謝 景，孟 欣，王燕燕，何小飛，鄭 珊

（1.貴陽市護理職業(yè)學院醫(yī)學類基礎部，貴陽 550003；2.貴陽市金陽醫(yī)院，貴陽 550081）

5-氮雜-2’-脫氧胞苷對Molt-4細胞RASSF10基因啟動子甲基化狀態(tài)的影響研究

謝 景1，孟 欣2，王燕燕1，何小飛1，鄭 珊1

（1.貴陽市護理職業(yè)學院醫(yī)學類基礎部，貴陽 550003；2.貴陽市金陽醫(yī)院，貴陽 550081）

目的：Molt-4細胞應用5-氮雜-2’-脫氧胞苷進行處理，并觀察期對Molt-4細胞RASSF10基因啟動子甲基化狀態(tài)的影響。方法：于體外進行Molt-4細胞培養(yǎng)，并采用不同濃度5-氮雜-2’-脫氧胞苷處理。然后采用MTT法檢測性別增殖抑制率，同時采用RT-PCR法檢測RASSF10 mRNA表達情況。采用COBRA檢測RASSF10甲基化水平；Westernblot法檢測RASSF10蛋白表達情況。結果：經檢測發(fā)現(xiàn)，采用一定濃度5-氮雜-2’-脫氧胞苷作用于Molt-4細胞后，細胞增殖抑制率明顯升高；且表現(xiàn)為劑量依賴性和時間性。然對照組Molt-4細胞R中未檢測出RASSF10 mRNA、蛋白表達情況。然經5-氮雜-2’-脫氧胞苷處理后，RASSF10基因出現(xiàn)部分甲基化。結論：臨床應用5-氮雜-2’-脫氧胞苷處理Molt-4細胞，其可經對RASSF10基因去甲基化來恢復RASSF10表達，最終達到抑制Molt-4細胞增殖效果。

5-氮雜-2’-脫氧胞苷；Molt-4細胞；甲基化

DNA甲基化異常是一種表觀遺傳學現(xiàn)象，同時也是細胞癌變過程中的早期及頻發(fā)事件，此外，其還是一個可逆性的生物學過程［1］。因此，臨床可將甲基化特異基因來作為診斷及治療腫瘤疾病的分子標志。并對特異基因實施甲基化處理后可達到治療腫瘤效果。RASSF10為RASSF家族成員，據相關報道稱［2］，RASSF10啟動子甲基化頻繁出現(xiàn)于前列腺癌及甲狀腺癌等腫瘤中。本次為研究5-氮雜-2’-脫氧胞苷對Molt-4細胞RASSF10基因啟動子甲基化狀態(tài)的影響，特進行以下研究。

1 資料與方法

1 一般資料 試劑：5-氮雜-2’-脫氧胞苷由Sigma公司生產；RPMI1640培養(yǎng)基由Hyclone公司提供；RNA提取及RT-PCR試劑盒（TAKARA 公司）?；蚪MDNA提取試劑盒（Qiagen公司）、DNA甲基化試劑盒（Millipore公司）、DNAmarker及引物（上海生工公司）、RASSF10多克隆抗體（Abgent公司）。

1.2 方法 細胞培養(yǎng)：將Molt-4細胞放置于含有10%的胎牛血清RPMI1640培養(yǎng)液中，然后置于溫度37℃、5%CO2孵箱中進行培養(yǎng)。采用倒置顯微鏡對其生長情況進行觀察。

四唑鹽比色法（MTT）：選取對數生長期細胞用于檢測，然后將藥物濃度調整為1×105/mL并對細胞進行處理，接種于96孔板上［3］。然后使用5-氮雜-2’-脫氧胞苷對其進行作用24h、48h、72h后取出，然后于每孔中加入5g/LMTT150ul，并放置于溫度為37℃孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)，時間為4h［4］。然后取出進行離心處理，并取上清液，再加入DMSO150il，震蕩混勻后于酶標儀570nm下進行測定其吸光度（A），并計算細胞增殖抑制率。細胞增殖抑制率（%）=（A對照-A實驗）/A對照×100.0%［5］。

逆轉錄-聚合酶鏈式反應（RT-PCR）：采用5-氮雜-2’-脫氧胞苷作用72h后，Trizol提取總RNA，并使用紫外分光光度計對RNA純度進行檢測［6］。

免疫印跡法（Western blot）：收集經5-氮雜-2’-脫氧胞苷處理72 h后Molt-4細胞的總蛋白，按100ug/孔上樣［7］。10% SDS-PAGE 電泳后轉膜至NC膜上［8］。5%脫脂牛奶封閉1 h，封I抗RASSF10（1∶500）4℃過夜［9］。次日TBST、TBS洗膜。封HRP標記的羊抗兔II抗（1∶2000）45 min，同法洗膜［10］。ECL化學發(fā)光，將膜置于暗盒中，暗室內膠片曝光，沖洗膠片［11］。

