劉國(guó)杰， 劉建玲， 高麗娜， 劉俊亭*

(1.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)公共基礎(chǔ)學(xué)院化學(xué)教研室，遼寧沈陽(yáng) 110122；2.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院，遼寧沈陽(yáng) 110122 )

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Shimadzu GC-MS-QP2010氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(日本，島津公司)；Rtx-5色譜柱(10 m×0.18 mm×0.2 μm)；pH測(cè)定儀；旋渦混合器；微量進(jìn)樣器；精密電子天平；水浴恒溫器；TDZ4-WS臺(tái)式離心機(jī)。

1.2 儀器條件

柱溫程序：柱初始溫度為60 ℃，保持1 min后以15 ℃/min升至270 ℃，保持8 min；載氣為氦氣(99.999%)，柱前壓為76.5 kPa，不分流，進(jìn)樣1 μL。EI離子源，電子能量為70 eV，質(zhì)量范圍40～900 u，進(jìn)樣口溫度為250 ℃，接口溫度為270 ℃，離子源溫度為200 ℃，檢測(cè)器溫度為200 ℃。GC-MS法分析采用全掃描(Scan)和選擇離子檢測(cè)(SIM)兩種方式分析。亞硝酸衍生化產(chǎn)物用特征離子m/z114、m/z141和m/z169進(jìn)行定性，m/z141進(jìn)行定量；內(nèi)標(biāo)物用特征離子m/z86和m/z99進(jìn)行定性，m/z86進(jìn)行定量。

1.3 實(shí)驗(yàn)過(guò)程

取0.5 mL血漿于試管中，向其中加入1 mL磷酸鹽緩沖溶液(pH=3)，20 μL 1,8-DAN 溶液，密封，渦旋震蕩30 s，于60 ℃水浴中加熱10 min,冷卻后，加入內(nèi)標(biāo)5 μL；緩慢加入0.5 g碳酸銨至上述溶液中，調(diào)pH至8.5，渦旋振蕩30 s，直至CO2完全釋放；向上述溶液中加入2 mL乙酸乙酯萃取，震蕩1 min，3 500 r/min離心5 min；取上清液于N2氣下濃縮至近干，吸取1 μL進(jìn)樣分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 衍生化反應(yīng)機(jī)理

2.2 血漿中衍生化后的色譜圖

2.3 pH值對(duì)前處理的影響

衍生化反應(yīng)過(guò)程中，反應(yīng)液的pH值是影響重氮化的重要因素。實(shí)驗(yàn)中，分別配制成pH=2、2.5、3、4、5、6、7、8的一系列磷酸鹽緩沖溶液進(jìn)行衍生化。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)證實(shí)pH在2～3之間，衍生化產(chǎn)物逐漸增加；pH=3時(shí)，衍生化產(chǎn)物量達(dá)到最大；pH>3時(shí)，衍生化產(chǎn)物迅速減少。因此，反應(yīng)介質(zhì)選擇pH=3的緩沖溶液。

2.4 衍生化溫度優(yōu)化

重氮化反應(yīng)溫度取決于重氮鹽的穩(wěn)定性。本衍生化反應(yīng)中，重氮鹽離子的π鍵與萘環(huán)的π共軛，增加了重氮鹽的穩(wěn)定性，同時(shí)該重氮鹽可以迅速分子內(nèi)縮合成環(huán)，形成穩(wěn)定的衍生化產(chǎn)物。本實(shí)驗(yàn)中分別探索了溫度20 ℃、40 ℃、60 ℃和80 ℃下衍生化反應(yīng)的情況。實(shí)驗(yàn)表明，隨著溫度的升高，該衍生化反應(yīng)效率升高；當(dāng)溫度為60 ℃時(shí)，衍生化產(chǎn)物的響應(yīng)值最高。因此，本實(shí)驗(yàn)的衍生化溫度選擇60 ℃。

2.5 衍生化反應(yīng)時(shí)間影響

本實(shí)驗(yàn)考察了反應(yīng)時(shí)間對(duì)1,8-DAN衍生化反應(yīng)的影響。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知：在0～25 min內(nèi)，5 min后衍生化產(chǎn)物量明顯增加，在10 min后，產(chǎn)量增加的趨勢(shì)減緩，因此，本實(shí)驗(yàn)的衍生化時(shí)間選擇10 min。

2.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢測(cè)限

2.7 精密度和回收率的考察

3 結(jié)論