鹽酸麻黃堿分離檢測(cè)的影響。實(shí)驗(yàn)表明，選用NaH2PO4-Na2HPO4緩沖體系可實(shí)現(xiàn)馬來(lái)酸氯苯那敏和鹽酸麻黃堿的分離，且基線平穩(wěn)、噪聲低、分離時(shí)間較短、峰形對(duì)稱?？疾炝薔aH2PO4-Na2HPO4緩沖體系在pH=6.0～12.0范圍對(duì)Ch和Ep分離的影響。結(jié)果表明，Ch和Ep的遷移時(shí)間隨電泳緩沖液的pH升高而縮短，當(dāng)pH在6.0～10.5范圍內(nèi)時(shí)，ECL強(qiáng)度隨著pH的升高而增強(qiáng)，pH為10.5時(shí)，ECL強(qiáng)度最大，同時(shí)組分遷移時(shí)間短、分離效果好、基線穩(wěn)定。本文選擇pH=10.5的NaH2PO4-Na2HPO4作為電泳緩沖溶液。

2.1.2電泳電壓對(duì)分離的影響考察了電泳電壓在8～20 kV范圍變化時(shí)對(duì)Ch和Ep的ECL強(qiáng)度和遷移時(shí)間的影響。結(jié)果表明，在電泳電壓為8～15 kV時(shí)，隨著分離電壓升高，ECL逐漸增大，但當(dāng)電泳電壓大于16～20 kV時(shí)，ECL強(qiáng)度變化趨于平穩(wěn)?？紤]到電泳電壓增大噪音增加，本文選擇15 kV作為Ch和Ep分離電壓。

2.1.3緩沖液中添加劑對(duì)分離效果的影響在上述優(yōu)化的分離條件下，對(duì)Ch和Ep混合樣進(jìn)行分離，發(fā)現(xiàn)兩組分流出曲線分離度仍不能滿足定量測(cè)定分析要求(圖1a)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，樣品中加入適量的乙腈和甲醇可以明顯改善組分的分離效果，同時(shí)還能增加兩組分的發(fā)光強(qiáng)度?？疾炝瞬煌w積分?jǐn)?shù)的乙腈和甲醇混合加入到樣品中對(duì)組分分離效果的影響。結(jié)果顯示，加入乙腈和甲醇的體積分?jǐn)?shù)增大時(shí)，組分分離度增大，但分析時(shí)間變長(zhǎng)(圖1b)。當(dāng)樣品中加入的乙腈和甲醇體積分?jǐn)?shù)為10%和5%時(shí)，組分分離分析效果最佳(圖1c)。本文選擇10%乙腈和5%甲醇為運(yùn)行緩沖液中的添加劑。

2.2 檢測(cè)條件的優(yōu)化

2.2.1工作電極電位的選擇在1.0～1.30 V(vs.Ag/AgCl)范圍內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，ECL的強(qiáng)度隨著工作電極電位的增加而增加，當(dāng)工作電極電位達(dá)到1.2 V時(shí)，ECL的強(qiáng)度達(dá)到最大值，繼續(xù)增加工作電極電位，ECL強(qiáng)度隨之下降，本文選擇1.2 V為檢測(cè)器工作電極電位。

2.2.2緩沖溶液pH值濃度對(duì)ECL信號(hào)的影響緩沖溶液的pH和濃度是影響分析物ECL強(qiáng)度的重要因素，考察了NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液pH為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0時(shí)對(duì)Ch和Ep ECL強(qiáng)度的影響。結(jié)果表明，選用緩沖溶液pH=8.5時(shí)，ECL信號(hào)強(qiáng)度高，基線平穩(wěn)、分離效果良好。進(jìn)一步考察了檢測(cè)池中加入緩沖溶液的濃度分別為30、40、50、60、70、80 mmol/L時(shí)對(duì)ECL強(qiáng)度的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)緩沖液濃度超過(guò)50 mmol/L時(shí)，ECL強(qiáng)度明顯減弱。本文選擇檢測(cè)池中緩沖溶液的濃度為50 mmol/L。

2.2.4進(jìn)樣電壓和進(jìn)樣時(shí)間對(duì)ECL強(qiáng)度和理論塔板數(shù)的影響考察了進(jìn)樣電壓和進(jìn)樣時(shí)間分別在8、9、10、11、12、13、14、15、16 kV和6、8、10、12、14、16、18 s時(shí)對(duì)Ch和Ep ECL強(qiáng)度和理論塔板數(shù)的影響，結(jié)果表明，進(jìn)樣電壓增高，進(jìn)樣時(shí)間變長(zhǎng)，ECL發(fā)光強(qiáng)度越大，但理論塔板數(shù)變小,進(jìn)樣6 s時(shí)理論塔板數(shù)達(dá)到9 200，進(jìn)樣18 s時(shí)理論塔板數(shù)降至2 850。這是因?yàn)檫M(jìn)樣體積大，在毛細(xì)管內(nèi)形成的樣品帶變寬，導(dǎo)致譜峰擴(kuò)展，從而使柱效能下降?？紤]到ECL強(qiáng)度和理論塔板數(shù)兩個(gè)因素，本文選擇13 k V和10 s為優(yōu)化的進(jìn)樣電壓和時(shí)間。

2.3 線性范圍、精密度與檢測(cè)限

在優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件下，分別對(duì)馬來(lái)酸氯苯那敏和鹽酸麻黃堿的線性范圍、回歸方程，方法相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差、檢出限進(jìn)行了考察。馬來(lái)酸氯苯那敏和鹽酸麻黃堿ECL強(qiáng)度與濃度呈良好的線性關(guān)系，線性方程、線性范圍與檢測(cè)限見(jiàn)表1。

表1 馬來(lái)酸氯苯那敏和鹽酸麻黃堿的線性關(guān)系、線性范圍與檢測(cè)限

對(duì)20 μmol/L馬來(lái)酸氯苯那敏和10 μmol/L鹽酸麻黃堿標(biāo)準(zhǔn)液連續(xù)11次平行測(cè)定，遷移時(shí)間的RSD分別為1.9%和2.2%，ECL強(qiáng)度的RSD分別為3.9%和4.6%。

2.4 樣品測(cè)定

選取3個(gè)不同批次的鼻炎康藥片適量，研細(xì)，混勻，分別準(zhǔn)確稱重于3只小燒杯中，分別加適量水溶解，轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，加水至標(biāo)線(依次標(biāo)記為樣品1、2、3)。測(cè)定前溶液均用0.45 μm乙酸纖維素膜過(guò)濾。按前述實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行樣品測(cè)定，計(jì)算機(jī)采集樣品發(fā)光信號(hào)譜圖,樣品測(cè)定后在其中加入適量Ch和Ep對(duì)照品進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 中馬來(lái)酸氯苯那敏和鹽酸麻黃堿的測(cè)定結(jié)果和加標(biāo)回收率

3 結(jié)論

CE-ECL聯(lián)用技術(shù)已經(jīng)被證明是一種高效、靈敏的分析方法。但要成為一種成熟和常規(guī)的分析手段尚面臨著許多困難。如：由于進(jìn)樣體積非常少，要求靈敏、快速響應(yīng)和高度空間分辨的能力，給檢測(cè)帶來(lái)了挑戰(zhàn)。同時(shí)開(kāi)發(fā)出經(jīng)濟(jì)、更為有效的發(fā)光試劑、降低檢測(cè)器噪聲，提高信噪比和擴(kuò)大CE-ECL技術(shù)的應(yīng)用范圍等方面，尚需做大量的研究。