亞硫酸氫鈉聯(lián)合限制性內切酶分析法（COBRA）：取對照組、10umol/L經5-氮雜-2’-脫氧胞苷處理72 h后的Molt-4細胞［12］。

1.3 統(tǒng)計學方法 數據采用SPSS20.0軟件統(tǒng)計與分析，采用t、卡方檢驗。結果以P＜0.05表示具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 5-氮雜-2’-脫氧胞苷對Molt-4細胞增殖影響

Molt-4細胞經不同濃度5-氮雜-2’-脫氧胞苷處理后，其增殖抑制率明顯低于藥物處理組（P＜0.05）；且不同濃度組間比較（P＜0.05）。由此而說明5-氮雜-2’-脫氧胞苷對Molt-4細胞增殖有一定抑制作用，且表現(xiàn)為劑量依賴性及時間性。

2.2 5-氮雜-2’-脫氧胞苷對RASSF10 蛋白表達

影響 對照組細胞中并無RASSF10表達；經5-氮雜-2’-脫氧胞苷處理后，各組RASSF10蛋白表達量出現(xiàn)明顯上調，且與5-氮雜-2’-脫氧胞苷濃度有關（P＜0.05）。比較對照組與5-氮雜-2’-脫氧胞苷各濃度組細胞的內參GAPDH表達量（P＞0.05）。見表1。

表1 5-氮雜-2’-脫氧胞苷對RASSF10 蛋白表達影響

2.3 5-氮雜-2’-脫氧胞苷對RASSF10 mRNA表達影響 擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳顯示，RASSF10 mRNA于對照組Molt-4細胞中不表達，但經2.5 μmol/L、5.0 μmol/L、10.0 μmol/L5-氮雜-2’-脫氧胞苷處理后，其重新表達，且其表達強度與5-氮雜-2’-脫氧胞苷濃度呈正比（P＜0.05）。RASSF10相對表達量采用ARASSF10/ AGAPDH表示。如表2。

表2 5-氮雜-2’-脫氧胞苷對RASSF10 mRNA表達影響

2.3 5-氮雜-2’-脫氧胞苷對RASSF10基因啟動子甲基化狀態(tài)影響 經檢測發(fā)現(xiàn)，采用Molt-4細胞被處理前后，其RASSF10基因啟動子區(qū)域甲基化狀態(tài)如圖4。對照組消化的DNA條帶較為明顯，因此而說明對照組存在啟動子甲基化現(xiàn)象。采用PCR擴增后，含有TaqI識別位點可被TaqI消化水解，并出現(xiàn)水解條帶。但經10 μmol/L5-氮雜-2’-脫氧胞苷作用72 h后則可見清晰且未被TaqI消化水解的條帶，消化水解的DNA條帶不明顯；因此而說明啟動子存在甲基化與非甲基化共存的情況，且原有甲基化RASSF10基因啟動子區(qū)域可大部分被去甲基化。

3 討論

本次研究發(fā)現(xiàn)，不同濃度所處理后的Molt-4細胞增殖抑制程度存在明顯差異性，因此說明5-氮雜-2’-脫氧胞苷可有效抑制白血病細胞增殖、生長。本次研究為降低5-氮雜-2’-脫氧胞苷自身對本次研究細胞所產生的毒性作用而導致研究結果受到影響，所以選擇濃度較小的5-氮雜-2’-脫氧胞苷處理Molt-4細胞。對照組Molt-4細胞中RASSF10基因啟動子是被甲基化修飾的，而RASSF10 mRNA、蛋白在Molt-4細胞中不表達。但經采用510 umol/L-氮雜-2’-脫氧胞苷處理后，RASSF10基因啟動子部分發(fā)生去甲基化作用，其RASSF10 mRNA及蛋白重新出現(xiàn)表達。因此而說明抑癌基因RASSF10失表達的主要機制為RASSF10基因啟動子的高度甲基化修飾。5-氮雜-2’-脫氧胞苷主要是通過抑癌基因RASS F10基因發(fā)生去甲基化，最終使得RASSF10重新恢復表達，并發(fā)揮其抗白血病作用。

綜上所述，5-氮雜-2’-脫氧胞苷可降低Molt-4細胞RASSF10基因的甲基化程度，同時可誘導其重新表達，進而有效抑制Molt-4細胞增殖。

［1］ 易斌， 張浩， 周宏， 等. 高糖誘導人腎小球系膜細胞CTGF啟動子去甲基化及基因表達［J］. 細胞與分子免疫學雜志， 2011， 27（7）： 747-750.

［2］ 宋君君， 李穎， 楊澤松， 等. 慢性粒細胞白血病骨髓細胞的SFRP2基因啟動子高甲基化［J］. 第三軍醫(yī)大學學報， 2011， 33（24）： 2583-2586.

［3］ 吳明彩， 蔣明， 李大彩， 等. 5-氮-2'脫氧胞苷對Reh細胞增殖及RUNX3基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)的影響［J］. 皖南醫(yī)學院學報，2011， 30（6）： 436-439.

［4］ 張旻， 肖新強， 梁云生， 等. 甲基化抑制劑5-雜氮胞苷對T淋巴細胞株程序性死亡受體-1基因啟動子區(qū)域甲基化水平及其表達的影響［J］. 中南大學學報（醫(yī)學版）， 2011， 36（12）： 1163-1169.

［5］ 吳川清， 韓高雄， 帥曉明， 等. 5-氮雜-2'-脫氧胞苷對人胃癌SGC-7901細胞株生長及EDNRB基因啟動子異常甲基化的影響［J］.世界華人消化雜志， 2010， 18（36）： 3843-3847.

［6］ 葉靜， 李明華， 張芳婷， 等. 5氮雜脫氧胞苷對鼻咽癌細胞RASSF1A基因甲基化和mRNA表達的影響［J］. 癌變·畸變·突變， 2012，24（3）： 179-182.

［7］ 耿月華， 秦旭， 劉清， 等. 5-Aza-CdR對食管鱗癌甲基化基因的影響［J］. 疾病預防控制通報， 2011， 26（5）： 5-9.

［8］ 毛良勤， 劉穎春， 謝海， 等. 5-Aza-CdR對肝癌細胞DAPK基因甲基化的影響［J］. 中國肝臟病雜志（電子版）， 2012， 4（4）： 1-5.

［9］ 胡曼， 戴立里， 曾維政. 普魯卡因與5′-氮雜-2′-脫氧胞苷對人肝腫瘤細胞株HepG_2中Wif-1基因啟動子甲基化影響的比較研究［J］. 四川大學學報（醫(yī)學版）， 2013， 44（1）： 27-30+41.

［10］ 田筱青， 孫丹鳳， 趙樹靚， 等. EYA4基因在結直腸癌中的甲基化狀態(tài)及其意義［J］. 胃腸病學， 2013， 18（11）： 672-675.

［11］ 鄒惠， 賀湘玲， 黃淑桂， 等. Zebularine對HL-60及K562細胞株WWOX基因甲基化的影響［J］. 湖南師范大學學報（醫(yī)學版）， 2014， 9（3）： 5-9.

［12］ 劉勝姿， 劉英姿， 全梅芳， 等. 5， 7-DMF對MDA-MB-453細胞凋亡和14-3-3σ基因表達的影響［J］. 湖南師范大學學報（醫(yī)學版），2011， 8（4）： 9-12.

5-aza-2'-deoxycytidine Impact on Molt-4 cells RASSF10 gene promoter methylation status

Xie Jing1， Meng Xin2， Wang Yan-yan1， He Xiao-fei1， Zheng Shan1
（1.Guiyang City Career Academy Department of Medicine Basic Nursing ，Guiyang 550003， China； 2.Department of Nnternal Medicine， Jinyang Hospital of Guiyang City， Guiyang 550081， China）

Objective Discussion and Analysis of 5-aza-2’-deoxycytidine impact on Molt-4 cells RASSF10 gene promoter methylation status. Methods Molt-4 cells were cultured in vitro and the use of different concentrations of 5-aza-2’-deoxycytidine treatment. Then using the MTT assay gender proliferation inhibition rate， while using RT-PCR assay RASSF10 mRNA expression. COBRA detection RASSF10 using methylation level； Westernblot RASSF10 protein expression was detected. Results After testing found that the use of certain concentration 5-aza-2’-deoxycytidine acting on the Molt-4 cells，cell proliferation was significantly increased ； and showed a dose-dependent and time-sensitive. However， Molt-4 cells in the control group was not detected in the R RASSF10 mRNA， protein expression. However， by 5-aza-2’-deoxycytidine treatment after， RASSF10 appear partially methylated genes. Conclusion Clinical application of 5-aza-2’-deoxycytidine treated Molt-4 cells， which may be of RASSF10 gene demethylation to restore RASSF10 expression， and ultimately achieve the effect of inhibiting the proliferation of Molt-4 cells.

5-aza-2’-deoxycytidine； Molt-4 cells； Methylation

R256.1

A

1673-016X（2016）01-0008-03

2015-02-02

謝景，E-mail: dftttr@163.com